BIOTEKNOLOGI KELAUTAN
TIKET MASUK PRAKTIKUM ANALISIS DATA DNA
DISUSUN OLEH :
Prima Tegar Anugrah 125080601111024 Kelas I 05
Kelompok 9
Program Studi Ilmu Kelautan
Jurusan Pemanfaatan Sumberdaya Perikanan dan Ilmu Kelautan
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Universitas Brawijaya
Malang
DATABASE GENBANK NCBI (NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION)
National Center for Biotechnology Information, NCBI, adalah organisasi yang bermarkas di Amerika Serikat yang didirikan pada tahun 1988 sebagai sebuah divisi dari National Library of Medicine (NLM) pada National Institutes of Health (NIH). NCBI adalah salah satu sumberdaya publik yang penting untuk database pengurutan DNA dan protein, database ilmu – spesifik kehidupan lainnya, peralatan dan layanan bioinformatic.
Dua dari layanan NCBI yang paling penting adalah pekayanan BLAST berbasis web untuk pencarian urutan homologi, dan Entrez, sebuah sistem berbasis – web untuk mendapatkan muatan database. Entrez membolehkan download informasi pengurutan, referensi literatur dan informasi biologis lainnya yang disimpan pada database NCBI.
Sebagai tambahan, NCBI menyediakan PubMed, sebuah database dari artikel ilmiah, dan Genbank, sebuah database dari urutan DNA. Genbank adalah sumberdaya yang mendalam untuk semua urutan DNA yang tersedia bagi publik secara virtual.
Referensi :
www.entelechon.com/2008/08/ncbi-national-center-for-biotechnology-information/
MEGA (THE MOLECULAR EVALUTIONARY GENETIC ANALYSIS) 5.2
Referensi :
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8019868
GEN YANG DIGUNAKAN UNTUK ANALISIS DNA DI MITOKONDRIA, NUKLEUS, DAN KLOROPLAS :
Virus tetelo / Newcastle disease (ND) adalah virus RNA (ribonucleic acid) beramplop yang memiliki polaritas negatif dengan asam inti berserat tunggal dan tidak bersegmen. Panjang genomenya 15.186 nukleotida serta menyandi enam polipeptida yakni nukleokapsid protein (NP), phospoprotein (P), matrix (M), fusion (F), hemagglutinin – neuraminidase (HN) dan RNA polymerase (L) dengan susunan 3' – NP – P – M – FHN – L – 5'. Adanya kemajuan yang pesat pada teknik kloning cDNA dan analisis sikuen, telah banyak memberikan informasi pada struktur gen dari paramyxovirus. Sikuen dari keenam gen penyandi genome virus tetelo dari berbagai negara sudah banyak dilaporkan, namun sangat terbatas informasi tentang sikuen gen dari isolat asal Indonesia dan kalaupun ada masih terbatas pada gen HN dan F.
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) :
RNA virus tetelo diisolasi dari cairan allantois telur berembryo bertunas yang telah diinokulasikan dengan isolat Bali – 1 / 07 kemudian dilanjutkan dengan reaksi transkripsi balik yakni RNA virus tetelo diubah menjadi cDNA (complementary DN ) menggunakan enzim reverse trancriptase dan campuran 5 jenis primer depan. Reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen NP sepanjang 540 bp digunakan sepasang primer depan dan belakang yakni : 5'ATGAAGCAGCTCATGCGTTT’3 dan 5'AGTCGGTGTCGTTATCTTGG’3. Susunan nukelotida sepasang primer ini dirancang dengan mengacu sikuen nukleotida virus tetelo Lasota (No acession AF 0077761), kondisi PCR dan siklus pada mesin thermocycler sepenuhnya. Produk PCR yang didapat kemudian dicampur dengan 2 μl loading dye 6x kemudian dielektroforesis pada gel agarose 1% selama 25 menit dengan running buffer TAE (Tris Asetic EDTA) 1x, kemudian divisualisasikan dengan larutan ethidium bromide (0.5 mg/ml). Pita sasaran yang didapat kemudian dipotong dan ditimbang untuk selanjutnya dimurnikan. Pemurnian DNA dan reaksi PCR A overhang :
dengan sentrifugasi dengan kecepatan 16 000 x g selama 1 menit setelah cairan yang lolos dari filter dibuang kemudian minicolumn diset kembali 2) Kedalam minicolumn ditambahkan 500 μl membran washing solution, serta disentrifugasi pada kecepatan 16 000 xg selama 5 menit. Akhirnya, DNA yang menempel pada filter dielusi dengan cara memindahkan minicolumn kedalam tabung 1,5 ml kemudian 50 μl nuclease free water dimasukkan kedalam minicolumn diikuti dengan inkubasi selama 1 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 16 000 xg selama 1 menit. DNA dari hasil pemurnian yang didapat sebanyak 50 μl dan 5μl di electrophoresis untuk memastikan pita DNA.
