PRINSIP TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

(1)

PRINSIP TEKNOLOGI

DNA REKOMBINAN

DEBBIE S. RETNONINGRUM

SEKOLAH FARMASI

(2)

PUSTAKA

1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular

Biotechnology: Principles and Applications of

Recombinant DNA,hal. 47-89 dan 101-110

2. Groves MJ, 2006, Pharmaceutical

Biotechnology, hal. 44-55

3. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis,

hal. 3-6 dan 8-12; 54-80 dan 87-97

(3)

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

• Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme

berbeda: fenomena umum di alam.

• Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi oleh virus β

menghasilkan toksin yang bertanggung jawab terhadap

gejala difteri.

• Perubahan genetik dalam bakteri ini disebabkan oleh

virus dan merupakan suatu rekayasa genetik dalam

alam.

(4)

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

• Duplikasi fenomena

alam

di

laboratorium

• Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi

genetik ke dalam suatu organisme.

• Manipulasi genetik

E. coli dan Bacillus subtilis (bakteri)

Saccharomyces cerevisiae (ragi)

• Produksi bahan mahal atau tidak mungkin dibuat secara

tradisional.

(5)

CONTOH PRODUK REKOMBINAN

– ANTIBODI REKOMBINAN

– PROTEIN TERAPEUTIK

: insulin, interferon, albumin serum

manusia, hormon pertumbuhan manusia, aktivator plasminogen

jaringan, antithrombin, faktor pembekuan darah, limfokin, faktor

nekrosis tumor, dismutase superoksida, dan gonadotropin

manusia

– VAKSIN

: hepatitis B, herpes, influenza, malaria

(6)

CONTOH PRODUK REKOMBINAN

– PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan penyakit,

resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen

– PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai lemak/minyak,

penghilangan herbisida, pendegradasi pestisida

(7)

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)

• PENYEDIAAN DNA: SISIPAN DAN VEKTOR (Ex: PLASMID)

• LIGASI: PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN VEKTOR

(= VEKTOR REKOMBINAN)

• TRANSFORMASI: TRANSFER INFO GENETIK KE SEL INANG

& PERBANYAKAN DNA

• SELEKSI: SEL YG MENGANDUNG PLASMID/ VEKTOR

REKOMBINAN

• DETEKSI: KEBERADAAN DNA SISIPAN, KEBENARAN DNA

SISIPAN (UKURAN DAN URUTAN NUKLEOTIDA)

(8)

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)

DNA

kromosom

Potong dengan enzim restriksi

DNA

plasmid

ligasi

DNA rekombinan

transformasi sel

transforman

(9)

Kloning

(10)

SUMBER DNA SISIPAN

• TIGA PENDEKATAN:

– KEPUSTAKAAN DNA (DNA LIBRARY): DNA

GENOMIK

– PRODUK PCR

(11)

Kepustakaan genomik

(genomic library)

• Koleksi klon yang jumlahnya cukup mencakup

semua gen dari suatu organisme

• Contoh ukuran genom:

– Bacillus anthracis: 5,1 – 5,2 Megabasa

– Escherichia coli: 4 Megabasa

– Pseudomonas putida: 6,0 – 6,1 Megabasa

– Staphylococcus aureus: 2,9 Megabasa

(12)

KROMOSOM

(13)

PLASMID

• DNA UNTAI GANDA

• BERBENTUK LINGKARAN

• BERSALINAN TINGGI

• BERUKURAN KECIL (MUDAH DIMANIPULASI)

• DAPAT BEREPLIKASI SENDIRI DI DALAM SEL

• DAPAT DISISIPI DNA ASING (DNA SISIPAN)

• ADA DUA GEN MARKER:

(14)

VEKTOR (Plasmid)

• VEKTOR KLONING

HANYA

UNTUK MENDAPATKAN DNA

• VEKTOR EKSPRESI

UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN

(tambahan

(15)

Beberapa contoh vektor kloning

Nama

Tipe

Sel inang

Keterangan

pBR322

Plasmid

E. coli

Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin.

Vektor untuk tujuan umum

pUC8

Plasmid

E. coli

Resistensi terhadap ampisilin, skrining

lac. Vektor untuk tujuan umum

pBluescript

Plasmid

E. coli

Resistensi terhadap ampisilin, skrining

lac.

