ELECTROPHORESIS ELECTROPHORESIS. Yunika Mayangsari, S.Si., M. Biotech 2012

(1)

ELECTROPHORESIS

Department of Food and Agricultural Products Processing Technology Faculty of Agricultural Technology Gadjah Mada University

Jalan Flora No. 1, Sleman, Yogyakarta 55281 Indonesia

Yunika Mayangsari, S.Si., M. Biotech

2012

(2)

Warming up

Elektroforesis

adalah

teknik

pemisahan

molekul

bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya

dalam sebuah medan listrik.

Prinsip kerja :

Sifat partikel bermuatan

Bergerak ke kutub yang berlawanan

dengan muatannya (partikel/ion positif

bergerak ke katoda dan sebaliknya)

Perbedaan muatan dan ukuran partikel

mengakibatkan laju bergerak berbeda

terjadi pemisahan

Na+ + Cl -– cathode anode

(3)

(4)

Jenis elektroforesis

Elektroforesis kertas dan Selulosa

(5)

Elektroforesis Kertas dan

Selulosa Asetat (lanj.)

Prinsip kerja keduanya sama, perbedaan

pada media penyangga

Berperan pada pemisahan protein atas

dasarmobilitasnya pada pH tertentu

Pada titik isoelektriknya, protein tidak akan

bergerak dalam medan listriknya.

(6)

Elektroforesis Kertas dan

Selulosa Asetat (lanj.)

Elektroforesis Kertas, menggunakan kertas

saring sebagai medium penyangga, sesuai untuk

latihan murah ;

kelemahan

: lama (running

semalam) dan pemisahan kurang baik.

Elektroforesis Selulosa Asetat, selulosa asetat

sebagai medium penyangga, keuntungan: elusi

lebih baik, shg pemisahan lebih baik, running lbh

cepat dibanding kertas (1 jam).

(7)

Elektroforesis gel

Matriks berupa polimer berpori

Ukuran pori (konsentrasi materi

polimer) menentukan nilai koefisien

gesekan (f) semakin besar

prosentase gel semakin kecil ukuran

pori

Matriks yang biasa digunakan:

Poliakrilamida

(8)

(9)

Aplikasi

Elektroforesis

Analisis protein (ukuran)

SDS-PAGE

Analisis DNA (ukuran,

(10)

APPLICATION OF

Electrophoresis Gel

Separation of protein

mixture

Separation of glycoprotein

Lipids separation

Nucleic acid (DNA, RNA)

Enzymes mixture

separation

(11)

Analisis protein (SDS-PAGE)

Molekul Protein

• Muatan bervariasi

(12)

Elektroforesis Gel Poliakrilamida

Sodium Dodesil Sulfat (SDS – PAGE)

Digunakan secara luas untuk analisis protein

lebih menguntungkan dibanding kertas dan

selulosa asetat pemisahan lebih baik

Medium penyangga : hasil polimerisasi akrilamida

dan bis-akrilamida, dengan katalis amonium

persulfat (APS) dan tetrametilendiamin (TEMED)

Pada sampel protein, ditambahkan SDS dan

merkaptoetanol untuk merusak struktur 3 dimensi

protein (remember: reduksi ikatan …?)

(13)

Elektroforesis Gel Poliakrilamida

Sodium Dodesil Sulfat (SDS – PAGE)

(lanj.)

Pemisahan

molekul

didasarkan

pada

perbedaan berat molekul.

Konsentrasi akrilamid menentukan ukuran

pori

yang

terbentuk,

makin

rendah

konsentrasi

akrilamid

yang

digunakan,

makin besar ukuran pori gel, gel semakin

lunak dan mudah rapuh.

(14)

Hubungan antara konsentrasi akrilamid dan pori-pori

(sumber : Kurniawati dan Wanandi, 2001)

% Poliakrilamid Ukuran pori (nm)

3 4.4

5 3.6

10 2.6

20 1.8

(15)

SDS (sodium dodesil sulfat)

SDS berfungsi menghilangkan perbedaan muatan dan

perbedaan konformasi diantara protein-protein yang

ada pada sampel, dengan cara memberikan muatan

negatif.

