Efek Kombinasi Ekstrak Aktif Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)dan Doxorubicin Terhadap Sel Kanker Payudara

(1)

(2)

Lampiran 2. Gambar tumbuhan andaliman (Zanthoxylum acanthopodium

(3)

(4)

Lampiran 4. Gambar serbuk simplisia buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

(5)

Lampiran 5. Gambar mikroskopik serbuk simplisia buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

Keterangan: 1. Kelenjar minyak

2. Sel Rambut (rambut penutup)

3. Rambut biasa (rambut penutup)

4. Epidermis

5. Sel Batu

(6)

Lampiran 6. Bagan pembuatan serbuk simplisia dan skrining fitokimia, karakterisasi simplisia buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

-Pemeriksaan mikroskopik (Simplisia) -Pemeriksaan makroskopik

-Penetapan kadar air

-Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol -Penetapan kadar sari yang larut dalam air -Penetapan kadar abu total

-Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam

(7)

Lampiran 7. Bagan pembuatan ekstrak serbuk simplisia buah andaliman secara maserasi bertahap

Dimaserasi dengan n-heksan Diuji aktivitas antikanker

(8)

Lampiran 8. Perhitungan kadar air serbuk simplisia buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

(9)

Lampiran 9. Perhitungan kadar sari larut air simplisia buah andaliman

(Zanthoxylum acanthopodium DC.)

% Kadar sari larut dalam air = x100%

% Rata-rata kadar sari larut dalam air =

(10)

Lampiran 10 . Perhitungan kadar sari larut etanol simplisia buah andaliman

% Kadar sari larut dalam etanol = x100%

3. Kadar sari larut dalam etanol = x 100% 18,46% 20

% Rata-rata kadar sari larut dalam etanol =

19,46% 3

8,88% 9,46%

(11)

Lampiran 11. Perhitungan kadar abu total simplisia buah andaliman

(12)

Lampiran 12. Perhitungan kadar abu tidak larut asam simplisia buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

(13)

Lampiran 13. Perhitungan kadar air ekstrak n-heksana buah andaliman

(14)

Lampiran 14. Perhitungan kadar sari larut air ekstrak n-heksana buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

(15)

Lampiran 15. Perhitungan kadar sari larut etanol ekstrak n-heksana buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

(16)

Lampiran 16. Perhitungan kadar abu total ekstrak n-heksana buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

(17)

Lampiran 17. Perhitungan kadar abu tidak larut asam ekstrak n-heksana buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

(18)

Lampiran 18. Perhitungan kadar air ekstrak etilasetat buah andaliman

(19)

Lampiran 19. Perhitungan kadar sari larut air ekstrak etilasetat buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

(20)

Lampiran 20. Perhitungan kadar sari larut etanol ekstrak etilasetat buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

(21)

Lampiran 21. Perhitungan kadar abu total ekstrak etilasetat buah andaliman

(22)

Lampiran 22. Perhitungan kadar abu tidak larut asam ekstrak etilasetat buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

% Kadar abu tidak larut dalam asam = x100% (g)

sampel berat

(g) abu berat

o.

Berat sampel (g)

Berat abu (g)

.

1,098 0,0009

.

1,068 0,0007

.

1,075 0,0008

1. Kadar abu tidak larut dalam asam = x 100% 0,082% 1,098

0,0009

=

0,0007

=

0,0008

=

(23)

Lampiran 23. Perhitungan kadar air ekstrak etanol buah andaliman

% Kadar air = x100%

% Rata-rata kadar air = 7,4%

3

7,43% 7,46%

(24)

Lampiran 24. Perhitungan kadar sari larut air ekstrak etanol buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

(25)

Lampiran 25. Perhitungan kadar sari larut etanol ekstrak etanol buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

(26)

Lampiran 26. Perhitungan kadar abu total ekstrak etanol buah andaliman

(27)

Lampiran 27. Perhitungan kadar abu tidak larut asam ekstrak etanol buah andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.)

