1. Sebutkan macam-macam pewarnaan ! Pewarnaan Negatif
bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri dapat dibedakan dengan menggunakan pewarnaan sederhana, hanya digunakan satu macam zat warna untuk mewarnai sel-sel bakteri.
Pewarnaan Tahan Asam
Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat Alkohol-asam, dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga menghasilkan warna merah.
Pewarnaan Struktural atau khusus
untuk mewarnai struktur khusus dari bakteri seperti kapsul, spora, flagel dan nukleolus. Pewarnaan Diferensial/Pewarnaan Gram
metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding selnya. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853– 1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
2. Mengapa bakteri gram positif bisa tewarnai biru ungu sedangkan bakteri gram negatif terwarnai merah muda ?
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras
mikroorganisme dengan sekitarnya.
Pewarnaan ini dapat membagi bakteri menjadi gram positif dan gram negatif berdasarkan kemampuannya untuk menahan pewarna primer (kristal ungu) atau
kehilangan warna primer dan menerima warna tandingan (safranin). Bakteri gram positif menunjukkan warna biru atau ungu dengan pewarnaan ini (gambar I.11), sedangkan bakteri gram negatif menunjukkan warna merah.
Perbedaan reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma dan bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteri-bakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau gram.
Proses pewarnaan gram dimulai setelah dilakukan fiksasi pada olesan, kemudian ditetesi dengan kristal violet dan dibiarkan. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan sampai kering (dengan cara dianginkan). Pencucian dengan air bertujuan untuk
mengurangi kelebihan zat warna dari violet kristal. Setelah kelebihan zat warna dicuci dengan air kemudian diberi larutan iodin dan dibiarkan sehingga terbentuk suatu
kompleks antara violet kristal dan iodin. Olesan bakteri kemudian dicuci kembali dengan air mengalir. Kemudian dicuci dengan etanol dan dicuci kembali dengan air mengalir. Pewarnaan selanjutnya dengan menggunakan safranin dan diamkan. Kemudian cuci dengan air mengalir dan kering dianginkan, kemudian diamati dibawah mikroskop. Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Pemberian alkohol (etanol) pada praktikum pewarnaan bakteri,
menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya
terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori – pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan lipid dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol dapat hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikannya tipis (1-3 nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. · Dinding selnya mengandung lemak lebih
banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
· Lapisan kaku, tidak mengandung asam tekoat.
· Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
· Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
· Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relative sederhana.
· Tidak resisten terhadap gangguan fisik. · Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih
pekat
· Peka terhadap streptomisin · Toksin yang dibentuk Endotoksin Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
·
Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. · Dinding selnya mengandung lipid yang
lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal.
· Mengandung asam tekoat.
· Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. · Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh
zat-zat warna seperti ungu kristal.
· Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
· Lebih resisten terhadap gangguan fisik. · Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut · Tidak peka terhadap streptomisin
· Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
3. Contoh Bakteri gram positif dan gram negatif ?
1. Mengapa perlu dilakukan pengocokan tabung reaksi berisi biakan sebelum diambil ?
Hal ini bertujuan agar tidak ada endapan bakteri di bagian bawah tabung.
2. Mengapa pada media padat perlu ditambahkan air steril sedangkan pada media cair tidak?
Pada media padat, perlu ditambahkan air steril karena sel-sel pada medium padat cenderung melekat dengan sesamanya, sehingga jika tidak diberi air steril, bakteri akan saling tumpang tindih dan hal ini yang menyulitkan pengamatan. Sedangkan pada media cair tidak perlu ditambahkan air steril karena sel-sel bakteri dalam medium cair dapat bergerak bebas dan tidak melekat dengan sesamanya, sehingga tidak diperlukan lagi air steril seperti media padat.
3. Apa yang Anda ketahui tentang fiksasi ?
Fiksasi adalah proses pengawetan dan pelekatan atau penempelan struktur sel
mikroorganisme pada suatu posisi. Selain itu fiksasi juga berfungsi untuk menonaktifkan enzim lytic sehingga bakteri tidak mengalami lisis dan berubah bentuk pada saat
diamati. Fiksasi dilakukan setelah olesan pada kaca preparat sudah kering. Jika olesan belum kering akan menyebabkan sel-sel mikroorganisme yang bersangkutan menjadi tidak beraturan bentuknya. Tujuan dari fiksasi adalah pelekatan bakteri supaya pada saat pencucian, bakteri tersebut tidak ikut hilang tercuci. Fiksasi yang digunakan pada
percobaan kali ini adalah fiksasi panas, yaitu dengan cara melewatkan kaca preparat di atas api. Fiksasi dilakukan sampai kaca preparat terasa hangat apabila ditempelkan pada
punggung tangan. Fiksasi yang dilakukan tidak boleh terlalu panas dan lama, karena bakteri yang ada pada preparat bisa hangus terpanggang dan terjadi perubahan bentuk dan penyusutan sel.
4. Apa fungsi pewarna ungu kristal dan apa konsekuensi jika proses pewarnaan terlalu lama atau cepat ?
Zat pewarna ini berfungsi untuk memberikan warna ungu pada semua bakteri. Proses yang dilakukan selama 1 menit, karena jika terlalu lama maka warna ungu ini akan menembus dinding sel, sehingga akan sulit membedakan gram positif dan negatif. Tetapi jika kurang dari 1 menit, zat warna ungu akan kurang melekat sehingga akan
menyulitkan pengamatan.
