Dari hasil isolasi sel tunggal terhadap ookista setelah diamati dari 100

(1)

IV. HASIL PENELITIAN

Dari

hasil

isolasi sel

tunggal

terhadap

ookista

setelah diamati

dari 100

J

ookista,

diperoleh

ookista

E.fenella

yang

berbentuk

bulat

lonjong,

dengan

ukuran

panjang

berkisar

21,9

- 26,4

pm

dengan

rata-rata

24,9

pm,

lebarnya

berkisar

16,6

-

21,6

pm

dengan

rata-rata

18,6

p.

Masa

prepaten

7 hari

dan

membutuhkan

waktu

sporulasi

24 jam

.

Ookista

E .

tenella

hasil

isolasi

(2)

2. Merozoit

Merozoit yang digunakan merupakan merozoit generasi ke-2 yang

diperoleh dengan ukuran berkisar 10,5

-

13,4 pm, dengan rata-rata 11,5 pm. Purifikasi merozoit dengan metode percol gradien, diperoleh jumlah

merozoit terbanyak pada garis batas antara konsentrasi 80% - 50 % percol. Gambar 7 menyajikan merozoit generasi ke 2 hasil penelitian.

3. Produksi Antibodi Monoklonal

3.1. Imunisasi pada Mencit

Dari hasil imunisasi pada 6 ekor mencit dengan merozoit diperoleh

hanya tiga ekor yang memberikan hasil antibodi yang positif.

3.2. Sel Mieloma

Sel mieloma yang digunakan adalah jenis Sp, stok yang didapat dari

Belgia (Gambar 8). Pada perhitungan awal jumlah sel rnieloma 20 x

lo6

per 2 ml media, kemudian pada saat thawing setelah selang waktu 4 bulan

diperoleh penurunan jumlah menjadi 6,6 x

lo6

per 2 rnI, yang berarti viabilitasnya adalah 33%, sehingga dilakukan d u a kali pasase pada media

biakan untuk meningkatkan viabilitasnya. Setelah dipasase, pada saat akan

(3)

Gambar 7.

Merozoit

generasi

kedua dad

E. tenella hasil

penelitian

(Pembesaran

1000x, pewamaan Heidenheins

Haematoxylin)

(4)

3.3. Sel

Thymosit

Jumlah sel thymosit yang diperoleh adalah

8,54

x

107 sel per 5

ml media

Kemudian dibagikan ke dalam mikroplat 96 sumur, masing-masing 100 PI.

Digunakan

5 buah mikroplat Gambar

9 menyajikan sel thymosit.

J

3.4. Sel

Limpa (Splenocyt)

Sel limpa diperoleh dari mencit Balb-C yang sudah diimunisasi. Jumlah

sel yang diperoleh adalah +umlah

2,s

x

10d sel per 10

ml.

Gambar sel limpa

disajikan pada Gambar 10.

(5)

Gambar

10. Sel splenosit dari limpa mencit yang sudah diimunisasi

(Pembesaran

450x)

3.5. Fusi antara sel mieloma dan sel limpa (sel

B)

Dari fusi yang dilakukan

dihasilkan

23 hibridoma dan setelah dilakukan

screening

hanya

2 yang memproduksi antibodi, yaitu pada mikroplat ke 2

dan dalam sumur

B1,

serta

pada mikroplat ke 3 dalam sumur

E4.

Penamaan antibodi monoklonal menjadi antibodi monoklonal2

B1

(MAb 2

81) dan 3

E4

(MAb

3 E4).

Gambar

11 menyajikan hibridoma yang terbentuk

(6)

4. Penentuan kelas dan sub kelas antibodi monoklonal

Dari hasil terhadap penentuan kelas antibodi, diperoleh bahwa MAb

2B1 dan

3E4

termasuk ke dalam kelas imunoglobulin G

(IgG)

berdasarkan

positif reaksi yang terjadi pada uji

ELISA

dengan menggunakan serum

8

kelinci anti IgG ayam, dan dari penentuan sub kelas kedua

MAb

tersebut

termasuk

ke

dalam sub kelas

IgG2,

berdasarkan positif reaksi pada

pengujian, dimana pada sumur dengan hasil positif menampakkan wama

kuning terang.

(7)

Pada percobaan

ini

diperoleh bahwa sporozoit (Gambar 12) yang

diinkubasi dengan antibodi monoklonal menjadi terhambat penetrasinya di

dalam biakan jaringan. Gambar b i a k a jaringan disajikan pada Gambaal3.

Pada sporozoit yang diinkubasi dengan antibodi monoklonal281 dan

3E4

(Gambar 14 dan 15) terjadi penurunan jumlah invasi sporozoit (Tabel

5).