PCR A overhang. Reaksi ini bertujuan untuk menambahkan ujung adenin dilakukan pada mesin thermocyler pada suhu 72oC selama 10 menit dengan komposisi reaksinya adalah sebagai berikut : 2μl 10xPCR Buffer – MgCl2, 2μl 2mMdNTP, 0,6μl 50mM MgCl2 kemudian ditambah 0,1μl Taq DNA Polymerase, dan ditambahkan distilled water (DW) sampai volume total menjadi 5μl terakhir ditambahkan DNA hasil pemurnian sebanyak 1.5μl. Hasil reaksi ini dinamai dengan DNA A+. Kloning. Secara singkat proses pengkloningan terdiri dari dua tahap yakni proses ligasi (ligation) yaitu penempelan DNA ke dalam vektor (plasmid) untuk membuat plasmid rekombinan, dan proses transformasi yaitu proses transfeksi vektor ke dalam sel kompeten.
Ligasi. Fragmen DNA A+ ditempelkan kedalam vektor pT7BlueT (Novagen, Madison, WI). Vektor yang berbentuk sirkuler dilinearkan terlebih dahulu dengan bantuan enzim DNA ligase dan pada saat proses inkubasi DNA akan menempel pada vektor. Proses ini menggunakan DNA ligatian kit (Takara Bio Inc) yang komposisinya terdiri dari : 1μl vektor, 4 μl DNA A+ dan 5 μl enzim ligase. Campuran kemudian diinkubasi pada water cooling dengan suhu 16oC, selama 1 jam.
PCR E coli dan Pembuatan Replika :
Untuk memastikan bahwa proses kloning telah menghasilkan koloni bakteri yang mengandung plasmid rekombinan yang berisi gen sisipan yang tepat maka dipilih delapan koloni bakteri yang berwarna putih. Koloni bakteri berwarna putih ini kemudian masing – masing disubkultur untuk membuat replika (duplikat) pada lempengan agar LB. Setiap selesai mensubkultur satu koloni, ose yang digunakan untuk mensubkultur dicelupkan kedalam PCR mixture yang komposisinya sbb : 2 μl 10 xPCR buffer – MgCl2, 2 μl 2mMdNTP, 0,6μl 50mM MgCl2, 0,1 μl Taq DNA polymerase, masing – masing 1 μl primer depan dan belakang serta 13,3 μl DW sehingga volume total menjadi 20 ml. Tahapan ini dikerjakan satu persatu sampai kedelapan koloni yang dipilih selesai disubkultur dan ose dicelupkan ke PCR mixture. PCR mixture ini kemudian dihomogenkan dan reaksi PCR dengan kondisi PCR sama seperti PCR first round dilakukan pada mesin thermocycler. Setelah itu produk PCR dielektrophoresis dan diwarnai dengan ethidium bromide (konsentrasi akhir 500 μg / L) selama 20 menit. Sementara itu lempengan agar replika kemudian disimpan pada inkubator dengan suhu 37oC overnight (o / n;semalam; 12 – 16 jam).
Perbanyakan dan Purifikasi Plasmid Rekombinan. Klon plasmid rekombinan yang mengandung pita DNA dengan ukuran yang tepat, dipilih dari koloni pada plate agar LB replika, untuk dikultur pada tabung (falcon tube 50 ml) yang berisi 5 ml media LB dan diinkubaskan pada shaker incubator o / n. Kemudian plasmid rekombinan dipurifikasi menggunakan Wizard Plus SV minipreps DNA purification system (Promega KK). Plasmid rekombinan yang didapat diukur konsentrasinya dengan spektrofotometer kemudian disimpan pada -20oC.