(28)

Lampiran 28. Perhitungan persen sel Hidup pada sel MCF-7

Persentase sel hidup =

(Absorbansiperlakuan−Absorbansikontrolmedia)

(Absorbansikontrolsel−Absorbansikontrolmedia) x 100%

a. Kontrol sel dan kontrol media

Absorbansi

c. Fraksi Etilasetat buah andaliman

(29)

31,25 1.069 0,953 1,013 100,22 88,09 94,71 94,34

d. Ekstrak etanol buah andaliman

(30)

Lampiran 29. Hasil penentuan IC50 sel MCF-7 dengan analisa probit SPSS 17

a. Ekstrak n-heksan buah andaliman pada sel MCF-7

Confidence Limits

Probability

95% Confidence Limits for konsentrasi ekstrak

95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)b

Estimate Lower Bound Upper

Bound Estimate Lower Bound Upper Bound

(31)

.400 126.736 93.9 18

1 66.139

2.10 3

1.9 73

2.220

.450 142.419 107.370 188.606 2.154 2.031 2.276

.500 159.747 121.739 214.999 2.203 2.085 2.332

.550 179.183 137.214 246.543 2.253 2.137 2.392

.600 201.356 154.096 284.919 2.304 2.188 2.455

.650 227.161 172.844 332.567 2.356 2.238 2.522

.700 257.943 194.170 393.257 2.412 2.288 2.595

.750 295.857 219.205 473.254 2.471 2.341 2.675

.800 344.670 249.893 583.968 2.537 2.398 2.766

.850 411.821 289.971 749.084 2.615 2.462 2.875

.900 515.200 348.148 1029.130 2.712 2.542 3.012

.910 543.837 363.670 1111.793 2.735 2.561 3.046

.920 576.754 381.242 1209.375 2.761 2.581 3.083

.930 615.253 401.458 1326.872 2.789 2.604 3.123

.940 661.295 425.205 1471.994 2.820 2.629 3.168

.950 718.027 453.883 1657.433 2.856 2.657 3.219

.960 790.928 489.894 1905.988 2.898 2.690 3.280

.970 890.771 537.878 2264.159 2.950 2.731 3.355

.980 1043.273 608.650 2848.296 3.018 2.784 3.455

.990 1338.352 738.749 094.237 3.127 2.868 3.612

(32)

b. Ekstrak etilasetat pada sel MCF-7

Confidence Limits

Probability

95% Confidence Limits for log (konsentrasi ekstrak)a

Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper Bound

(33)

.990 885.305 684.987 1235.364 2.947 2.836 3.092 a. Logarithm base = 10.

c.

d. Ekstrak etanol buah andaliman pada sel MCF-7

Confidence Limits

Pr obability

(34)

.970 20.191 7.731 34.893 1.305 .888 1.543

980 14.159 4.704 26.336 1.151 .672 1.421

990 8.093 2.142 16.960 .908 .331 1.229 a. Logarithm base = 10.

e. Doxorubicin pada sel MCF-7

Probability

95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)b

Estimate Lower Bound Upper Bound Estimate Lower Bound Upper Bound

(35)

.960 34.187 .004 83.276 1.534 -2.403 1.921

.970 28.767 .001 74.356 1.459 -2.914 1.871

980 22.870 .000 64.312 1.359 -3.597 1.808

990 15.930 .000 51.604 1.202 -4.676 1.713 a. Logarithm base = 10.

