BAB III METODE PENELITIAN 1. B a h a n A m o k s i s i l i n t r i h i d r a t A m p i s i l i n t r ih id ra t K l o k s a s i l i n N a t r i u m F l u k l o k s a s i l i n N a t r i u m D i k l o k s a s i l i n N a t r i u m n - O k t a n o l p.a E t e r p .a M e t a n o l p.a N a t r i u m d i h i d r o g e n fosfat D i n a t r i u m h id ro g e n fosfat H i d r o k s i l a m i n h i d r o k l o r i d N a t r i u m h i d r o k s i d a A s a m h i d r o k l o r i d F e r r i k l o r i d a K a l i u m kupri t artrat Air s u l i n g (P.T. Sa nd o z B i o c h e m i e F a r m a I n d o n e s i a ) (P.T. M e d i f a r m a L a b o r a t o r i e s I n c . ) (P.T. M e i j i I n d o n e s i a n P h a r m a c e u t i c a l I nd u s t r i e s ) (P.T. Smith K l i n e B e e c h a m P h a r m a c e u t i c a l s ) (P h a r m a c h i m ) (E .M e r c k ) (E. Me rc It) (E.M er ck ) p.a (E.Mer ck ) p . a (E.Mer ck )
2. A la t H e r a c a a n a l i t i s S a r t o r i u s 2472 S p e c t r o p h o t o m e t e r H i t a c h i dual w a v e l e n g t h d o u b l e beam type 557 P e r a l a t a n p e n e n t u a n t i t i k leleh ( E l e c t r o t h e r m a l ) B e j a n a k r o m a t o g r a f i , L e m p e n g k r o m a t o g r a f i s i l i k a gel 60 GF 254 (E.Me rc k) L a mp u UV T op c o n PUV-1 A l a t - a l a t g elas pH m e t e r F i s h e r A cc u m e t m o d e l 230 A 3. M e t o d e P e n e l i t i a n 3.1. A n a l i s i s k u a l i t a t i f t e r h a d a p b a h a n p e n e l i t i a n 3.1.1. P e m e r i k s a a n o r g a n o l e p t i s
M e l i p u t i p e m e r i k s a a n bentuk, warna, ban dan rasa.
3.1.2. A n a l i s i s r e a k s i w a r n a U n t u k m e n e n t u k a n a d a ny a turunan p e n i s i l i n d a p a t d i lakukan a n a l i s i s reaksi w a r n a s e b a ga i b e r i k u t (32): a. D i l a r u t k a n 5,0 mg sat d a l a m 3,0 ml air, d i t a m b a h 0 , 1 g h i d r o k s i l a m i n h i d r o k lo ri d, 1 , 0 ml n a t r i u m h i d r o k s i d a (80 g/1) dan d i b i a r k a n s e l a m a 5 me- nit. K e m u d i a n d i t a m b a h k a n 1,3 ml asam h i d r o k l o rid (70 g/1) dan 10 tetes ferri klorid (25 g/1). b. D i l a r u t k a n 10 mg zat d a l a m 1,0 ml air dan
kupri t a r tr at dan 6 , 0 ml air.
c. D i l a r u t k a n 5 mg zat d a l a m 1,0 ml air dan d i t a m b a h k a n 1- 2 tetes ferri klorid (25 g /1).
U n t u k m e m b e d a k a n m a s i n g - m a s i n g t urunan penisilin, s e l a n j u t n y a d i l a k u k a n p e n e n t u a n t i t i k lebur m a s i n g - m a s i n g b a h a n .
3.1.3. P e n e n t u a n t i t i k l ebur
S e d ik it b ahan d i g e r u s halus k em ud i a n d i m a s u k k a n ke d a l a m p i p a k a p il er yang salah satu u j u n g n y a tertutup, s e l a n j u t n y a pi pa k a p i le r d i m a s u k k a n ke d a l a m alat p e n e n t u a n t i ti k lebur ( E l e c t r o t h e r m a l ) dan d i a m a t i suhu d i m a n a b a h a n te rs e b u t m u la i m e l e b u r satnpai s e mu a bahan melebur.