(16)

PETA PLASMID

(17)

ENZIM RESTRIKSI

• MEMBATASI PERTUMBUHAN VIRUS PADA

INFEKSI VIRUS PADA BAKTERI

• TIPE II: DIGUNAKAN PADA DNA

REKOMBINAN

• MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE

• MENGENALI URUTAN PALINDROM

(18)

DNA (ligase)

5’- NNN

G

_OH _P

AATTC

NNN -3’

3’- NNN

CTTAA

_P _OH

G

NNN -5’

ligase

5’- NNN

GAATTC

NNN -3’

3’- NNN

CTTAAG

NNN -5’

ENZIM RESTRIKSI & LIGASE

DNA (enzim restriksi)

5’- NNN

GAATTC

NNN -3’

3’- NNN

CTTAAG

NNN -5

’

EcoRI

5’- NNN

G

_OH _P

AATTC

NNN -3’

3’- NNN

CTTAA

_{P OH}

G

NNN -5’

• Sisi pengenalan enzim restriksi

• Urutan nukleotida rantai atas =

(19)

CONTOH

ENZIM RESTRIKSI

• EcoRI (Escherichia coli galur R): G

↓AATTC (ujung lancip)

• BamHI (Bacillus amyloliquefaciens): G

↓GATCC (ujung lancip)

• BglII (Bacillus globigii): A

↓GATCT (ujung lancip)

• SalI (Streptomyces albus): G

↓TCGAC (ujung lancip)

• PstI (Providencia stuartii 164): CTGCA

↓

G (ujung lancip)

• HindIII (Haemophilus influenzae): A

↓AGCTT (ujung lancip)

• KpnI (Klebsiella pneumonia): GGTAC

↓C (ujung lancip)

• XbaI (Xanthomonas bradii): T

↓

CTAGA (ujung lancip)

↓CC (ujung tumpul)

(20)

Kloning

Produk

PCR

S. pyogenes M12

_{Gen ska}

Ligasi

pGEMT

rekombinan

SDM

Transformasi

pGEMT/ska

E. coli

XL-Blue

(21)

LIGASI PRODUK PCR KE

pGEM

-

T

Gen ska

A

_A

pGEM-T

+

pGEM-T

REKOMBINAN

ligasi

Transformasi

E. coli JM109

Streptococcus pyogenes

(22)

(23)

Transformasi

• info genetik ditransfer ke sel inang dengan

metode transformasi

• Sel inang dibuat kompeten (siap menerima

“DNA asing”) → modifikasi struktur dinding sel

• Metode transformasi : heat shock/elektroporasi

(24)

Transformasi

Sel kompeten

Seleksi

(25)

SELEKSI BIRU PUTIH

• MENGETAHUI APAKAH DNA SISIPAN SUDAH ADA?

• PADA MCS TERDAPAT GEN lacZ (MENGKODE

GALAKTOSIDASE)

• X-GAL → BIRU

• DNA SISIPAN AKAN MERUSAK GEN lacZ

→

GALAKTOSIDASE TIDAK DIPRODUKSI →

X-GAL TIDAK DIURAIKAN → PUTIH

(26)

Deteksi

keberadaan

DNA

sisipan

• Analisis migrasi

• Analisis restriksi

Elektroforesis gel

• PCR

(27)

ELEKTROFORESIS

GEL

• Gel agarosa atau poliakrilamid

• DNA bermuatan negatif (ada gugus fosfat):

bergerak dari kutub negatif ke kutub positif

• DNA bermigrasi tergantung dari ukurannya:

migrasi DNA ukuran kecil > ukuran besar

• Visualisasi:

(28)

Elektroforesis

(29)

KONFIRMASI

pGEM

-

T REKOMBINAN

Isolasi pGEM-T/ska

(kit Qiaprep, Qiagene)

1 = pGEM-T rekombinan

2 = pGEM-T tanpa DNA sisipan

1 2

Ukuran plasmid tanpa DNA sisipan <

ukuran plasmid dengan DNA sisipan

(30)

1419 pb

517 pb

Isolasi Plasmid Rekombinan

1 2 3

Koloni Putih

Koloni Biru

Elektrogram hasil isolasi plasmid

koloni biru dan putih :

1. Koloni biru

2. Koloni putih

3. Koloni biru

Koloni

Biru

pGEM-T

(3000 bp)

881 pb

DNA sisipan

1 2

Elektrogram hasil restriksi Nde/BamHI

1. Marka pUC19/HinfI

Analisis Restriksi pGEM-T

rekombinan

KONFIRMASI

(31)

HASIL

PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA

DNA SISIPAN

(32)

HASIL SEKUENSING