Lampiran 30. Perhitungan persen sel Hidup pada sel T47D

Persentase sel hidup = (Absorbansiperlakuan−Absorbansikontrolmedia)

Absorbansi

b. Ekstrak n-heksan buah andaliman

Kadar

c. Ekstrak etilasetat buah andaliman

(36)

62,5 0,625 0,586 0,638 48,787 45,149 50,00 47,97

f. Ekstrak etanol buah andaliman

kadar

(µg/ml) Absorbansi %sel hidup

% sel hidup rata-rata

500 0,628 0,794 0,512 49,062 64,55 38,24 50,62

250 1,028 0,694 0,512 86,38 55,22 324 59,95

125 0,924 0,851 1,848 76,67 69,86 72,04 72,04

(37)

Lampiran 31. Hasil penentuan IC50 sel T47D dengan analisa probit SPSS 17

a. Ekstrak n-heksan buah andaliman pada sel T47D

Pr obability

(38)

.950 348.278 . . 2.542 . .

b. Ekstrak Etilasetat buah andaliman pada sel T47D

Pr obability

(39)

.950 886.150 426.776 9252.010 2.948 2.630 3.966

c. Ekstrak Etanol buah andaliman pada sel T47D

Pr obability

95% Confidence Limits for log(konsentrasi ekstrak)a Bound stimate

(40)

.950 46495.317 11243.767 858116.353 4.667 4.051 5.934

.960 62545.495 14029.227 1352333.604 4.796 4.147 6.131

.970 90058.156 18412.047 2366097.294 4.955 4.265 6.374

.980 146214.769 26418.626 4978904.481 5.165 4.422 6.697

.990 313844.962 46644.447 1.609E7 5.497 4.669 7.207 a. Logarithm base = 10.

Lampiran 32. Bagan pembuatan media DMEM

Dimasukkan kedalam erlenmeyer

Ditambahkan 800 ml aquabidest steril

Dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet

Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N)

Ditambahkan aquabidest steril samapai 1 l

Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan

Ditampung dalam botol steril

Diberi identitas pada botol media

Disimpan pada suhu 2 – 80 C

DMEM 1 2 g 2 g

(41)

Lampiran 33. Bagan pembuatan media kultur lengkap (MK-DMEM)

Dicampur

Diberi identitas pada botol MK-DMEM

Disimpan pada suhu 2 – 80C

Fetal Bovine Serum (FBS) (10%)

Penisili n- Streptomisin

(2%)

Fungizon e (amphotericin

B) (0,5%)

RPM I ad 100%

(42)

Lampiran 34. Bagan pembuatan media MI99

Dimasukkan kedalam erlenmeyer

Ditambahkan 800 ml aquabidest steril

Dihomogenkan dengan menggunakan stirer magnet

Diatur pH 7,2 – 7,4 (HCl 1N atau NaOH 1N)

Ditambahkan aquabidest steril samapai 1 l

Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan

Ditampung dalam botol steril

Diberi identitas pada botol media

Disimpan pada suhu 2 – 80 C

M199 1 2 g 2,2 g

(43)

Lampiran 35. Bagan pembuatan media kultur lengkap (MK-M199)

Dicampur

Diberi identitas pada botol MK-M199

Disimpan pada suhu 2 – 80C

Fungizone (amphotericin B)

(1 %)

M19 9 ad 100

%

Media Kultur Lengkap (MK – Fetal

Bovine Serum (FBS)

(44)

Lampiran 36. Bagan penumbuhan sel MCF-7

Diambil dari freezer

Diambil beberapa tetes

Dimasukkan kedalam konikel yg berisi DMEM

Disentrifuge 600 rpm selama 5 menit

Dibuang supernatan

Ditambahkan 4 ml MK-DMEM

Di resuspensi hingga homogen

Dimasukkan ke dalam flask

Ditambahkan 5 ml MK kedalam setiap flask

Dihomogenkan

Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted

Diberi identitas pada flask

Disimpan dalam inkubator CO2

Sel MCF-7 dalam

Sel

Konikel

(45)