5. Apa fungsi iodin gram?
Iodine gram sering disebut dengan zat mordan. Zat mordan sendiri adalah zat yang dapat membuat zat warna terikat lebih kuat pada jaringan sel dengan membentuk kompleks iodine-violet. Selain itu, penambahan iodine gram bertujuan agar sel-sel bakteri akan dapat diwarnai lebih intensif dan akan menyebabkan pewarna terikat lebih kuat pada jaringan sel.
6. Apa fungsi ethanol dan apakah bisa diganti dengan zat lain , sebut beserta alasannya ?
Penambahan etanol 95% ini berfungsi untuk memucatkan warna ungu kristal pada kaca preparat yang sudah menempel pada olesan bakteri tersebut. Selain digunakan etanol sebagai pemucat, dapat juga digunakan zat lain yang dapat melarutkan kompleks ungu-iodium, contohnya aceton. Namun, aceton merupakan pemucat yang bekerja paling cepat sehingga dikhawatirkan akan terjadi pemucatan yang berlebihan. Pemucatan ini akan mengakibatkan bakteri gram negatif kehilangan warnanya dan kembali menjadi tak berwarna, namun bakteri gram positif tetap berwarna ungu/ biru.
7. Apa fungsi safranin dan mekanismenya sehingga bisa dibedakan antara gram positif dan gram negatif ?
Safranin merupakan pewarna tandingan yang akan memberikan warna merah muda pada bakteri. Setelah digenangi dengan pewarna tandingan, olesan dibilas dengan aquades. Bakteri gram negatif yang tidak berwarna kemudian akan menyerap warna ini sehingga berwarna merah muda sedangkan bakteri gram positif yang telah berwarna ungu/biru tidak akan menyerap warna ini (warna merah muda dari safranin). Hal ini disebabkan karena adanya perbedaan struktur dinding sel bakteri gram positif dan bakteri negatif, dimana bakteri gram positif mempunyai dinding sel yang lebih tebal dan mengandung sedikit lipid dibandingkan dengan dinding bakteri gram negatif yang mengandung banyak lipid. Ketika pemucatan dinding sel yang tebal pada bakteri gram positif akan mengalami penyusutan oleh perlakuan alkohol karena terjadinya dehidrasi, yang menyebabkan pori-pori dinding sel menutup dan mencegah terlarutnya warna ungu kristal-iodium pada langkah pemucatan. Sedangkan sel bakteri gram negatif mempuyai
kandungan lipid yang lebih tinggi dari pada dinding selnya. Dan lipid pada umumnya mudah larut pada pelarut yang polar seperti alkohol ataupun aseton. Dengan larutnya lipid pada dinding sel bakteri gram negatif akan memperbesar pori-pori dinding sel sehingga warna ungu kristal-iodium akan lebih mudah hilang pada saat langkah pemucatan.
8. Berapakah perbesaran yang dipakai untuk pengamatan bakteri dan apa alasannya ?
Pengamatan dilakukan dengan mikroskop dengan perbesaran 1000x. Hal ini dikarenakan ukuran bakteri yang sangat kecil, jika menggunakan perbesaran biasa, akan menyulitkan pengamat dalam pengamatan bakteri.
9. Mengapa pada saat pengamatan perlu diberikan minyak imersi antara preparat dan lensa objektif ?
Hal ini dikarenakan, cahaya yang datang dibiaskan melalui 2 medium yang berbeda, yaitu udara dan kaca. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu bahan yang mampu
membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal. Bahan yang mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal adalah minyak imersi. Selain itu, minyak imersi juga mempunyai indeks bias yang mendekati atau identik dengan kaca.
10. Faktor-faktor apa saja yang dapat membuat bakteri gram positif dapat menjadi gram negatif begitupun sebaliknya !
a. Metode dan teknik yang digunakan Pemanasan yang berlebihan selama fiksasi, dekolorisasi yang berlebihan dengan alkohol, dan bahkan pembilasan dengan air yang terlalu banyak pada tiap langkah dapat menyebabkan bakteri gram positif kehilangan kompleks kristal violet-iodine.
b. Umur dari biakan Biakan dengan umur lebih dari 24 jam akam kehilangan kemampuan untuk menahan kompleks kristal violet-iodine.
c. Organisme itu sendiri Beberapa bakteri gram positif lebih dapat menahan kompleks kristal violet-iodine dibandingkan dengan lainnya.
d. Perubahan keasaman. Bila pH turun kemungkinan bakteri gram positif dapat berubah menjadi gram negatif. Sebaliknya bila pH naik ada kemungkinan bakteri-bakteri gram dapat berubah menjadi gram positif.
e. Faktor medium Misalnya bakteri-bakteri gram positif yang lemah bila terlalu lama ditumbuhkan dalam medium yang mengandung bahan yang mudah difermentasi dapat berubah menjadi gram negatif.
f. Kerapatan sel pada olesan Semakin rapat suatu sel bakteri akan semakin sukar hilangnya warna ungu kristal pada saat langkah pemucatan, oleh karena itu pada saat diberi warna tandingan sel bakteri tetap berwarna ungu, padahal bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif.
