TESIS
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER PAYUDARA
KOMBINASI EKSTRAK n-HEKSANA DAN ETILASETAT
BUAH ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) DENGAN
DOKSORUBISIN TERHADAP SEL KANKER T47D
SECARA IN VITRO
Oleh:
RATIH ANGGRAENI
NIM 127014005
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER PAYUDARA
KOMBINASI EKSTRAK n-HEKSANA DAN ETILASETAT
BUAH ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) DENGAN
DOKSORUBISIN TERHADAP SEL KANKER T47D
SECARA IN VITRO
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
Oleh:
RATIH ANGGRAENI
NIM 127014005
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
LEMBAR PENGESAHAN TESIS
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER PAYUDARA
KOMBINASI EKSTRAK n-HEKSANA DAN ETILASETAT BUAH ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) DENGAN DOKSORUBISIN
TERHADAP SEL KANKER T47D SECARA IN VITRO
Oleh:
RATIH ANGGRAENI NIM 127014005
Medan, Oktober 2014 Menyetujui:
Komisi Pembimbing, Komisi Penguji,
Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
NIP 195311281983031002 NIP 195301011983031004
Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt. Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
NIP 195006071979031001 NIP 195103261978022001
Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. NIP 195311281983031002
Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt. NIP 195006071979031001
Mengetahui: Disahkan Oleh:
Ketua Program Studi, Dekan,
PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa : Ratih Anggraeni Nomor Induk Mahasiswa : 127014005
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Uji Aktivitas Antikanker Payudara Kombinasi Ekstrak n-Heksana dan Etilasetat Buah Andaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) dengan Doksorubisin terhadap Sel Kanker T47D secara InVitro
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Tim Penguji pada hari Selasa tanggal
dua puluh satu bulan Oktober tahun dua ribu empat belas.
Mengesahkan:
Tim Penguji Tesis
Ketua Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt.
Anggota Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt.
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini:
Nama Mahasiswa : Ratih Anggraeni
Nomor Induk Mahasiswa : 127014005
Program Studi : Magister Farmasi
Judul Tesis : Uji Aktivitas Antikanker Payudara Kombinasi Ekstrak
n-Heksana dan Etilasetat Buah Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC.) dengan
Doksorubisin terhadap Sel Kanker T47D secara In
Vitro
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah hasil karya saya sendiri,
bukan plagiat, dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut plagiat
karena kesalahan saya sendiri, maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh
Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan menuntut
pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dalam keadaan
sehat.
Medan, Oktober 2014 Yang membuat pernyataan,
Ratih Anggraeni
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kehadirat Allah swt. yang telah memberikan nikmat dan
karunia yang berlimpah sehingga penulis dapat menyelesaikan perkuliahan dan
penelitian hingga tersusunnya tesis yang berjudul Uji Aktivitas Antikanker Payudara
Kombinasi Ekstrak n-Heksana dan Etilasetat Buah Andaliman (Zanthoxylum
acanthopodium DC.) dengan Doksorubisin terhadap Sel Kanker T47D secara In
Vitro. Tesis ini diajukan untuk melengkapi salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Pada kesempatan
ini, dengan segala kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Prof. Dr. dr. Syahril Pasaribu, DTMH&H., M.Sc., (CTM)., Sp.A(K)., selaku
Rektor Universitas Sumatera Utara.
2. Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara.
3. Prof. Dr. Karsono, Apt., selaku Ketua Program Studi Magister Farmasi Fakultas
Farmasi Universitas Sumatera Utara.
4. Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., dan Prof. Jansen Silalahi, M.App.Sc.,
Apt., selaku pembimbing yang telah membimbing dan memberikan petunjuk
serta arahan selama penelitian hingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini.
5. Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., dan Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., selaku penguji
yang telah memberikan saran untuk menyempurnakan tesis ini.