Pemanasan sampel dilakukan untuk tahap denaturasi

protein. (remember biokimia dasar: denaturasi??)

Kompleks SDS-polipeptida berbentuk seperti batang

dan bermuatan negatif, muatan tidak dipengaruhi pH

(kisaran pH 7-10)

Sehingga, migrasi polopetida hanya berdasarkan berat

molekulnya. Makin besar berat molekul, makin

lambat migrasinya dalam gel elfo.

(16)

Sistem Buffer

Buffer digunakan untuk menjaga kestabilan pH

medium pada elfo

Pada umumnya inert, akan tetapi buffer

tertentu, co: borat, dapat membentuk kompleks

dengan medium seperti pati, sehingga tdk tepat

digunakan untuk elfo

Biasanya digunakan konsentrasi 0,05 – 0,10 M

_{semakin besar molaritas , semakin tajam}

zona pemisahan yang dihasilkan, akan tetapi

waktu pemisahan lebih lama

Sodium phosphate buffer has higher ionic

strength than tris-hydrochloride buffer

µ

= ionic strength ; m = molarity of an ion ; c =

the charge carried by the ion

2

1 _m

_c

=

(17)

SDS-PAGE : Sistem Buffer

Diskontinyu

Sistem buffer yang umum digunakan pada

SDS-PAGE adalah sistem buffer Diskontinyu

Sistem ini menggunakan ion buffer sample

(Komposisi dan pH) yang berbeda dalam gel

dengan larutan buffer elektroda.

Keunggulan : pemisahan protein

(18)

Gel elektroforesis

Gel yang digunakan dalam sistem ini terdiri atas gel

penumpuk (Stacking gel) yang berpori besar dan Gel

pemisah (separating gel/ resolving gel) yang berpori

lebih kecil.

Molekul sampel yang melewati gel penumpuk berada di

atas gel pemisah dan sampel diletakkan di atas gel

penumpuk.

Sampel yang tertumpuk (stacked) pada gel penumpuk

(pori besar), setelah dialirkan arus listrik maka

molekul

akan bergerak melewati

pori-pori

gel

pemisah, dan terpisahkan berdasar BM.

(19)

Recipe for Discontinuous SDS PAGE

(example)

Stock solution Stacking gel Gel concentration, % Reservoir buffer, ml

20.0 10.0 5.0 Acrylamide-bisacrylamide

(30:0.8)

2.5 20.0 10.0 5.0

Stacking gel buffer stock 5.5 - - -

-Resolving gel buffer stock - 3.75 3.75 3.75

-Reservoir buffer stock - - - - 100

10% SDS - 0.3 0.3 0.3 -1.5% ammonium persulfate 0.2 1.5 1.5 1.5 -Water 11.3 4.45 14.45 19.45 900 TEMED 0.015 0.015 0.015 0.015

-Stacking gel : 0.0125M Tris-HCl, pH 6.8 Resolving gel : 0.375M Tris-HCl, pH 8.8

Resolving buffer : 0.025M Tris, 0.192M glicine, pH 8.3

(20)

Separating Gel Preparation

Prepared all reagents needed

Mix all except ammonium persulfate and TEMED

Degassed the solution under a vacuum to prevent air bubbles during polymerization

Add ammonium persulfate and TEMED, soon the gel is ready to be polymerized

Before the gel polimerizes, introduce solution into gel sandwich using pipet as soon as

posible

Stop when gel solution reach about 1.5 cm from top of front plate or 0.5 cm below level where teeth of comb will reach

Gently layer about 1 cm of water on top of separating gel solution

Allow gel to polymerize, 30-60 minutes

(21)

Stacking Gel Preparation

Prepare all reagents need for stacking gel

Pour off water covering separating gel

Mix all reagents except ammonium persulfate and TEMED

Degassed the solution under a vacuum to prevent air bubbles during polymerization

Add ammonium persulfate and TEMED, soon the gel is ready to be polymerized

Before the gel polimerizes, pipet stacking gel solution onto separating gel until solution reaches top of front plate

Carefully insert comb into gel sandwhich until bottom of teeth reach top of front plate

(22)

SAMPLE PROTEIN PREPARATION

Sample must be protein isolate

To prepare a sample protein :

