17 Tabel 12 Definisi operasional
Variabel Definisi Operasional Alat Ukur Cara Ukur Hasil Ukur
Usia Usia dihitung sejak lahir hingga ulang tahun terakhir
Kuesioner Wawancara < 50 thn 51 – 55 thn >55 thn Pendidikan Lama sekolah yang berhasil
diselesaikan responden
Kuesioner Wawancara Lulus SD
Lulus SMP Lulus SMA Lulus Akd/S-1 Pekerjaan Aktivitas di dalam atau
diluar rumah yang menghasilkan uang
Kuesioner Wawancara Bekerja
Tidak bekerja
Pengeluaran Besarnya rupiah yang dikeluarkan perkapita per bulan
Kuesioner Wawancara < rata-rata > rata-rata
Suku Asal daerah orang tua Kuesioner Wawancara Sunda
Jawa Minang, dll Lama menopause Dihitung sejak terakhir kali
menstruasi hingga saat penelitian dimulai
Kuesioner Wawancara Lama nya
menopause dalam tahun Pengetahuan gizi Nilai yang diperoleh setelah
menjawab pertanyaan tentang gizi
Kuesioner Wawancara Kurang
<60% benar Sedang 60%-80% benar Baik
>80% benar Konsumsi Jumlah dan jenis makanan
yang dikonsumsi dalam satu hari yang disajikan dalam persentase total dari Angka Kecukupan Gizi
Form food record
Pengisian < AKG > AKG
Status Gizi (IMT) Rasio antara berat badan dalam kg dengan tinggi badan dalam meter kuadrat. Rumus : BB (kg)/TB2(m) Timbangan BB SECA dan pengukur tinggi microtoise Menimbang BB responden dengan timbangan SECA dan TB dengan microtoise Kurus: <18.5 Normal: 18.5 – 25 Gizi lebih: 25 – 27 Obesitas: >27
18
Variabel Definisi Operasional Alat Ukur Cara Ukur Hasil Ukur
Tekanan darah Hasil pengukuran sistolik dan diastolic yang dilakukan pada posisi duduk setelah
beristirahat minimal 10 menit
Tensi meter Mengukur tekanan darah pada lengan bagian atas Hipertensi: sistolik >140 mmHg dan atau diastolik <90 mmHg Non hipertensi: sistolik <140 mmHg dan diastolik < 90 mmHg
Genetik Penyakit yang diturunkan dari salah satu orang tua atau saudara yang lebih tua
Kuesioner Wawancara Ada: jika salah satu keluarga yang lebih tua mengalami salah satu jenis pyk degeneratif Tidak ada: jika tidak ada anggota keluarga yang terkena pyk degeneratif Merokok Kebiasaan merokok yang
dilakukan sehari-hari
Kuesioner Wawancara Ya: jika saat penelitian sampel terbiasa merokok Tidak: jika saat penelitian sampel tidak merokok Aktivitas fisik Kegiatan olah raga yang
dilakukan secara rutin dalam satu minggu
kuesioner Wawancara Jarang (<3x/mg) Sering (>3x/mg)
K-Total Kadar kolesterol dalam serum darah Analisis laboratorium Pengambilan darah lewat vena dan dianalisis di Lab Rasio K-LDL Kadar LDL dalam serum darah Analisis laboratorium Pengambilan darah lewat vena dan dianalisis di Lab Rasio K-HDL Kadar HDL dalam serum darah Analisis laboratorium Pengambilan darah lewat vena dan dianalisis di Lab Rasio
19
Variabel Definisi Operasional Alat Ukur Cara Ukur Hasil Ukur
Trigliserida Kadar trigliserida dalam serum darah
Analisis laboratorium
Pengambilan darah lewat vena dan dianalisis di Lab
Rasio
SOD Kadar enzim superoksida
dismutase dalam serum darah
Analisis laboratorium
Pengambilan darah lewat vena dan dianalisis di Lab
Rasio
Zinc Kadar Zn dalam serum darah Analisis laboratorium
Pengambilan darah lewat vena dan dianalisis di Lab
Rasio
MDA Kadar MDA dalam
serum darah
Analisis laboratorium
Pengambilan darah lewat vena dan dianalisis di Lab
Rasio
Oksidasi LDL Kadar oksidasi LDL dalam serum darah
Analisis laboratorium
Pengambilan darah lewat vena dan dianalisis di Lab
SUPEROXIDE DISMUTASE
Kit by Northwest, Vancouver
Prinsip
Metoda ini di dasarkan pada monitoring laju auto-oksidasi dari hematoxilin, dengan modifikasi untuk meningkatkan robustness dan reliability. Adanya enzim SOD pada pH spesifik, laju auto-oksidasi dihambat dan persentase dari hambatan adalah linier pada jumlah SOD yang ada pada kisaran spesifik. Prinsip dasar dari pengukuran dirumuskan sebagai berikut.