6. Dra. Suwarti, M.Si., Apt., selaku Kepala Laboratorium Farmakognosi beserta
7. Prof. dr. Supargiyono, DTM&H., SU., Ph.D., SpParK., selaku Direktur Pusat
Kedokteran Tropis Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada beserta staf.
Penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang
setinggi-tingginya kepada Ayahanda (alm.) Suroso dan Ibunda Agusrina, serta kakak dan
abang ipar, dan teristimewa kepada M. Taufik Alfyan yang tiada henti mendoakan
dan memberikan semangat dan kasih sayang yang tak ternilai dengan apapun.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Cut Masyithah, Denny Satria, Fitri Yanti,
Puji Lestari, Vonna Aulianshah, Mainal Furqan, dan semua pihak yang tidak dapat
disebutkan satu per satu yang telah banyak membantu hingga selesainya tesis ini.
Semoga Allah swt. membalas dengan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan
bantuan yang telah diberikan kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh
karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis mengharapkan kritik dan saran
yang bersifat membangun demi kesempurnaan tesis ini. Akhir kata penulis berharap
semoga tesis ini dapat menjadi kontribusi yang bermanfaat bagi ilmu pengetahuan
khususnya di bidang farmasi.
Medan, Oktober 2014 Penulis,
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER PAYUDARA
KOMBINASI EKSTRAK n-HEKSANA DAN ETILASETAT BUAH ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) DENGAN DOKSORUBISIN TERHADAP SEL KANKER T47D SECARA IN VITRO
Abstrak
Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang menjadi penyebab kematian terbesar di Indonesia pada wanita. Penggunaan agen kemoterapi doksorubisin merupakan salah satu pengobatan kanker payudara. Doksorubisin dapat menyebabkan resistensi
Buah andaliman yang digunakan diperoleh dari Kecamatan Onan Runggu, Kabupaten Samosir, Sumatera Utara. Lalu buah andaliman dibuat menjadi ekstrak melalui maserasi bertingkat menggunakan pelarut n-heksana, etilasetat, dan etanol. Pengujian sitotoksik ENBA dan EEABA secara in vitro (nilai IC50) terhadap sel
T47D dan sel Vero menggunakan metode MTT yang kemudian dianalisis menggunakan SPSS 19 lalu dihitung indeks selektivitasnya. Selanjutnya ENBA dan EEABA dikombinasikan dengan doksorubisin. Kombinasi yang paling aktif dilanjutkan untuk uji penghambatan siklus sel dan apoptosis dengan metode flow
cytometry serta efek penekanan ekspresi protein Bcl-2 dan cox-2 dengan metode
imunositokimia terhadap sel T47D.
sehingga potensi sitotoksik akan berkurang. Terapi kombinasi dengan obat herbal dapat meningkatkan sensitivitas sel kanker payudara dan meminimalkan efek samping doksorubisin. Penelitian sebelumnya telah melakukan uji tentang efek sitotoksik ekstrak etilasetat buah andaliman terhadap sel MCF-7. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui aktivitas antikanker yang dikandung ekstrak n-heksana (ENBA) dan ekstrak etilasetat (EEABA) buah andaliman serta kombinasi ENBA dan EEABA dengan doksorubisin terhadap sel T47D.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa nilai IC50 ENBA dan EEABA sebesar
30,908 µg/mL dan 24,476 µg/mL. Pengujian dengan sel Vero menunjukkan ENBA dan EEABA selektif terhadap sel T47D. Kombinasi optimum ENBA-doksorubisin dan EEABA-doksorubisin sebesar 20 µg/mL – 25 nM (½ IC50 – 1/16 IC50) dan 7,5
µg/mL – 25 nM (2/8 IC50 – 1/16 IC50). Kombinasi ENBA dan EEABA dengan
doksorubisin memiliki aktivitas antikanker terhadap sel T47D melalui penghambatan siklus sel pada fase G0-G1, yaitu sebesar 84,37% dan 80,83% dan apoptosis pada
tahap apoptosis akhir dan nekrosis awal sebesar 69,51% dan 62,94% dikarenakan terjadi penghambatan ekspresi protein Bcl-2 dan cox-2.
