1
BAB I PENDAHULUAN
A. Latar Belakang Masalah
Kanker payudara merupakan tumor ganas yang dimulai dari sekelompok sel-sel kanker yang dapat tumbuh menyerang jaringan sekitarnya atau menyebar (metastasis) ke jaringan lain pada tubuh sebagai akibat dari ketidaknormalan proses apoptosis. Apoptosis atau kematian sel yang terprogram adalah mekanisme pengendalian terhadap eliminasi sel-sel yang mati pada organisme multiseluler. Sel dikontrol dan diregulasi selama proses apoptosis, sel yang mati kemudian difagosit oleh makrofag. Apoptosis berfungsi secara fisiologis antara lain untuk terminasi sel, mempertahankan homeostasis, perkembangan embrional, interaksi limfosit, dan involusi hormonal pada usia dewasa (Lumongga, 2008).
Sel-sel yang mati pada proses apoptosis memberikan sinyal dan diperantarai oleh beberapa gen yang mengkode protein untuk enzim pencernaan yang disebut caspase. Peristiwa apoptosis terjadi setelah adanya gangguan fungsi barier membran mitokondria dengan pelepasan sitokrom c melalui jalur caspase-3 pada sel normal. Aktivasi caspase-3 dipengaruhi oleh protein keluarga Bcl-2. Protein ini terdiri dari pro-apoptosis seperti Bax dan Bak dan anti-apoptosis seperti Bcl-2 dan Bcl-XL. Overekspresi Bcl-2 anti-apoptosis mencegah aktivasi caspase-3 pada tahap pelepasan sitokrom c, sehingga apoptosis tidak terjadi. Hal inilah yang terjadi pada sel kanker payudara MCF-7 (Mooney et al., 2002).
Beberapa senyawa yang terbukti berhasil menghambat aktivitas Bcl-2, diantaranya pirimidinilpiperazin yang mengikat prosurvival protein Bcl-XL (Shallal, 2011 cit Green dan Evan, 2002), fenilpirazol dengan afinitas tinggi mengikat Bcl-2 dan Bcl-XL (Porter et al., 2008 cit Zhang et al., 2007), kendomisin (Janssen, 2008), dan navitoklaks (Wilson et al., 2010). Kurkumin (bis-α,β-unsaturated β-diketone) dikenal sebagai senyawa yang memiliki aktivitas antiinflamasi dan antikanker (Sharma et al., 2005). Aktivitas biologi kurkumin pada model praklinis antara lain sitotoksik dan menginduksi apoptosis (Kuo et al., 1996), menghambat karsinogenesis (Perkins et al., 2002), mempengaruhi fase I
2
(Firozi et al., 1996) dan II metabolisme enzim karsinogen (Singh et al., 1998), antioksidan (Chan et al., 1998), serta mempengaruhi angiogenesis (Sharma, 2001). Kurkumin menginduksi apoptosis ketika siklus sel berada pada fase G2 atau M di dalam sel MCF-7 (Sharma et al., 2005). Senyawa lain yang memiliki aktivitas antikanker adalah diketopiperazin (Aoki et al., 2010 cit Martin dan Carvalho, 2007) yang merupakan analog dari kurkumin. Diketopiperazin memiliki beberapa turunan, diantaranya adalah turunan diketopiperazin C-alkil. Aktivitas inhibisi sel kanker senyawa ini dikarenakan interaksi cincinnya (Deveau et al., 2008).
Penelitian ini menarik dilakukan dalam rangka penemuan obat baru berbasis struktur molekul obat, melihat potensi yang dimiliki turunan diketopiperazin C-alkil diharapkan dapat digunakan untuk menghambat overekspresi Bcl-2 pada sel MCF-7 sehingga apoptosis dapat terjadi.
B. Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang masalah yang telah diuraikan, maka perumusan masalah dari penelitian ini adalah:
1. Mengkaji kedekatan interaksi geometri 3D turunan diketopiperazin C-alkil dengan senyawa penuntun dan senyawa yang telah diketahui potensinya sebagai inhibitor Bcl-2?
2. Apakah turunan diketopiperazin C-alkil mempunyai aktivitas sebagai inhibitor Bcl-2 secara perhitungan docking molekular?
C. Tujuan Penelitian
Berdasarkan uraian perumusan masalah di atas, maka tujuan dari penelitian ini adalah:
1. Mengetahui kedekatan bentuk geometri 3D turunan diketopiperazin C-alkil dengan senyawa penuntun dan senyawa yang telah diketahui potensinya sebagai inhibitor Bcl-2.