Extraction

Determination of protein content Concentrating protein solution

Protein extraction :

Samples may be taken from whole tissue or from cell culture. In most cases,

solid tissues are first broken down mechanically using a blender, homogenizer, or by sonication

A combination of biochemical and mechanical techniques – including various

types of filtration and centrifugation – can be used to separate different cell compartments and organelles

(23)

SAMPLE PROTEIN PREPARATION

Determination of protein content :

Absorbance at 280 nm (absolute method; rapid method)

Bradford (biorad) assay : reaction of bradford reagent (serva

blue G) with protein gives a blue color which can be measured at 595 nm. The standar curve for the assay is bovin serum albumin (BSA)

Lowry assay : reaction of lowry reagent (folin-ciocalteu phenol)

with protein gives a blue color which can be measured at 750 nm. The standar curve for the assay is bovin serum albumin (BSA)

Bicichoninic acid (BCA) assay : reaction of BCA and protein

gives a blue color which can be measure at 562 nm. The standar curve for the assay is bovin serum albumin (BSA)

(24)

SAMPLE PROTEIN PREPARATION

Concentrating sample protein

:

Using trichloro acetic acid (TCA)

Sample and TCA solution is mixed, incubated in ice for 30 minutes.

The prcipitate protein is collected by centrifugation, washing with ethanol-ether (1:1) to remove TCA

Using organic solvent : acetone

Cold acetone is added to sample, mixed, and incubated at -20oC for

10 minutes. The precipitae protein is collected by centrifugation (10.000 x g for 5 minutes)

Polyethylene glycol (PEG) precipitation : solution of 50%

polyethylene glycol

Ultrafiltration

Lyophylization (freeze drying)

(25)

Loading sample

The solution of proteins to be analyzed is mixed with SDS, an anionic detergent which denatures secondary and non– disulfide–linked tertiary structures, and applies a negative charge to each protein in proportion to its mass. Heating the samples to at least 60oC shakes up the molecules, helping SDS to bind

Spin down protein solution for 1 second

Introduce sample solution into well using syring. Be careful to avoid introducing air bubbles as this allow some of sample to be carried to adjacent well

Note :

A tracking dye may be added to the protein to allow the experimenter to track the progress of the protein solution through the gel during the electrophoretic run

Precipitation of protein in sample buffer may be due to denatured protein, too litle SDS, too litle reducing agent, overlay acidic condision, or presence of pottasium which precipitates SDS

(26)

Running a gel

Attached electrode plugs to

proper electrodes

Turn on power supply and set

the voltage to 200 V and tyhe

ampere about 60-110 mA

depend on gel thickness

Turf off power supply

Remove electrode plugs from

electrodes

Carefully remove a spacer

(27)

STAINING

Protein :

Coomassie blue R250 stain : coomassie blue R-250, methanol, glacial acetic

acid

Silver stain : silver nitrate, NaOH, ammonium hydroxide, citric acid,

formaldehyde

Glycoprotein: basic fuchin – sulfite stain

Lipids : sudan black B. Staining is carried out before electrophoresis

Nuclein acid :

RNA with pyronine Y : pyronine Y, lanthanum acetate, acetic acid, methanol Native DNA with methylene green : methylene green, acetate buffer pH 4,1 Denatured DNA with pyronine B

(28)

Staining and destaining a gel

with coomassie blue

Pick up the gel and transfer it into a small container containing coomasie stain solution

Agitate for 5-20 minutes depend upon the gel thickness

Cover container with lid or plastic wrap during staining and destaining

Pour out stain and rinse the gel with water

Add commasie destain and agitate overnight

Rinse the gel with water

(29)

08.01.14 suwedo hadiwiyoto : elektroforesis 29

(30)

(31)

(32)

IDENTIFICATION / INTERPRETATION

Calculate retardation factor (R_f) of sample and standard

If R_f sample and R_f standard is same then it can be assumed sample is same with standard

(33)

Gel Agarosa (Identifikasi

DNA/RNA)

Gel ini tersusun atas agarosa.

Agarosa untuk kualifikasi fragmen-fragmen DNA

dengan rentang ukuran beberapa ratus hingga 20.000

kb.

