28 BAB III
METODE PENELITIAN A. Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimen menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) pola faktorial, yaitu penambahan konsentrasi fosfor dalam media kultur in vitro yang terdiri atas 3 variasi konsentrasi (1x, 1.5x dan 2x konsentrasi p dalam media NP). Setiap perlakuan dibuat 3 botol ulangan dengan masing-masing botol ditanami 2 tanaman. Masing-masing tanaman dianggap sebagai satu.
B. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian induksi pseudobulb anggrek Dendrobium antennatum dilakukan di ruang Laboratorium Kultur Jaringan Tumbuhan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Yogyakarta. Pelaksanaan penelitian dilakukan pada bulan Februari 2017 sampai dengan Juni 2017
C. Variabel penelitian
a. Variabel bebas berupa variasi konsentrasi penambahan sukrosa dan fosfat. Perlakuan dibagi menjadi 3 jenis perlakuan:
P1= 1x konsentrasi P dalam media NP P2= 1,5x konsentrasi P dalam media NP P3= 2x konsentrasi P dalam media NP
29
b. Variabel respon/terikat: Pertumbuhan anggrek meliputi pertumbuhan panjang akar, jumlah akar, panjang daun, jumlah daun, diameter batang dan tinggi tanaman.
c. Variabel kontrol: umur tanaman, hari penanaman, waktu pengukuran, dan penempatan atau pemeliharaan (meliputi cahaya dan suhu).
D. Alat dan bahan penelitian
Bahan penelitian yang digunakan adalah medium NP dengan berbagai variasi konsentrasi P dan anggrek Dendrobium antennatum yang sudah berumur 10 bulan dari waktu penaburan. Anggrek yang digunakan setidaknya memiliki 2 sampai tiga daun kemudian disubkultur di medium NP selama 1 bulan sebelum ditanam di medium perlakuan. Bahan lain yang digunakan adalah alkohol (70% dan 96%) yang dipakai untuk sterilisasi alat.
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini diantaranya, alat sterilisasi berupa autoclave dan laminar air flow (LAF). Alat yang digunakan pada pembuatan media diantaranya, erlenmeyer, gelas ukur, beker gelas, pH stick, pipet dan mikropipet, hot plate dan magnetic stirrer dan botol jam.
E. Prosedur Penelitian
1. Pembuatan Stok dan Media Tanam a. Stok Makronutrien
Langkah pertama yang dilakukan dalam pembuatan stok makronutrien adalah menimbang satu per satu bahan yang dibutuhkan
30
sesuai dengan konsentrasi larutan yang akan dibuat (lampiran 4). Masing-masing bahan yang telah ditimbang kemudian dilarutkan ke dalam erlenmeyer 250 ml yang telah diisi dengan 150 ml aquadest. Setiap kali melakukan penambahan, larutan perlu diaduk menggunakan magnetik stirrer sampai bahan kimia larut. Setelah semua bahan kimia larut, ditambahkan dengan aquadest sampai volume mencapai 200 ml. Larutan stok Hara Makro diberi label : MAKRO, NP, 200 ml / l yang artinya : diperlukan 200 ml stok hara Makro untuk 1 liter medium MS
b. Stok Mikronutrien
Bahan-bahan kimia yang diperlukan ditimbang sesuai dengan konsentrasi larutan yang akan dibuat (lampiran 4). Bahan-bahan yang telah ditimbang satu per satu dilarutkan ke dalam erlenmeyer 500 ml yang telah diisi dengan 300 ml aquadest. Setiap kali melakukan penambahan bahan kimia perlu diaduk sampai larut menggunakan magnetik stirrer. Setelah semua bahan kimia dimasukkan dan larut, ditambahkan aquadest sampai volume mencapai 500 ml. Larutan stok diberi label : MIKRO, MS x 5ml/l artinya : diperlukan 5 ml larutan stok hara mikro untuk membuat 1 liter medium MS. Pembuatan medium NP memerlukan setengah dari komposisi stok mikro untuk pembuatan medium MS, sehingga pada pembuatan medium NP hanya ditambahkan 2,5 ml larutan
31
Bahan-bahan yang diperlukan untuk pembuatan larutan ditimbang terlebih dahulu (lampiran 4).Satu per satu bahan dilarutkan ke dalam erlenmeyer 200 ml yang telah diisi dengan 150 ml aquadest. Setiap kali melakukan penambahan bahan kimia perlu diaduk terlebih dahulu sampai larut menggunakan magnetik stirrer. Setelah semua bahan kimia larut, larutan ditambahkan dengan aquadest sampai volume mencapai 200 ml kemudian erlenmeyer ditutup rapat menggunakan alumunium foil. Larutan stok disimpan dalam almari es , suhu 4oC
d. Stok Besi 200 ml (40 kali konsentrasi)
Bahan yang diperlukan dalam pembuatan stok Fe berupa 1492 mg Na2SO4.7 H2O, kedua bahan tersebut kemudian dimadukkan ke dalam dua erlenmeyer 200 ml yang berbeda. Masing-masing erlenmeyer telah berisi aquadest 75 ml. Apabila bahan tersebut sukar larut, ditambahkan beberapa tetes larutan HCl, lalu dipanaskan. Larutan dibiarkan dingin pada suhu kamar kemudian ditambahkan aquadest sampai volume mencapai 200 ml dan tutup rapat.
e. Pembuatan media NP (1L)
50 ml larutan stok makronutrien dimasukkan ke dalam erlenmeyer 1 L berisi 500 ml aquadest steril, kemudian dilarutkan dengan magnetic stirer. Larutan yang telah larut, kemudian ditambahkan satu-persatu, 2,5 ml larutan stok mikronutrien, 4 ml stok vitamin, 5 ml larutan Fe, 100 mg myoinositol, dan 20 g gula pasir.