SOD
O2 + HTH2 XX H2O2 + HT (Abs 560 ↑) Alat yang dibutuhkan
- Cuvet semi-midro (1.0 mL) - Tabung mikrosentrifugas - Botol - Pipet (0.0 – 1.0 mL) - Tips pipet Prosedur
1. Tambahkan 230 µL assay buffer dalam well sampel
2. Tambahkan 10 µL assay buffer (untuk blanko) atau 10 µL sampel. Mix dan inkubasi 2 menit
3. Tambahkan 10 µL hematoxylin reagent untuk memulai reaksi. 4. Mix dengan cepat menggunakan shaker dan segera mulai pembacaan
dengan panjang gelombang 560 nm setiap 10 detik atau interval waktu yang pendek, setidaknya 5 menit.
Catatan : Laju reaksi seharusnya akan linier sekitar 10 menit. Penghitungan aktivitas SOD menggunakan rumus sebagai berikut :
1. Y = aX + b
2. Rate (Abs560nm/min) = (Y2 – Y1)/(X2 – X1)
3. Ratios/b= Rates/Rateb
4. % Inhibition = (1 – Ratios/b) *100%
5. (SOD U/mL)s= 1.25 * (% inhibition)
6. (SOD U/mL)os= (SOD U/mL)s* (Sample dilution
Kolesterol
Kolesterol total diperiksa dengan menggunakan monotest Cholesterol CHOD-PAP, dengan metoda enzimatik kolorimetrik dengan batas normal < 200 mg/dl. Kolesterol ditentukan secara enzimatik menggunakan kolesterol esterase dan kolesterol oksidase. Sampel di tuang dalam kuvet kecil ditambah reagent kolesterol, diletakkan dalam alat dan pembacaan dimulai, nilai akan keluar secara digital.
Trigliserida
Trigliserida diperiksa dengan menggunakan pemeriksaan enzimatik kolorimetrik “trigliserida GPO-PAP” dengan batas normal < 150 mg/dl. Sampel di tuang dalam cuvet, dan ditambahkan buffer/4-chlorophenol/enzymes dan pembacaan dimulai serta nilai akan keluar secara digital.
K-HDL
Pemeriksaan K-HDL dilakukan dengan menggunakan metoda HDL Cholesterol, no pretreatment, secara homogeneous enzymatic colorimetric dengan batas normal 40 mg/dl. Sampel dituang dalam cuvet dan ditambahkan R1 dan R2 (PEG-modified enzymes/4-amino-antipyrine/buffer) dan pembacaan dimulai, nilai akan keluar secara digital.
K-LDL
Pemeriksaan K-LDL dilakukan dengan menggunakan metoda LDL cholesterol CHOD-PAP dengan atas normal 130 mg/dl. Sampel dituang dalam cuvet dan ditambahkan reagent K-LDL dan pembacaan dimulai, nilai akan keluar secara digital.
ANALISIS ISOFLAVON (INA Method 118.000)
Prinsip
Contoh diekstrak pada suhu 65oC selama 2 jam dengan alcohol/methanol 80% dan dilakukan penyabunan pada temperature ruang dengan NaOH 2N selama 10 menit kemudian reaksi dihentikan dengan penambahan asam acetat glacial, kemudian hasil ekstrak disaring, diencerkan dan di sentrifus. Dianalisis dengan HPLC kolom C18, dengan fase gerak methanol air dan asam asetat. Contoh dibaca pada panjang gelombang 260 nm.
Persiapan contoh:
Untuk sampel yang konsentrasi proteinnya tinggi, diusahakan penimbangan 1 gram protein.
Timbang 300 mg contoh ke dalam tabung centrifuge, tambahkan 40 ml methanol 80% , tutup, kocok pada suhu 65oC selama 2 jam. Dinginkan pada temperatur ruang, tambahkan 3 ml NaOH 2N, tutup dan kocok selama 10 menint pada orbital sheaker, tambahkan 1 ml asam asetat glacial, putar agar tersuspensi. Encerkan menjadi 20 ml dengan methanol. Pusingkan selama 10 menit dengan kecepatan 2000 rpm. Dengan standar > 40% isoflavon, ambil 1 ml encerkan ke dalam 10 ml methanol 80%.