Sikuensing dan Analisis Filogenetik :
Untuk sikuensing, dipilih tiga klon plasmid rekombinan, dilabel dengan CEQTM DTCS – Quick Start Kit (Beckmann Coulter Inc Fullerton,CA) sesuai dengan yang direkomendasikan oleh produsen, dan disikuensing dengan CEQ – 2000 XL DNA Analysis system (Beckmann Coulter Inc). Sikuen nukleotida yang diperoleh kemudian dijajarkan dengan sikuens nukelotida gen NP representasi NDV strain virulen dan avirulen yang diakses dari gene Bank dengan program Clustal IW. Analisis filogenetik dilakukan dengan program MEGA 4.
Hasil :
gen F kedua isolat ini berada dalam satu kelompok genotipe VII namun pohon filogenetik yang disusun dengan sikuen nukleotida gen NP menunjukan bahwa isolat ini tidak dalam satu kelompok percabangan dengan Cockatoo / 90, melainkan dalam analisis gen NP isolat Cocckato / 90 satu kelompok dengan isolat vaksin.
Walaupun kelompok genotipe dari virus tetelo ditentukan berdasarkan analisis filogenetik gen F namun seharusnya hasil analisis filogenetik gen selain gen F pun semestinya tetap menempatkan isolat tersebut dalam kelompok genotipe yang sama. Berdasarkan hasil analisis gen NP, isolat Bali – 1 / 07 tetap berada dalam satu kelompok genotipe VII, hal ini memperkuat bahwa isolat Bali – 1 / 07 merupakan isolat virulen yang bukan merupakan revertan dari isolat vaksin.
Referensi :
Adi, Anak Agung Ayu Mirah, I Made Kardena, Nyoman Mantik Astawa, Ketut Santhia Adhy Putra, Yoshihiro Hayashi, Yasunobu Matsumoto. 2011. Kloning, Sikuensing, dan Analisis Filogenetik Gen Nukleokapsid Protein Virus Tetelo Isolat Bali – 1 / 07. Jurnal Veteriner. Vol. 12 No. 3 : 173 – 179.
POHON FILOGENI DENGAN METODE NEIGHOR JOINING (NJ).
Tarsius merupakan primata terkecil di dunia, termasuk satwa nokturnal, memiliki berat badan +150 gram, bola mata besar, dan kepala dapat diputar hingga 180o. Sistematika berdasar morfologi yang didukung vokalisasi, menyatakan bahwa genus Tarsius dibagi menjadi 5 spesies yaitu Tarsius bancanus (Sumatera dan Kalimantan), T. spectrum, T. dianae, T. pumilus, T. sangiriensis, T. pelengensis (Sulawesi), dan T. syrichta (Filipina) T. lariang, T. tumpara dan T. wallacei.
Gen NADH dehydrogenase sub – unit 4L (ND4L) adalah merupakan salah satu gen penyandi NADH dehydrogenase sub – unit 4L, yaitu suatu enzim yang berperan pada proses respirasi sel di dalam mitokondria. Sekuen gen ND4L oleh karena memiliki keragaman di dalam nukleotidanya dapat digunakan sebagai penanda genetik untuk Acipenseriformes dan penanda genetik Microcebus sp.
Isolasi DNA Total
Deoxynucleicacid (DNA) total diekstraksi dari darah dan jaringan. Darah diambil dari pembuluh darah pada pangkal ekor, ditambah larutan EDTA 10% sebagai antikoagulan. Potongan telinga diambil dari Tarsius disimpan dalam media RNA latter (Qiagen) untuk menjaga kerusakan DNA dari nuklease. Isolasi dan purifikasi DNA menggunakan DNA Isolation Kit (Qiagen).
Amplifikasi Gen ND4L dengan PCR
mix (1st BASE) sebanyak 12,5 μl, 100 – 300 ng DNA cetakan, 10 pmol masing – masing primer dan ditambahkan nuclease free water (Microzone) hingga mencapai volume 25 μl.