ANTICANCER ACTIVITIES OF
n-HEXANE EXTRACT AND ETHYLACETATE EXTRACT OF ANDALIMAN FRUIT (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
IN COMBINATION WITH DOXORUBICIN ON T47D CANCER CELLS IN VITRO
Abstract
Breast cancer is one of cancer variety of the Indonesia's leading cause of death in women. The use of chemotherapeutic agent doxorubicin is one of the breast cancer treatment. Doxorubicin can cause resistance so that the cytotoxic potency will be reduced. Combination therapy with herbal medicines can increase the sensitivity of breast cancer cells and minimize the side effects of doxorubicin. Previous research has tested ethylacetate extract of andaliman fruit’s cytotoxic effect on MCF-7 cells. The purpose of this study to was to determine the anticancer activity of n-hexane extract (ENBA) and ethylacetate extract (EEABA) of andaliman fruit and their combination with doxorubicin on T47D cells.
This study used andaliman fruit from Kecamatan Onan Runggu, Kabupaten Samosir, Sumatera Utara. Extract was made by multilevel maceration with n-hexane, ethylacetate, and ethanol. Cytotoxic effect of EEABA and ENBA was tested in vitro (IC50 values) on the T47D cells and Vero cells used MTT using SPSS 19 and
calculated selectivity index. Then ENBA and EEABA were combined with doxorubicin. The most active combination was eventually tested on the inhibition of cell cycle and apoptosis by flowcytometry method and suppressive effects of Bcl-2 and cox-2 protein expression by immunocytochemistry method on T47D cells.
The result of this study showed that IC50 values ENBA and EEABA at 30.908
µg/mL and 24.476 µg/mL. Selectivity test on Vero cells showed that ENBA and EEABA were selective to ward T47D cells. Optimal combination of ENBA-doxorubicin was 20 µg/mL - 25 nM (½ IC50 – 1/16 IC50) and combination of
EEABA-doxorubicin was 7.5 µg/mL - 25 nM (2/8 IC50 – 1/16 IC50). Combination of ENBA and
EEABA with doxorubicin had anticancer activity to ward T47D cells due to inhibition of cell cycle at G0-G1 phase, amounting to 84.37% and 80.83% and
apoptosis in the late stage of apoptosis and early necrosis of 69.51% and 62.94% caused by inhibition of Bcl-2 and cox-2 protein expression.
DAFTAR ISI
Halaman
JUDUL ... i
LEMBAR PENGESAHAN TESIS ... iii
PENGESAHAN TESIS ... iv
SURAT PERNYATAAN ... v
KATA PENGANTAR ... vi
ABSTRAK ... viii
ABSTRACT ... ix
DAFTAR ISI ... x
DAFTAR TABEL ... xv
DAFTAR GAMBAR ... xvi
DAFTAR LAMPIRAN ... xviii
BAB I PENDAHULUAN ... ... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Perumusan Masalah ... 5
1.3 Hipotesis ... 5
1.4 Tujuan Penelitian ... 6
1.5 Manfaat Penelitian ... 6
1.6 Kerangka Pikir Penelitian ... 7
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 8
2.2 Kanker ... 12
2.2.1 Karsinogenesis ... 15
2.2.2 Kanker payudara ... 17
2.2.2.1 Sel T47D ... 20
2.2.3 Sel Vero ... 21
2.2.4 P-glycoprotein ... 21
2.3 Penanganan Kanker ... 24
2.3.1 Penanganan kanker payudara ... 25
2.3.1.1 Doksorubisin ... 26