2. Memperoleh senyawa baru turunan diketopiperazin (DKP) yang berpotensi sebagai inhibitor Bcl-2.
3
D. Tinjauan Pustaka 1. Docking Molekular
Docking molekular adalah metode komputasi untuk memprediksi
geometri kompleks protein-ligan (Pyrkov et al., 2008). Metode docking dapat dilakukan dengan 2 cara. Pertama, pendekatan menggunakan fungsi penilaian (binding activity) untuk peringkat konformasi protein-ligan. Sistem ini kemudian dimodifikasi oleh algoritma pencarian, dan penilaian yang sama diterapkan lagi untuk merangking struktur baru. Kedua, penggunaan fungsi tingkatan penilaian yaitu fungsi reduksi untuk mengarahkan pencarian dan fungsi menentukan peringkat struktur yang dihasilkan (Kaapro dan Janne, 2002).
Docking molekular merupakan teknik penggabungan dua molekul
bersama-sama yang memiliki keunggulan, diantaranya bisa untuk mencari model ikatan antara protein dan ligan, dapat memprediksi bentuk kompleks intermolekuler struktur dua atau lebih molekul, kemungkinan menghasilkan jumlah konformasi struktur yang banyak. Oleh karenanya, docking molekular dapat mereduksi biaya pengembangan, meningkatkan efisiensi energi dan daya guna lingkungan, serta menaikkan produktivitas dan keuntungan (Pranowo & Abdul, 2011). Docking molekular dapat dilakukan menggunakan perangkat lunak PyRx Autodock-Vina.
2. MCF-7(Michigan Cancer Foundation-7)
Sel MCF-7 merupakan sel kanker payudara yang banyak digunakan untuk penelitian. Sel ini memiliki karakteristik antara lain resisten agen kemoterapi (Menchetner et al., 1998 & Aouali et al., 2003), mengekspresikan reseptor estrogen (ER +), overekspresi Bcl-2 (Butt et al., 2000 & Amundson
et al., 2000) dan tidak mengekspresikan caspase-3 (Onuki et al., 2003 & Prunet et al., 2005). Sel MCF-7 tergolong cell line adherent (Anonim, 2008) yang mengekspresikan reseptor estrogen alfa (ER-α), dan resisten terhadap doksorubisin (Zampieri et al., 2002). Karakteristik lain dari MCF-7 adalah mirip dengan Hep G2, dimana sel kanker jenis ini mengekspresikan wildtype p53 (Fitria et al., 2011).
4
3. Bcl-2 (B-cell lymphoma-2)
Protein Bcl-2 merupakan protein yang memainkan peranan penting pada regulasi apoptosis, atau kematian sel terprogram (Petros et al., 2010). a. Golongan Bcl-2
Keluarga protein Bcl-2 dibagi menjadi tiga kelompok, anti-apoptosis, pro-apoptosis anggota keluarga BAX/BAK dan pro-apoptosis protein BH3 (Youle dan Stasser, 2008).
Tabel 1. Golongan famili protein Bcl-2
b. Mekanisme aksi Bcl-2
Proses apoptosis suatu sel terjadi melaui dua jalur, yaitu jalur intrinsik (mitokondrial) dan jalur ekstrinsik (penghantaran sinyal secara langsung melalui adapter). Dalam kondisi normal, anggota famili Bcl-2 pro-apoptosis dan anti-apoptosis beraktivitas secara seimbang. Protein Bcl-2 anti-apoptosis berperan dalam proses apoptosis melalui jalur intrinsik, sewaktu sel mengalami stress, protein ini berkurang jumlahnya dalam mitokondria dan digantikan oleh protein pro-apoptosis seperti Bak, Bax dan Bim. Kemudian, permeabilitas mitokondria meningkat, protein cytochrom-c mengaktifkan cascade caspase. Cytochrom-c berikatan dengan protein Apaf-1 (apoptosis activating factor-1) dan mengaktivasi caspase-3, terjadilah apoptosis (Gambar 1).
Famili protein Bcl-2 Anti-apoptosis BCL-2, BCL-XL, BCL-W, MCL1, BCL-B & A1 Pro-apoptosis Bax/Bak
Bax dan BAK
Pro-apoptosis BH3
BAD, BIK, BID, HRK, BIM, BMF, NOXA dan
5
Gambar 1. Proses apoptosis sel melalui jalur intrinsik dan ekstrinsik (Youle dan Stasser, 2008)
Protein Bcl-2 merupakan antiapoptotik yang kuat dan ekspresi protein Bcl-2 yang berlebihan meningkatkan ketahanan hidup sel (Marleen
et al., 2008). Pada sel kanker, mutasi dari gen Bcl-2 dapat menyebabkan peningkatan ekspresi yang dapat menekan fungsi normal dari protein proapoptosis. Jika terjadi pada protein tersebut, maka dapat menyebabkan penurunan regulasi, sehingga sel kehilangan kemampuan untuk regulasi apoptosis yang dapat memicu terjadinya kanker (Lumongga, 2008).
Apabila overekspresi Bcl-2 dihambat, maka proses apoptosis dapat terjadi. Faktor transkipsi dari Bcl-2 adalah NFkB dari downstream P13K/Akt. Terhambatnya ekspresi Bcl-2 ini selanjutnya akan menginduksi pelepasan sitokrom c oleh mitokondria kemudian menginduksi jalur caspase (Fitria et al., 2011).