3.2. P e n e n t u a n n i l a i log P d a l a n s i s t e m o k t a n o l - d a p a r f osf a t pH 7,4 ( 1 0 , 1 2 , 1 3 ) 3.2.1. P e m b u a t a n l arutan d a p a r f o s f a t pH 7,4 D i t i m b a n g n a t r i u m d i h i d r o g e n fosfat (N a H2P 04.2HZ0 ) s e b a n y a k 0 , 2 1 gram, k em u d i a n d i t a m b a h air s u l i n g sam pa i larut. D i t i m b a n g d i n a t r i u m hi drogen fosfat (N a zH P 04.12H20 ) s e b a n y a k 1,91 gram, k e m u d i a n d i t a m b a h air s u l i n g sam pa i l a r u t . 1 K e d u a larutan t er s e b u t d ic am p ur , d i t a m b a h air s u li ng s a m pa i 100 ml.
D i u j i pH d e n ga n pH meter. 3.2.2. P e m b u a t a n la r u t a n d a p a r f o s f a t pH 7,4 j e n u h .n- o k t a n o l ' Ke d a l a m c o r o n g p i s a h d i m a s u k k a n 100 ml d ap ar f osfa t pH 7,4 la.lu d i m a s u k k a n p u l a o kt a n o l s e b a n y a k 100 ml ke dalamnya. D i g o j o g s e l a m a 15 menit. C a m p u r a n d i d i a m k a n s e l a m a 24 jam. K e m u d i a n lapisan n - o k t a n o l dan d a p a r fos fa t pH 7,4 di pi s a h k a n . 3.2.3. P e m b u a t a n l a r u t a n b a k u turu n a n p e n i s i l i n D i b u a t larutan baku u n t u k t i a p - t i a p tu ru na n p e n i s i l i n ya ng d i g u n a k a n d a l a m p e n e l i t i a n yaitu larutan baku d a l a m d a p a r fosf at pH 7,4 j e n u h n o k t n n o 1 . T i a p - t i a p tu ru n a n p e n i s i l i n y a ng d i g u n a k a n d a l a m p e n e l i t i a n ini d i p e r l a k u k a n se ba g a i berikut: D i t i m b a n g d e n g a n s e k s a m a m a s i n g - m a s i n g tur un an p e n i s i l i n s e b a n y a k 50 mg , dan d i l a r u t k a n d e n g a n m e n g g u n a k a n p e l a r u t d a p a r fosfa t pH 7,4 j e n u h n- o k t a n o l sampa i 50 ml. K e m u d i a n d i e n c e r k a n d e n g a n p e l a r u t d a p a r fosf at pH 7,4 j e n u h n - o k t a n o l sa mp a i d i p e r o l e h k adar larutan baku m a s i n g - m a s i n g d e n g a n r e n t a n g a n t a r a 100 s a m p a i d e n g a n 500 Mg/ml
3.2.4. P e n e n t u a n p a n j a n g g e l o m b a n g m a k s i m u m P e n e n t u a n p a n j a n g g e l o m b a n g m a k s i m u m d i l a k u k a n d e n g a n m e n g a m a t i n i l a i s e r a pa n t i a p - t i a p larutan baku tu ru na n p e n i s i l i n d a l a m p e l a r u t d a p a r fosfat pH 7,4 j e n u h n - o k t a n o l p a d a p a n j a n g g e l o m b a n g 200- 380 nm. 3.2.5. P e m b u a t a n k u r v a baku t u r u n a n p e n i s i l i n
D i a m a t i s e r ap an m a s i n g - m a s i n g larutan baku tur un a n p e n i s i l i n p a d a p a n j a n g g e l o m b a n g m aksimum. Dari h asil p e n g a m a t a n d i b u a t k u r v a dan p e r s a m a a n g a ri s r e g r e s i y a n g m e n y a t a k a n h u b u n g a n k adar larutan ba ku t i a p - t i a p t ur u n a n p e n i s i l i n d e n g a n s e r a p a n pada p a n j a n g g e l o m b a n g maksimum. U n t u k b l a n g k o d i g u n a k a n larutan d a p a r fosf at pH 7,4 j e n u h n -o ktanol. 3.2.6. P e n e n t u a n l o g a r i t m a k o e f i s i e n p a r t i s i t u r u n a n p e n i s i l i n D i t i m b a n g d e n g a n s e k s a m a m a s i n g - m a s i n g 50 mg t u r u n a n peni si li n, k em ud i an m a s i n g - m a s i n g d i p e r l a - k ukan s e b a g a i b e r i k u t : Zat d i l a r u t k a n d e n g a n d a p a r fosf at pH 7,4 j e n u h n- o k t a n o l s a m p a i 100 ml. Dipipet, 10 ml m a s u k k a n d a l a m labu ukur, d i e n c e r k a n d e n g a n larutan d a p a r fosfat pH 7,4 j e n u h n - o k t a n o l s a m p a i 25 ml, sehingga.