2.3.1.2 Terapi kombinasi ... 28
2.4 Tanaman yang Bersifat Antikanker ... 29
2.4.1 Andaliman ... 29
2.4.2 Pengujian sifat antikanker dari berbagai tanaman obat ... 32
2.4.2.1 Metode pemisahan ekstraksi ... 33
2.4.2.2 Metode pengujian aktivitas antikanker ... 34
BAB III METODE PENELITIAN ... 40
3.1 Alat ... 40
3.2 Bahan ... 41
3.3 Penyiapan Bahan Uji ... 42
3.4 Pembuatan Pereaksi ... 43
3.5 Pemeriksaan Karateristik Simplisia dan Ekstrak ... 44
3.5.1 Pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik ... 44
3.5.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol ... 46
3.5.5 Penetapan kadar abu total ... 46
3.5.6 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam ... 47
3.6 Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak ... 47
3.6.1 Pemeriksaan alkaloid ... 47
3.6.2 Pemeriksaan flavonoid ... 48
3.6.3 Pemeriksaan glikosida ... 48
3.6.4 Pemeriksaan saponin ... 49
3.6.5 Pemeriksaan tanin ... 49
3.6.6 Pemeriksaan steroid/triterpenoid ... 49
3.6.7 Pemeriksaan antrakuinon ... 49
3.7 Sterilisasi Alat dan Bahan ... 50
3.8 Pembuatan Media ... 50
3.8.1 Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ... 50
3.8.2 Pembuatan media kultur lengkap (MK-RPMI) ... 50
3.8.3 Pembuatan media M199 ... 51
3.8.4 Pembuatan media MK-M199 ... 52
3.9 Penumbuhan Sel ... 52
3.9.1 Penumbuhan sel kanker payudara (T47D) ... 52
3.9.2 Subkultur sel kanker payudara (T47D) ... 52
3.9.3 Panen sel kanker payudara (T47D) ... 53
3.9.4 Penumbuhan sel Vero ... 53
3.9.7 Penghitungan sel T47D dan sel Vero ... 54
3.10 Pembuatan Larutan Uji ... 55
3.11 Pengujian Sitotoksik ... 56
3.11.1 Pengujian sitotoksik terhadap sel Vero ... 56
3.11.2 Pengujian sitotoksik terhadap sel T47D ... 57
3.11.3 Analisis Hasil ... 57
3.11.4 Indeks Selektivitas ... 58
3.12 Uji Kombinasi Ekstrak Buah Andaliman dengan Doksorubisin terhadap Sel T47D ... 58
3.13 Pengujian Kombinasi Ekstrak Buah Andaliman dengan Doksorubisin terhadap Apoptosis dan Siklus Sel Sel T47D ... ... 60
3.14 Pengujian Kombinasi Ekstrak Buah Andaliman dengan Doksorubisin dalam Penghambatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Cox-2 terhadap Sel T47D ... 61
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 63
4.1 Identifikasi Tumbuhan ... 63
4.2 Karakteristik Simplisia dan Ekstrak ... 63
4.3 Hasil Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak ... 67
4.4 Efek Sitotoksik ENBA dan EEABA terhadap Sel Vero dan Sel T47D ... 69
4.4.1 Efek sitotoksik terhadap sel Vero ... 69
4.4.2 Efek sitotoksik terhadap sel T47D ... 69
4.4.3 Pengaruh Selektivitas ENBA dan EEABA terhadap Sel Vero dan Sel T47D ... 70
4.5 Hasil Pengujian Kombinasi ENBA dan EEABA dengan Doksorubisin terhadap Sel T47D ... 71
4.7 Pengaruh Kombinasi ENBA dan EEABA dengan
Doksorubisin terhadap Siklus Sel T47D ... 78
4.8 Pengaruh Kombinasi ENBA dan EEABA dengan Doksorubisin dalam Penghambatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Cox-2 terhadap Sel T47D ... 81
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 87