Overekspresi Bcl-2 dapat dihindari dengan inhibitor Bcl-2 seperti Bcl-xs yang diekspresikan dalam sel-sel MCF-7 dengan meningkatkan
chemosensitivity untuk VP-16 atau taksol (Sumantran et al., 1995). Jalur ekstrinsik
6
Penelitian terdahulu menunjukkan penemuan senyawa dengan molekul kecil yang menghalangi fungsi dan dapat berikatan dengan hydrophobic pocket Bcl-2 (Zheng et al., 2007).
4. Diketopiperazin
Diketopiperazin (2,5-piperazindion) merupakan model paling sederhana untuk studi geometri cis-peptida dan untuk memeriksa pengaruh rantai samping pada cincin konformasi. Diketopiperazin sejauh ini diselidiki memiliki kandungan asam amino L- dan D- dan residu N-teralkilasi seperti sarcosin, prolin, atau N-metil asam amino (Zeng et al., 2005). Aktivitas diketopiperazin dikenal sebagai antitumor dan antiviral (Aoki et al., 2010 cit
Martin dan Carvalho, 2007), sitotoksik (Graz, 2004), antimikroba (Houston et al., 2004) dan mempengaruhi saraf (Aoki et al., 2010 cit Prakash et al., 2002).
XR9051(N-(4-(2-(6,7-Dimetoksi-1,2,3,4,-tetrahidro-2-isoquinoli)etil)-fenil)-3-((3Z,6Z)-6-benziliden-1-metil-2,5-dioxo-3-piperaziniliden) metil-benzamid), merupakan turunan diketopiperazin C-alkil yang memiliki kemampuan melawan resistensi terhadap obat sitotoksik contohnya doksorubisin dan etoposid, dengan jalan menghambat pengikatan [3H]vinblastin dengan P-glikoprotein dan menghambat photoaffinity labeling
P-gp. Terhadap uji yang telah dilakukan, XR9051 lebih poten dibanding siklosporin A dan verapamil (Dale et al., 1998). Stereokimia ring-junction
DKP menghambat pertumbuhan sel kanker dengan sintesis jalan homodimer
carboline dan dievaluasi pertumbuhan penghambatan terhadap sel kanker
PC-3 (prostat) dan NCI-H520 (paru-paru) untuk mengukur sitotoksisitas (Amy et al., 2008). Turunan DKP C-alkil yang lain, diantaranya siklo-(4-S-hidroksi-R -prolin-Risoleusin) (Ovenden et al., 2011), 3,6-Bis(indol-3-ilmetilen)piperazin-2,5-dion (Andreani et al., 2008) dan 1-Asetil-3-(3-tieniliden)piperazin-2,5-dion (Asiri, 2000). Turunan Diketopiperazin yang digunakan pada penelitian ini berdasarkan empat struktur inti (Gambar 2-5).
7
Gambar 2. Inti 1 diketopiperazin. Tabel 2. Turunan diketopiperazin inti 1
Senyawa R1 R2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C7H8 C4H10 C4H10 C9H12O C3H8 C3H8 C4H10 C10H11NO C9H9N C8H10O2 C7H8 C4H10 C7H8 C9H12O C9H9N C3H8 C4H10 C10H11NO C9H9N C8H10O2
Gambar 3. Inti 2 diketopiperazin. Tabel 3. Turunan diketopiperazin inti 2
Senyawa R1 R2 11 12 13 14 15 16 17 18 19 C6H4Cl2 C7H7Cl C10H13NO C7H8 C7H7Br C10H8 C8H10 C7H7ClN2S C7H5F3 C6H4Cl2 C7H7Cl C6H4Cl2 C16H12ClN3 C7H7Br C10H8 C8H10 C6H5Cl C7H5F3
8
Gambar 4. Inti 3 diketopiperazin. Tabel 4. Turunan diketopiperazin inti 3
Senyawa R1 R2 20 21 22 23 C9H12O C7H8 C8H10O2 C8H7N C9H12O C7H8 C8H10O2 C8H7N
Gambar 5. Inti 4 diketopiperazin.
Tabel 5. Turunan diketopiperazin inti 4 yang dipakai untuk fragmentasi
Senyawa R1 R2 R3 R4 24 25 26 27 28 29 30 31 C7H8 C8H10 C7H7F C3H8 C7H14 C4H10 C7H8O C2H4O C6H12 C3H8 C7H8 C7H14 C3H6 C5H10 C7H8O C2H4O C7HO C6H5F H2 C6H5F H2 C7H8 2CH4 C9H12O H2 H2 C8H10O H2 C7H8 H2 2CH4 C9H12O E. Keterangan empiris
Penelitian ini diharapkan dapat memperoleh turunan diketopiperazin yang berpotensi memiliki interaksi dengan Bcl-2 pada sel MCF-7 secara docking