32
Setiap kali memasukkan bahan, larutan terlebih dahulu dihomogenkan menggunakan magnetik stirer. Setelah semua bahan dimasukkan, kemudian pH larutan diukur sampai pH kira-kira 6. Larutan dengan pH sesuai, kemudian diberi 6,5 g agar dan dipanaskan hingga mendidih. Media yang telah mendidih kemudian dipindahkan ke botol steril dan disterilisasi menggunakan autoclaf selama 15 menit.
f. Pembuatan media perlakuan
200 ml larutan stok makronutrien dengan konsentrasi 1x, 1,5x dan 2x dalam 200 ml aquadest dimasukkan ke dalam erlenmeyer 1 L berisi 500 ml aquadest steril, kemudian dilarutkan dengan magnetic stirer. Larutan yang telah larut, kemudian ditambahkan satu-persatu, 2,5 ml larutan stok mikronutrien, 4 ml stok vitamin, 5 ml larutan Fe, dan 100 mg myoinositol. Setiap kali memasukkan bahan, larutan terlebih dahulu dihomogenkan menggunakan magnetik stirer. Campuran media kemudian diambil sebanyak 200 ml kemudian ditambahkan 4 g gula pasir dan dilarutkan dengan magnetic strirer. Setelah semua bahan dimasukkan, kemudian pH larutan diukur sampai pH kira-kira 6. Larutan dengan pH sesuai, kemudian diberi 1,4 g agar dan dipanaskan hingga mendidih. Media yang telah mendidih kemudian dipindahkan ke botol steril dan disterilisasi menggunakan autoclaf selama 15 menit.
33
Proses subkultur dilakukan di dalam ruang kultur secara steril menggunakan Laminar Air Flow (LAF). Tanaman yang disubkultur merupakan tanaman Dendrobium antennatum yang telah berumur 10 bulan dari masa penaburan biji. Tanaman disubkultur ke dalam botol medium NP-K yang telah disiapkan. Masing-masing botol diisi 7-10 tanaman Dendrobium antennatum dan tumbuhkan selama satu bulan untuk menyegarkan tanaman. Setelah berumur satu bulan tanaman kemudian ditanam ke medium perlakuan. Satu botol perlakuan ditanami masing-masing dua tanaman. Masing-masing tanaman dianggap sebagai satu ulangan.
F. Teknik Pengumpulan Data
Pengamatan planlet setelah ditanam dalam media perlakuan dilakukan setiap seminggu sekali selama 4 bulan. Peubah yang diamati antara lain : 1. Jumlah daun
Perhitungan jumlah daun dilakukan dengan menghitung daun yang telah dapat dilihat bentuknya, dihitung dari daun paling bawah sampai dengan daun paling ujung (daun yang muncul pada bagian pucuk tanaman). Akar yang mengering atau layu juga dihitung dan dimasukkan ke dalam jumlah akar yang tumbuh pada tanaman.
2. Jumlah akar
Perhitungan jumlah akar dilakukan dengan menghitung semua akar yang yang muncul pada tanaman, dari akar yang baru muncul sampai dengan akar yang sudah tua.
34 3. Panjang daun dan akar
Perhitungan panjang daun dan akar dilakukan pada minggu terakhir pengamatan (minggu ke 10 setelah subkultur. Daun dan akar yang diukur adalah daun dan akar utama yang terpanjang.
4. Jumlah tunas
Tunas atau anakan yang dihitung adalah semua anakan yang muncul di pangkal batang sampai dengan tunas yang muncul di akar pada bagian bawah tanaman.
5. Diameter batang
Diameter batang per tanaman (cm) diukur pada batang atau pseudobulb terbesar dengan menggunakan jangka sorong.
6. Tinggi tanaman anggrek
Tinggi tanaman anggrek diukur dengan menggunakan milimeter blok yang telah ditempelkan pada bagian luar botol. Perhitungan dilakukan dengan menggunakan aplikasi photoshop.
Gambar 5. Ilustrasi pengukuran pertumbuhan tanaman: a. tinggi tanaman;
b. panjang daun dan akar; c. diameter pseudobulb; d. jumlah daun
35 G. Teknik Analisis Data
Data kuantitatif yang diperoleh meliputi data pengukuran tinggi tanaman, diameter pseudobulb, jumlah pseudobulb, jumlah akar, panjang akar, jumlah daun dan panjang daun dianalisis menggunakan Analysis of Variant (ANOVA) pada program SPSS dengan taraf 10% untuk mengetahui adanya pengaruh penambahan konsentrasi fosfor terhadap pertumbuhan pseudobulb. Data yang memiliki signifikasi di bawah 0.1 berarti memilkiki perbedaan yang nyata dan akan dianalisis lanjut menggunakan uji Duncan Multiple Range Test (DMRT).
H. Batasan Operasional
1. Pada penelitian ini unsur p (fosfor) didapatkan dari KH2PO4.
2. Tanaman Dendrobium antennatum yang digunakan berumur 10 bulan dari waktu penaburan biji dan terlebih dahulu disubkultur selama satu bulan sebelum disubkultur ke media perlakuan.