Kondisi alat
HPLC detector UV 260 nm Flow rate 0.8 ml/menit Coloum temperature 30oC
OXIDIZED LDL ELISA (Kit by Mercodia, Swedia)
PRINSIP PENGUKURAN
Mercodia Oxidized LDL ELISA merupakan pengukuran imunologi dari 2 sisi enzim dalam fase padatan. Pengukuran ini didasarkan pada tehnik direct sandwich, dimana 2 antibodi monoclonal digunakan untuk memisahkan titik antigenic pada molekul oxidized apolipoprotein B. Selama inkubasi oxidized LDL dalam sampel bereaksi dengan antibody anti-oxidized LDL microtitration well. Setelah pencucian, yang mana menghilangkan komponen-komponen plasma non-reaktif, antibody peroxidaxe conjugated anti-human apolipoprotein B mengenali fase padatan dari oxidized LDL. Setelah inkubasi kedua dan tahapan pencucian berikutnya yang menghilangkan antibody enzim terlabel yang tidak terikat, ikatan konjugat dideteksi oleh reaksi dengan TMB. Reaksi dihentikan dengan penambahan asam untuk memberikan titik akhir kolorimetrik, selanjutnya dibaca dengan spektrofotometer.
ALAT DAN BAHAN
Mikropipet 25 μL dengan disposable tips Pipet 50, 100, 200, 1000 μL
Gelas kimia dan silinder untuk preparasi sampel H2O steril
Test tubes dengan tutup 3.5 mL Microplate reader filter 450 nm Shaker
Microplate washing device Vortex
REAGENT
Setiap Mercodia Oxidized LDL ELISA kit mengandung reagent untuk 96 wells, tersedia untuk 40 sampel, 2 kontrol, dan 1 kurva calibrator (duplo).
a. Coated Plate – 1 plate, 96 wells, ready to use
Untuk mikcroplate wells yang tidak digunakan, tutup kembali dengan isolasi dan dapat digunakan dalam jangka waktu 2 bulan.
b. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 – 5 vials, 1000 L, Lyophilized
Konsentrasi terdapat pada label. Warna kode kuning. Ditambahkan 1000 μL H2O steril per vial.
c. Calibrator 0 – 1 vial, 1000 μL, ready to use
Warna kode kuning.
d. Control (L), (H) – 2 vials, 1000 L, Lyophilized
Konsentrasi tercantum pada label. Ditambahkan 1000 L H2O steril per vial.
e. Enzyme Conjugate 11x – 1 vial, 1.2 mL, Preparation
(Peroksidase conjugated mouse monoclonal anti-apoB)
f. Enzyme Conjugate Buffer – 1 vial, 12 mL, ready to use
Kode warna biru.
g. Assay Buffer – 1 vial, 12 mL, ready to use
Kode warna merah.
h. Sampel Buffer 4x – 1 botol, 50 mL
Kode warna kuning. Dilarutkan dengan 150 mL H2O steril untuk membuat sampel
buffer. Catatan! Endapan mungkin terbentuk ketika disimpan pada suhu 2 – 8 0C. Biarkan Sampel Buffer 4x hingga mencapai suhu ruang. Shake atau vortex hingga endapan terlarut kembali.
i. Wash Buffer 21X – 1 botol, 40 mL
Dilarutkan dengan 800 mL H2O steril untuk membuat wash buffer
j. Substrate TMB – 1 vial, 22 mL, ready to use
Tidak berwarna. Catatan! Sensitif terhadap cahaya!
k. Stop Solution – 1 vial, 7 mL, ready to use
0.5 M H2SO4
PERSIAPAN ENZYME CONJUGATE SOLUTION
Siapkan sejumlah volume enzyme conjugate solution yang dibutuhkan dengan melarutkan enzyme conjugate 11x (1+10) dalam enzyme conjugate buffer seperti pada table. Jika ingin menyiapkan enzyme conjugate solution untuk seluruh plate,
tuangkan seluruh enzyme conjugate buffer kedalam vial enzyme conjugate 11x. Campurkan hingga merata.
KOLEKSI SPESIMEN DAN PERLAKUAN
Spesimen ynag direkomendasikan untuk digunakan adalah fresh EDTA-plasma, heparin-plasma, dan serum.