Amplifikasi DNA dengan PCR pada penelitian ini menggunakan mesin Invinigen (Biotech, Inc). Amplifi – kasi gen ND4L dilakukan dengan kondisi : denaturasi awal selama 5 menit pada suhu 94° C selanjutnya diikuti dengan 94° C selama 30 detik untuk denaturasi, 49° C selama 45 detik untuk penempelan primer (annealing), 72° C selama 45 detik untuk pemanjangan (elongation), amplifikasi dilakukan sebanyak 35 siklus kemudian post elongation 5 menit pada 72° C.
Deoxynucleicacid total hasil isolasi dan Produk PCR dideteksi dengan cara dimigrasikan pada gel agarosa 1,2% yang telah ditambah dengan good view (Microzone), menggunakan bufer 1 x TBE dalam piranti Submarine Electrophoresis (Hoefer, USA). Pengamatan dilakukan dengan UV transluminator (λ = 300 nm). Penanda DNA dengan ukuran 100 pb (1st BASE) digunakan sebagai penunjuk berat molekul.
Analisis Data
Data sekuens gen ND4L dan sekuens DNA yang diperoleh dari data bases internasional pada multiple alignment dengan program Clustal W. Selain berdasarkan sekuen nukleotida, gen ND4L dianalisis berdasarkan urutan asam amino dari basa – basa yang diterjemahkan mengikuti vertebrate mitochondrial translation code yang ada dalam MEGA versi 5. Jarak genetik dianalisis menggunakan metoda Kimura dua parameter dan pohon filogenetik menggunakan metode Neighbor Joining dengan nilai bootstrap 1000 kali ulangan.
Hasil :
memiliki basa yang sama dengan Tarsius asal Kalimantan dan Sulawesi. Nukleotida hasil sekuensing setelah ditranslasikan ke dalam asam amino yang diterjemahkan berdasarkan vertebrate mitochondrial translation code yang ada dalam MEGA versi 5 menunjukkan bahwa perbedaan nukleotida pada situs ke – 169 tersebut merupakan silent mutation, yaitu tidak terjadi perubahan pada susunan asam aminonya.
Dua ratus sembilan puluh tujuh nukleotida penyusun gen ND4L setelah diterjemahkan menjadi asam amino, didapatkan total 99 asam amino. Tidak adanya perbedaan komposisi asam amino pada semua sampel Tarsius, menunjukkan bahwa Tarsius asal Lampung (Sumatera), Kalimantan, dan Sulawesi (Sulawesi Utara dan Sulawesi Tenggara) sangat dekat kekerabatannya. Oleh karena pada tingkat nukleotida hanya ada 1 situs yang berbeda dan tidak adanya perbedaan asam aminonya berarti bahwa sekuen nukleotida dan asam amino ND4L tidak dapat dijadikan sebagai penanda genetik Tarsius dari ke empat daerah tersebut.
Hasil analisis dari semua Tarsius dalam penelitian yang menggunakan metode Kimura dua parameter menunjukkan bahwa jarak genetik paling besar adalah 0,3%, paling kecil 0% dan rata-rata 0,1%. Pohon filogenetik (filogram) pada penelitian ini berdasarkan sekuen nukleotida gen ND4L sebesar 297 nt, menggunakan metode Neighbor Joining dan sebagai pembanding digunakan spesies primata lain yang diambil dari Genbank.
Pohon filogenetik Tarsius sp. berdasarkan sekuens gen ND4L setelah dibandingkan dengan beberapa spesies primata yang lain, terlihat Tarsius berada pada kelompok subordo Strepsirrhini, walaupun sampai saat ini berdasar morfologi Tarsius masih menjadi perdebatan termasuk subordo Strepsirrhini (kelompok primata kecil) atau intermedier (dipertengahan) antara subordo Haplorrhini (kelompok primata besar) dan Strepsirrhini. Hal ini karena Tarsius menunjukkan ciri-ciri di antara keduanya, yaitu nokturnal, mata besar, telinga dapat digerakkan, mempunyai “toilet claw” pada jari kaki kedua dan ketiga, serta mandibula tersusun dari dua tulang seperti yang dimiliki Strepsirrhini dan tidak adanya rhinarium telanjang dan “dental comb”, cermin hidung kering, gigi seri bawah menghadap ke atas, dan plasenta hemochorial yang merupakan ciri dari Haplorrhini.
Referensi :