MAb 281 dipilih sebagai bahan imunisasi, karena dengan konsentrasi yang

sama MAb 281 lebih menghambat proses penetrasi sporozoit pada biakan

jaringan dibanding dengan MAb 3E4 (p<0,05)

(8)

Tabel

5. J d a h

sporozoit

per

10 n d

hamparan biakan

jaringan

dengan

antibodi

monoklonal

Gambar

13. Invasi

sporozoit

ke

dalam biakan

jaringan

(Pembesaran

50x,

pewarnaan

Acid

fuchsin

dan

Anilin-blue

orange)

1/4

2,sde

1/2

2,Sde

(9)

0 1/16 118 1 /4 112 Konsentrasi MAb

Gambar 14. Jumlah sporozoit per 10 m m 2 hamparan sel biakan jaringan menurut konsentrasi MAb 2 B 1

0 1/16 118 114 112

Konsentrasi MAb

amb bar

15. Jumlah sporozoit per 10 mm2 hamparan sel biakan jaringan menurut konsentrasi MAb 3 E 4

(10)

6. Imunisasi pasif pada ayam

Pada imunisasi pasif pengujian dilakukan berdasarkan Cocciuac

Chalenge Procedure. Dalam penelitian ini diuji mortalitas, berat badan dan

skor perlukaan pada sekum ayam, serta produksi ookista. Produksi ookista

perlu diuji karena kemampuan memproduksi ookista merupakan ciri

penting dari derajat ketahanan hidup coccidia dalam lingkungannya.

6.1. Mortalitas ayam percobaan

Kematian t e j a d i pada hari ke lima, hari ke enam, d a n hari ke tujuh

pasca infeksi. Rataan kematian dari tiga ulangan pada kelompok A

berturut-turut adalah 15 ekor, 10 ekor d a n 10 ekor sehingga kematian

pada kelompok A be j u m l a h 35 ekor atau mencapai 70%. Pada kelompok

B rataan kematian dari tiga ulangan pada hari ke lima adalah 18 ekor,

padahari ke enam, 3 ekor dan pada hari ke tujuh, 2 ekor, berarti rataan

kematian b e j u m l a h 23 ekor atau mencapai 46%. Pada kelompok C,

kematian pada hari ke Iima rataan dari 3 ulangan adalah sebanyak 12 ekor,

6 ekor pada hari ke enam dan 3 ekor pada hari ke tujuh. Dengan demikian

kematian pada kelompok ini b e j u m l a h 21 ekor atau 42%. Pada kelompok

D, kematian juga terjadi pada hari ke iima, ke enam d a n ke tujuh dengan

(11)

d u a ekor. Dengan demikian pada kelompok D, rataan kematian berjumlah

11 ekor atau 22%. Pada kelompok E, F, G dan H serta kelompok K tidak

te rjadi kematian (Tabel 6 dan Gambar 16).

Tabel 6. Rataan dari tiga ulangan mortalitas ayam pada imunisasi pasif

HariKe

A B C D

Kelornpok perlakuan

Gambar 16. Rataan mortalitas ayam pada imunisasi pasif

Kelompok Perlakuan

1 A

I

B

~

C

~

D

~

E

/

F

~

G

/

H

~

K

~

6 7 Jumlah % 10 10 35 70 3 2 23 46 6 3 21 42 4 2 11 22 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

(12)

6.2. Berat badan ayam

Pengamatan terhadap berat badan diperoleh bahwa ayam pada

kelompok A menunjukkan berat badan yang lebih kecil dibanding kontrol,

satu minggu setelah infeksi dan meningkat kembali d u a minggu pasca

infeksi, kemudian sampai minggu ke tujuh pasca infeksi rataan berat badan

lebih rendah dari pada kelompok K. Demikian juga untuk kelompok B dan

C, sedangkan pada kelompok D, pada minggu ke dua pasca infeksi sampai

minggu ke tujuh pasca infeksi menunjukkan rataan berat badan yang

hampir sama dengan kelompok K (Tabel 7 d a n Gambar 17 ). Pada

kelompok E, F, G dan H, berat badan tidak berbeda nyata (p< 0 , O l ) dengan

kelompok K (Tabel 7 dan Gambar 18 ).

2000

fl

_I

Umur ayam (minggu)

Gambar 17. Rataan berat badan ayam menurut umur

(13)

Tabel 7. Rataan berat badan ayam pada imunisasi pasif (dalam gram)

3 4 5 6 7 8 9 2 0 11

Umur ayam (minggu) kelom pok A B C D E F G H K

Gambar 18. Rataan berat badan ayam menurut umur (kelompok E,F,G,H dan K)

pasta infeksi (minggu) _I

huruf yang berbeda rnenyatakan berbeda nyata (p < 0 , O l ) Rataan berat badan ayam (gram)

umur ayam (minggu) 3 38,3" 38,Tb 38,1b' 38,3" 38,3" 38,2ba 38,1b' 37,9cd 37,Sd 4 117,7" 117,9" 718,3" 118,O' 117,9" 117,6' 117,W 117,3" 116.9" 3 - 223,6' 234,0b 235,9"b 236,Zab 237,9"b 236,Wb 237,9" 237,6"b 237,9" I 6 398.3' 406,3b 415,lC 407,ab 397,6' 395,9<* 392,9d 395,Yd 397,T 2 8 777,Y 839,3d 884,4' 1024,2' 953,4b 959,6b 956,Sb 957,3b 956,1b 4 7 368,O' 600,7d 621,9'd 612,1'd 633 9"b 635.8' 636,3" 633,Znb 633,4"b 3 9 10 ₁₁