d i p e r o l e h larutan t urunan p e n i s i l i n d e n g a n k o n s e n t rasi 200jjg/ml. K e m u d i a n d i p i p e t 20 ml, d i m a s u k k a n ke d a l a m c o r o n g pisah. D i t a m b a h k a n j u g a ke d a l a m c o r o n g p i s a h t e r s e b u t n - o k t a n o l j e n u h d a p a r fosfat pH 7,4 sebartyak 20 ml. D i g o j o g s e l a m a 15 me nit k em ud ia n d i d i a m k a n s el a m a 24 jam. Fa se n - o k t a n o l dan d a p a r fosf at pH 7,4 d ip i s a h k a n . Ser ap an fasa air (dapar fos fa t pH 7,4) d i a m a t i p a d a p a n j a n g g e l o m b a n g maksimum. U n t u k b l a n g k o d i g u n a k a n larutan d a p a r fosf at pH 7,4 j e n u h n-o kt an ol .
P e r c o b a a n d i l a k u k a n d e n g a n r e p l i k a s i 5 kali. C Q = kadar sa mp e l d a l a m f a sa n - o k t a n o l
C M = kadar s a m p e l d a l a m fasa air K o e f i s i e n p a r t i s i (P) =
Cw
3.3. P e n e n t u a n n i l a i (12)
3.3.1. P e m b u a t a n l a r u t a n i m p r e g n a s i a tau p e l a p i s (36)
3 ml n - o k t a n o l j e n u h d apar fosfat pH 7,4 d i t a m b a h eter s a m pa i 100 ml, ke mu di an d i a d u k sam pa i homogen.
3.3.2. I m p r e g n a s i l e m p e n g k r o m a t o g r a f i
L e m p e n g k r o m a t o g r a f i d i m a s u k k a n ke d a l a m b e j a n a k r o m a t o g r a f i y a n g s u d a h j e n u h d e n g a n l arutan im- p r e g n a s i yaitu larutan 3% n - o k t a n o l j e n u h d ap ar fosfat pH 7,4 d a l a m eter. D i d i a m k a n s e l a m a 24 jam, k e m u d i a n d i a n g k a t da n di k e r i n g k a n .
3.3.3. Penenttian nilai. Rjf turu n a n p e n i s i l i n Fase d i a m y a n g d i p a k a i y a i tu 3% n - o k t a n o l j en uh d a p a r d a l a m eter y an g d i l a p i s k a n p a d a lem pe ng k r o m a t o g r a f i d ar i s il i k a gel 60 GF 254. B e j a n a k r o m a t o g r a f i d i j e n u h k a n d e n g a n fase gerak. U n t u k fase g e r a k d i g u n a k a n c am pu ra n m e t a n o l - d a p a r fosfat pH 7,4 d e n g a n lima m acam k o n s e n t r a s i me ta n o l yaitu 30% v/v, 35% v/v, 40% v/v, 45% v/v, dan 50% v/v. M a s i n g - m a s i n g tu ru na n p e n i s i l i n d i l a r u t k a n d a l a m m e t a n o l lalu d i t o t o l k a n p ad a le mp en g kromatograf.i . L e m p e n g k r o m a t o g r a f i t e r s e b u t k e m u d i a n d i m a s u k k a n d a l a m b e j a n a k r o m a t o g r a f i y a n g s u da h j e n u h d e n g a n fase gerak. D i d i a m k a n sam pa i eluen n a i k ± 15 cm lalu d i k e r i n gk an . S e t e l a h k e r i ng n o d a d i l i h a t di b a w a h lampu u l t r a violet. U n t u k m a s i n g - m a s i n g k o n s e n t r a s i m e t a n o l d i l a k u k a n r e p l i k a s i s e b a n y a k 5 kali .