Lampiran 37. Bagan panen sel MCF-7

Dipersiapkan dan dikondisikan

Diamati apakah sel telah konfluen 80%

Dibuang MK dari flask dengan mikropipet

Dicuci sel 2x dengan PBS

Ditambahkan 400 µl trypsine-EDTA 0,25%

Diinkubasi dalam inkubator CO2 selama 5 menit

Ditambahkan 4 ml MK

Di resuspensi dengan mikropipet

Diamati sel dibawah mikroskop inverted

Di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol

Ditransfer sel kedalam tabung konikel Sel MCF-7, alat dan

Panen Sel MCF-7

(46)

Lampiran 38. Bagan penumbuhan sel Vero

Diambil dari freezer

Diambil beberapa tetes

Dimasukkan kedalam konikel yg berisi M199

Disentrifuge 1200 rpm selama 5 menit

Dibuang supernatan

Ditambahkan 4 ml M199

Di resuspensi hingga homogen

Dimasukkan ke dalam flask

Ditambahkan 5 ml MK-M199 kedalam setiap flask

Dihomogenkan

Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted

Diberi identitas pada flask

Disimpan dalam inkubator CO2

Sel Vero dalam

Sel

Konikel

(47)

Lampiran 39. Bagan panen sel Vero

Dipersiapkan dan dikondisikan

Diamati apakah sel telah konfluen 80%

Dibuang MK-199 dari flask dengan mikropipet

Dicuci sel 2x dengan PBS

Ditambahkan 400 µl trypsine-EDTA 0,25%

Diinkubasi dalam inkubator CO2 selama 5 menit

Ditambahkan 4 ml MK-M199

Di resuspensi dengan mikropipet

Diamati sel dibawah mikroskop inverted

Di resuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol

Ditransfer sel kedalam tabung konikel Sel Vero, alat, dan

(48)

Lampiran 40. Bagan penghitungan sel

Diambil 10µl panenan sel

Dipipetkan kedalam hemositometer

Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop Kultur

Jumlah Sel

Kultur

(49)

Lampiran 41. Bagan pembuatan larutan uji

Ditimbang sebanyak 50 mg

Dimasukkan kedalam polytube

Dilarutkan dalam 1000 µl DMSO

Di vortex

Dibuat pengenceran sampai diperoleh konsentrasi 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62,5 µg/ml, dan 31,25 µg/ml

(pengenceran dengan media MK) Ekstrak n

-hexan

Larutan Uji

Ekstrak etanol Ekstrak

(50)

Lampiran 42. Bagan Pengujian Sitotoksik

Ditanam pada microplate 96 sumuran dengan kepadatan 1 x 104

Diinkubasi selama 24 jam (CO2 5%, 37oC)

Dibuang medium

Ditambahkan medium DMEM baru

Ditambahkan larutan uji

Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam

Dicuci dengan PBS

Ditambahkan 100 µl DMEM dan 10 µl MTT (5mg/ml)

Diinkubasi selama 4-6 jam

Ditambahkan SDS (sebagai stopper)

Dibungkus dengan aluminium foil

Dibiarkan selama 1 malam

Sel di shaker selama 10 menit

Dibaca serapan dengan ELISA reader pada λ 595 nm

Dihitung % sel hidup

Dihitung IC50 dengan analisa probit menggunakan

SPSS 17

Lampiran 43. Sel MCF-7 dan sel T47D di bawah mikroskop

Sel

Abs

(51)

Keterangan: a. Sel MCF-7 sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10) b. Sel MCF-7 setelah diberi larutan uji (sel mengalami

perubahan bentuk morfologi) (perbesaran 10 x 10)

Keterangan: a. Sel T47D sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10) b. Sel T47D setelah diberi larutan uji (sel mengalami perubahan bentuk morfologi) (perbesaran 10 x 10)

(52)

Lampiran 44. Microplate -96 sumuran dan kristal formazan

Keterangan: microplate-96 sumuran yang berisi sel dan larutan uji

Keterangan: a. Kristal Formazan (perbesaran 10 x 10) ek

strak

K ontrol

K ontrol 500

250

12

62,5

ek strak

(53)