5.1 Kesimpulan ... 87
5.2 Saran ... 88
DAFTAR PUSTAKA ... 89
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 2.1 Beberapa tumbuhan yang berpotensi sebagai antikanker ... 30
Tabel 2.2 Interpretasi nilai CI (Combination Index) ... 36
Tabel 4.1 Hasil karakteristik simplisia dan ekstrak buah andaliman .... 66
Tabel 4.2 Hasil skrining fitokimia simplisia dan ekstrak buah
andaliman ... 68
Tabel 4.3 Nilai indeks selektivitas (IS) ENBA dan EEABA ... 71
Tabel 4.4 Nilai indeks kombinasi ENBA-doksorubisin dan
EEABA-doksorubisin ... 72
Tabel 4.5 Pengaruh tunggal ENBA, tunggal EEABA, tunggal doksorubisin, kombinasi ENBA-doksorubisin dan
EEABA-doksorubisin terhadap apoptosis sel T47D ... 76
Tabel 4.6 Pengaruh kombinasi ENBA-doksorubisin dan
EEABA-doksorubisin terhadap siklus sel T47D ... 79
Tabel 4.7 Hasil pengujian penghambatan ekspresi protein Bcl-2 ... 81
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian ... 7
Gambar 2.1 Mekanisme pemompaan oleh Pgp ... 23
Gambar 2.2 Struktur kimia doksorubisin ... 27
Gambar 2.3 Reduksi MTT menjadi formazan ... 35
Gambar 2.4 Skema alat flow cytometer ... 37
Gambar 3.1 Hemositometer ... 55
Gambar 4.1 Buah andaliman segar ... 63
Gambar 4.2 Simplisia buah andaliman ... 64
Gambar 4.3 Gambar mikroskopik simplisia buah andaliman ... 65
Gambar 4.4 Korelasi antara konsentrasi larutan uji dengan efek toksik yang ditimbulkan terhadap sel T47D ... 69
Gambar 4.5 Apoptosis sel T47D kontrol ... 74
Gambar 4.6 Apoptosis sel T47D tunggal ENBA ... 74
Gambar 4.7 Apoptosis sel T47D tunggal EEABA ... 74
Gambar 4.8 Apoptosis sel T47D tunggal doksorubisin ... 75
Gambar 4.9 Apoptosis sel T47D kombinasi ENBA-doksorubisin ... 75
Gambar 4.10 Apoptosis sel T47D kombinasi EEABA-doksorubisin ... 75
Gambar 4.11 Persentase jumlah sel yang diberi perlakuan tunggal ENBA, tunggal EEABA, tunggal doksorubisin, kombinasi ENBA-doksorubisin dan EEABA-doksorubisin terhadap apoptosis sel T47D ... 76
Gambar 4.14 Siklus sel T47D kombinasi EEABA-doksorubisin ... 79
Gambar 4.15 Ekspresi protein Bcl-2 dengan berbagai perlakuan ... 82
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Surat hasil identifikasi tumbuhan andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC.) ... 101
Lampiran 2. Perhitungan karakterisasi simplisia, ekstrak n-heksana (ENBA), ekstrak etilasetat (EEABA), dan ekstrak
etanol (EEBA) buah andaliman ... 102
Lampiran 3. Perhitungan persen sel hidup sel T47D ... 105
Lampiran 4. Gambar alat ... 106
Lampiran 5. Hasil penentuan IC50 ENBA pada sel Vero dengan
analisa probit SPSS 19 ... 107
Lampiran 6. Hasil penentuan IC50 EEABA pada sel Vero dengan
analisa probit SPSS 19 ... 108
Lampiran 7. Hasil penentuan IC50 ENBA pada sel T47D dengan
analisa probit SPSS 19 ... 109
Lampiran 8. Hasil penentuan IC50 EEABA pada sel T47D dengan
analisa probit SPSS 19 ... 110
Lampiran 9. Indeks Kombinasi (IK) ENBA-doksorubisin pada
sel T47D ... 111
Lampiran 10. Indeks Kombinasi (IK) EEABA-doksorubisin pada