3.4. A n a l i s i s d a t a ( 37,38)
D ar i hasil p e n g a m a t a n akan d i p e r o l e h dua v a r i a b e l yaitu: - v a r i a b e l x : n ilai log P d ar i a mo ks is il in . a m p i s i - lin, k l o k s a si li n, f l u k l o k s a s i l i n dan d i k l o k s a s i l i n . - v a r i a b e l y : n i l a i da ri a m o k s is il in , ampisilin, kloksa si li n, f l u k l o k s a s i l i n dan di k l o k s a s i l i n . S e l a n j u t n y a d a t a t e rs eb ut d i m a s u k k a n d a l a m tabel
b e r i k u t : P e n i s i l i n X y 1 xy x z yZ A m o k s i s i l i n A m p i s i l i n K l o k s a s i l i n D i k l o k s a s i l i n F l u k l o k s a s i l i n Z y 7-^x *-y *-xy i - X £ N i l a i log P dan n i l a i R^ d ar i m a s i n g - m a s i n g t u r u n a n p e n i s i l i n d i t e n t u k a n n i l a i r a t a - r a t a n y a dan s t a nd ar de v i a s i n y a : SD = E x2 - ( E x) 2 n - 1 SD = s t a nd ar d e v ia si
x = n ilai log P atau n i l a i R^ n = j u m l a h sampel
U n t u k m e n g e t a h u i ada t i d a k n y a k or elasi linier a n t a r a v a r i a b e l x d e n g a n v a r i a b e l y d i l a k u k a n p e r h i t u n g a n k o e f i s i e n korelasi. n .E x y - ( E x ).( E y ) J [ n . E x z - ( E x ) z ] [ n . Z y2 - ( E y ) z ] r = k o e f i s i e n ko re l as i n = j u m l a h sam pe l
disim-p u l ka n t er d a disim-p a t k or el as i linier a n t a r a v a r i a b e l x d e n g a n v a r i a b e l y, unt.uk s e l a n j u t n y a da pat d i b u a t p e r s a m a a n gar is r e g r e t i n y a d e n g a n rumus se ba ga i b e r i k u t : y = bx + a d i m a n a b - JL'Exy ~ ( ^ x ) . ( Z y ) ” n . I x ^ - (Ex)* Z y - b.2x a = --- -— — — n U n t u k m e n g e v a l u a s i p e r s a m a a n g a r i s regresi, d i g u n a k a n uj i A n o v a p a d a ot = 0,05 d e n g a n :
Ho : t i da k ada k o r e l a s i linier a n t a r a x dan y Ha : ada kore l a s i linier a ntara x dan y
Su mb e r V a r i as i deraj at b eb as SS MS F H i t u n g Reg re si 1 £ ( y c- y ) z 1 ^ ( y c- y ) z £ ( y c - y) 2 linier £ ( y - y c )z/ n- 2 R es id u a l n- 2 £ ( y - y c )z ^ ( y - y c )2/ n- 2 T ot al n- 1 £ ( y - y) 2 d i m a n a : y c = n i l a i y y a n g d i d a p a t da ri p e r s a m a a n g a r i s r e g r e si y = n i l a i y rata- ra t a n = j u m l a h sam pe l A p a b i l a h a r g a F huung > Ftabei m ak a Ho d i t o l a k atau d ap a t d i k a t a k a n b a h w a p e r s a m a a n g ar is reg re si
ya ng d i d a p a t c u ku p r e p r e s e n t a t i f u n t u k m e n g g a m b a r k a n k o r e l a s i linier a n t a r a v a r i a b e l x d e n g a n v a r i a b e l y <37,38).