Plasma
Koleksi darah kemudian masukkan dllam tabung yang mengandung EDTA atau heparin sebagai anti-koagulasi, dan pisahkan fraksi plasma. Sampel dapat dismpan pada suhu -80 0C selama-lamanya 6 bulan. Hindari pembekuan dan pencairan yang berulang-ulang.
Serum
Koleksi darah, biarkan menggumpal, dan pisahkan serum dengan sentrifugasi. Sampel dapat disimpan pada suhu -80 0C paling lama 6 bulan . Hindari pembekuan dan pencairan yang berulang-ulang.
PREPARASI SAMPEL
Sampel harus dilarutkan pada hari yang sama saat pengukuran dilakukan. Siapkan 2 tabung untuk setiap sampel pasien. Setiap sampel harus dilarutkan dalam 2 tahapan hingga mencapai larutan akhir 1/6561, sebagai berikut :
1. Pembuatan larutan 1/81.
25 μL sampel pasien dimasukkan dalam tabung, ditambahkan 2000 μL sampel buffer kemudian ditutup dan dicampurkan sempurna (invert 3x, vortex).
2. Pembuatan larutan 1/6561.
25 μL larutan 1/81 dimasukkan dalam tabung, ditambahkan 2000 μL sampel buffer, kemudian ditutup dan dicampurkan sempurna (invert 3x, vortex).
PROSEDUR
Semua reagent dan sampel harus berada di suhu ruang sebelum penggunaan. Siapkan kurva standar setiap kali pengukuran.
1. Siapkan enzyme conjugate solution, sampel buffer, wash buffer dan sampel.
2. Siapkan Coated Plate wells yang tersedia untuk calibrators, controls, dan sampel (duplo).
3. Pipet calibratos, controls, dan diluted sampel masing-masing 25 μL kedalam wells.
4. Tambahkan 100 μL assay buffer pada setiap wells.
5. Inkubasi plate pada shaker (700-900 rpm) selama 2 jam pada temperatur ruang (18-250C).
6. Cuci sebanyak 6 kali dengan pencuci otomatis atau masukkan setiap sumuran dengan 350 μL wash buffer. Hilangkan cairannya dan ulangi sebanyak 5 kali. Setelah pencucian terakhir, balik dan tepukkan palte pada tisu.
7. Tambahkan 100 μL enzyme conjugate solution pada setiap wells.
8. Inkubasi plate pada shaker selama 1 jam pada temperatur ruang (18-25
0
C).
9. Cuci kembali sebanyak 6 kali dengan pencuci otomatis atau masukkan setiap sumuran dengan 350 μL wash buffer. Hilangkan cairannya dan ulangi sebanyak 5 kali.
10. Tambahkan 200 μL substrate TMB.
11. Inkubasi selama 15 menit pada temperatur ruang (tanpa shaker).
12. Tambahkan 50 μL stop solution, shaker selama 5 detik untuk memastikan pencampuran.
13. Baca absorbansinya pada 450 nm dan analisa. Pembacaan harus dilakukan + 30 menit.
Catatan! Untuk menghindari kontaminasi antara conjugate dan substrate, gunakan pipet yang berbeda.
SKEMA KERJA PENGUKURAN OXIDIZED LDL ELISA (Mercodia Kit)
Calibrators, Controls, Diluted Sample
- Diambil dengan pipet masing-masing sebanyak 25 μL dan dimasukkan kedalam wells yang telah tersedia
- Ditambahkan masing-masing wells dengan 100 μL assay buffer - Diinkubasi dengan dishaker (700-900 rpm) selama 2 jam pada T
ruang (18-250C)
- Ditambahkan masing-masing wells dengan 350 μL wash buffer, dihilangkan cairannya dan diulangi sebanyak 5 kali. Setelah pencucian terakhir, microplate dibalik dan ditepukkan pada tisu. - Ditambahkan masing-masing wells dengan 100 μL enzyme
conjugate solution.
- Diinkubasi dengan dishaker selama 1 jam pada T ruang (18-250C)
- Ditambahkan masing-masing wells dengan 350 μL wash buffer, dihilangkan cairannya dan diulangi sebanyak 5 kali. Setelah pencucian terakhir, microplate dibalik dan ditepukkan pada tisu. - Ditambahkan masing-masing well dengan 200 μL substrat TMB - Diinkubasi selama 15 menit pada T ruang (tanpa dishaker) - Ditambahkan masing-masing well dengan 50 μL stop solution,
shaker selama 5 detik untuk memastikan pencampuran.
- Dibaca absorbansinya pada 450 nm (pembacaan harus dilakukan dalam + 30 menit)
- Dianalisa