Agarosa tidak bersifat toksik, kompleks berupa bubuk

yang terdiri dari campuran polimer dengan 2 unit

dasar galaktosa, agarosa dan agaropektin.

(34)

Agarosa dilarutkan dalam cairan buffer mendidih dan

akan membentuk gel pada suhu sekitar 38 derajad C.

Pada konsentrasi 1% w/v gel dalam bufer yang

mengandung air dalam kadar tinggi, struktur seratnya

baik, ukuran porinya besar dan tahan terhadap

gesekan.

Molekul DNA bermuatan negatif di dalam medan

listrik dan molekul DNAbergerak melalui gel pada

kecepatan yang berbeda bergantung pada ukurannya.

(35)

• DNA bermuatan negatif.

+

-Power

DNA

• Jika diletakan pada medan listrik, DNA bergerak ke kutub positif (anode).

• Gel agarose digunakan untuk memperlambat gerakan DNA dan terpisah berdasarkan ukurannya.

Scanning Electron Micrograph of Agarose Gel (1×1 µm)

• Gel agarose berpori-pori, DNA bergerak melewati

(36)

+

-Power

DNA

Seberapa cepat DNA migrasi?

Kekuatan medan listrik, bufer, konsentrasi gel agarose ukuran DNA!

*DNA berukuran kecil bergerak lebih cepat daripada DNA yg panjang elektroforesis memisahkan DNA berdasarkan ukurannya

kecil besar

(37)

(38)

Gel agarose dibuat dengan

mendidihkan serbuk agarose dalam larutan bufer.

Agarose Bufer

(39)

Casting tray

Sisir Gel Power supply

Tangki Gel Tutup

Kabel

(40)

(41)

Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the surface of the casting tray.

(42)

Agarose Larutan bufer

Campur serbuk agarose dan larutan bufer. Use a flask that is

several times larger than the volume of buffer.

(43)

Agarose tidak larut pada suhu kamar (kiri). Larutan itu dididihkan sampai jernih (kanan).

Gently swirl the solution periodically when heating to allow all the grains of agarose to dissolve.

***Be careful when boiling - the agarose solution may become superheated and may boil violently if it has been heated too long in a microwave oven.

(44)

Diamkan larutan agarose mendingin (~60ºC) dan kemudian

tuangkan dalam cetakan. Jangan sampai ada gelembung

udara.

(45)

(46)

Ketika dingin, agarose polimerisasi, membentuk gel yg fleksibel.

Setelah dinging (30-45 minute) gel berwarna agak putih. Hati-hati copot sisir dan selotape.

(47)

(48)

buffer 

Tuangkan bufer sehingga diatas gel +/- 1 mm. Cak setiap

sumuran terisi bufer.

   _Cathode (negative) Anode (positive) wells DNA

(49)

6X Loading Buffer:

• Bromophenol Blue (for color) • Glycerol (for weight)

Preparasi Sample

Campur sample DNA dengan bufer sampel. Ini memudahkan sampel masuk kedalam sumuran, karena adanya gliserol yg memperberat

(50)

Memasukkan sampel ke Gel

Carefully place the pipette tip over a well and gently expel the sample.

The sample should sink into the well. Be careful not to puncture the

gel with the pipette tip.

(51)

Letakkan penutuo, hubungkan dengan kabel, hubungkan dengan power supply. Cek kabel terhubungkan dengan benar - DNA migrasi ke anode (merah). Jika dihidupkan, terbentuk gelembung pada elektrode

(52)

 _wells  _{Bromophenol Blue} Cathode (-) Anode (+) Gel

Setelah dihidupkan, cek bahwa warna bergerak pada arah yg benar. Bromophenol blue bergerak serah dg DNA.

DNA

(-)

(53)

 ₁₀₀  200  ₃₀₀  _1,650  _1,000  ₅₀₀  ₈₅₀  ₆₅₀  400  _{12,000 bp}  _5,000  _2,000

Standar tangga DNA

Inclusion of a DNA ladder (DNAs of know sizes) on the gel makes it easy to determine the sizes of unknown DNAs.

-+ DNA migration bromophenol blue Note: bromophenol blue migrasi = 300 bp DNA

(54)