Lampiran 45. Bagan Pengujian Combinasi Index

Dibuang media dan ganti medium baru

Dicuci dengan PBS

Ditambahkan 100 µl DMEM dan 10 µl MTT

Dihitung CI dengan analisa probit menggunakan SPSS 17

Kombinasi index

Sel

Abs

(54)

EABA y = -0.355x + 105.8 Doxorubicin y = -0.199x + 126.2

r=0.998 r=0.979

IC 50 = 157.18 ug/ml IC50 = 382.9 um Doxorubicin

E

EABA 0 25 50 100 200

0 100 98.54 89.96 78.64 69.17 17 77.75 71.00 73.64 83.26 84.25 34 60.91 63.98 65.11 69.40 71.19 51 47.34 61.29 40.92 52.33 48.51 68 32.63 50.73 31.12 34.51 33.95

perhitungan pada aplikasi tunggal

doxorubicin tunggal y = -0.149x + 100.1 25 50 100 200 17 195.274 177.554 113.003 106.358 34 242.421 234.827 206.032 194.008 51 260.457 397.154 320.578 346.209 68 331.337 462.970 440.188 443.985

y = -0.355x + 105.8 EEADA tunggal 25 50 100 200

17 98.016 90.579 63.486 60.697 34 117.805 114.617 102.532 97.485 51 125.375 182.749 150.609 161.367 68 155.125 210.374 200.811 202.405

COMBINASI INDEX

Doxo

Etil asetat 25 50 100 200

(55)

Lampiran 47. Bagan Pengujian Apoptosis

Diinkubasi selama 24 jam

Dibuang medium

Ditambahkan medium baru

Diinkubasi selama 24 jam

Cuci dengan PBS sekali.

Tambahkan tripsin 250 µl per well, diinkubasikan selama 3 menit (sampai semua sel terlepas)

Ditambahkan 1ml MK, bilas dengan PBS, sentrifugasi 600 rpm selama 5 menit.

Supernatan dibuang, tambahkan 1 ml PBS sentrifugasi pada 2000 rpm selama 3 menit, buang supernatan.

Tambahkananeksin, masukkan ke alat flowcytometri. Sel

(56)

Lampiran 48. Bagan Pengujian Sel Vero

Dibuang medium

Ditambahkan medium M199 baru

Dicuci dengan PBS

Ditambahkan 100 µl M199 dan 10 µl MTT (5mg/ml)

Dihitung IC50 dengan analisa probit menggunakan

SPSS 17 Sel

Abs

(57)

Lampiran 49. Sel Vero di bawah mikroskop

Keterangan: a. Sel Vero sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10 x 10)

(58)

Lampiran 50. Perhitungan persen sel hidup sel Vero

Persentase sel hidup = (Absorbansiperlakuan−Absorbansikontrolmedia)

Absorbansi kontrol sel

Rata-rata absorbansi kontrol sel

Absorbansi kontrol media

Rata-rata absorbansi kontrol media

Absorbansi kontrol sel dikurangi kontrol media

0.479

0.502

0.071

0.065 0.437

0.498 0.063

0.528 0.06

b. Ekstrak etilasetat buah andaliman

Kadar

(µg/ml) Absorbansi Absorbansi rata-rata

% sel hidup rata-rata

31.25 0.474 0.475 0.476 0,475 94

62.5 0.424 0.420 0.421 0.421 82

125.0 0.193 0.184 0.181 0.187 28

250.0 0.093 0.095 0.091 0.094 6

(59)

Lampiran 51. Hasil penentuan IC50 EEABA terhadap sel Vero dengan analisa probit SPSS 17

Probability

95% Confidence Limits for log (konsentrasi ekstrak)b

Estimate Lower Bound Upper Bound

(60)

Lampiran 52. Mikroskop inverted, elisa reader dan inkubator CO2

Keterangan : Elisa reader

Keterangan : Mikroskop inverted

(61)

Keterangan: Flowcytometri