ABSTRAK
Amplifikasi in vitro Gen Pengkode Penisilin V Asilase dari Bacillus sp. Strain BAC4
Kethy Nadia Sepwinda, 2001. Pernbimbing : Sylvia Soeng, dr.; Philips O., S.Si.,M.Si
Penggunaan antibiotika penisilin secara luas untuk mengobati penyakit infeksi bakteri, mengakibatkan timbulnya gejala resistensi. Gejala resistensi ini diakibatkan
oleh adanya inaktivasi penisilin oleh enzim Penisilinase Salah satu
usaha untuk mengatasi gejala tersebut adalah mencari antibiotika jenis baru turunan penisilin yang lebih efektif, yang dapat diperoleh dengan membuat penisilin semisintetik dengan perantaraan senyawa 6-Aminopenisilanat (6-MA). Pada
peneilitan ini telah dilakukan upaya mengamplifikasi gen pengkode Penisilin V
Asilase pada Bacillus sp.strain BAC4 dengan menggunakan teknik PCR. DNA
kromosom Bacillus sp. Strain BAC4 diisolasi, dilanjutkan dengan amplifikasi DNA
kromosom tersebut menggunakan teknik PCR. Primer-primer yang digunakan dalam
proses amplifikasi adalah primer Bact F1 (Forward): 5'- CCC ATA TGT GCA CAA
GTC TTA CAT TGG AAA - 3 ' , dan primer Uni B1 (Reverse) : 3' - AAG GCC TTA
ATT AAG CTC ATG AAT ACT CTC - 5' Siklus PCR yang dilakukan adalah :
denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit, annealing selama 1-1,5 menit,
dan extension 72°C selama 1 - 1,5 menit sebanyak 30-35 siklus. Tahap selanjutnya adalah elektroforesis untuk melihat hasil PCR dengan menggunakan gel agarosa
1,5%. Hasil senantiasa berupa smear. Dengan demikian, dapat disumpulkan bahwa
penelitian ini belum menghasilkan pita yang spesifik fragmen gen DNA dari Bacillus
ABSTRACT
In vitro AmpIification of Coding Gene Penicillin V Acylase from Bacillus sp.
Strain BAC4
Kethy Nadia Sepwinda, 2001. Tutors : Sylvia Soeng, dr. ; Philips O., S.Si., M.Si.
The extended use of penicillin to cure bacterial infection has resumed on
resistance. This is due to the inactivation of peniciliin by the enzyme Penicillinase
- lactamase). One of the attempts to overcome the resistance is to find new
penicillin derived antibiotics which are more effective, which can be obtained
through the production of semisynthetic penicillin using - aminopenicillanic
acid (6 - APA) as the precursor. Effort to amplify PVA gene of Bacillus sp. Strain
BAC4 using PCR technique has been performed. The steps were Bacillus sp.
Strain BAC4 chromosomal DNA isolation, followed by amplification using PCR
Lampiran 2 . . . . .
Riwayat Hidup
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1. Struktur Kimia Penisilin ... 06
Gambar 4.1. Hasil PCR ... 16
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Lampiran Alat . . .
Lampiran 2 Lampiran Bahan . . .
... 20
Penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri merupakan salah satu masalah
kesehatan di Indonesia Pengobatan penyakit infeksi ini dapat dilakukan dengan
pemberian obat-obat antibiotika, misalnya penisilin. Penisilin adalah antibiotik
pertama yang ditemukan oleh Alexander Fleming pada tahun 1929. Sifat toksisitas
penisilin yang rendah dan aktivitas antibakteri yang sangat efektif (Abraham et
al,1941; Florey & Florey,1943) menyebabkan penggunaannya meluas di seluruh
dunia
Penggunaan penisilin yang meluas menimbulkan dampak yang merugikan, yaitu
adanya
gejala resistensi. Gejala ini pertama kali ditemukan oleh Abraham dan Chain(1940), yaitu adanya inaktivasi Penisilin oleh enzim Penisilinase yang
dihasilkan bakteri.
Enzim
menghidrolisis struktur pada intipenisilin dan menghasilkan asam penisiloat yang tidak memiliki kemampuan
anti bakteri.
Salah satu usaha untuk mengatasi masalah resistensi ini adalah mencari antibiotik
baru turunan penisilin yang lebih efektif Penisilin G Asilase merupakan enzim yang
dapat menghidrolisis penisilin G menjadi senyawa 6-Aminopenisilanat (6-MA).
Senyawa 6-APA merupakan senyawa intermediet untuk menghasilkan senyawa
penisilin semisintetik yang baru (Valle et al,1986; Meevootisom & Saunders,1987;
Martin et al., 1995). Usaha memintesis Penisilin
ini
dimaksudkan untukmendapatkan jenis penisilin yang memiliki potensi yang lebih tinggi, stabil dalam
suasana asam maupun basa, dan memiliki efek samping yang rendah (Crueger &
Crueger, 1984).
Dasar pembentukan 6-APA oleh mikroorganisme adalah melalui hidrolisis
enzimatis yang melibatkan perubahan substrat penisilin, misalnya penisilin G. Cara
enzimatis ini dapat memberikan hasil konversi yang lebih cepat serta spesifisitas
katalisis yang tinggi. Selain itu, penerapan teknologi enzim juga memungkinkan
pengontrolan reaksi sesuai dengan yang diinginkan (Carrington, 1971).
Bacillus sp. Strain BAC4 merupakan bakteri strain lokal yang diketahui
menghasilkan Penisilin G Asilase yang paling tinggi di antara 10 isolat dari 160 isolat
yang berhasil diisolasi
dari
berbagai daerah di Indonesia Bakteri ini termasuk Grampositif, berbentuk batang dengan pH dan suhu optimum untuk pertumbuhan dan
produksi Penisilin G Asilase adalah 7 & C (Syamsuriputra,l995). Bacillus sp.
strain BAC4 mampu memproduksi Penisilin G Asilase (PGA) secara ekstraseluler
sehingga jenis mikroba ini dipertimbangkan untuk dimanfaatkan sebagai sumber
yang dapat direkayasa. Untuk keperluan rekayasa tersebut dilakukan penelitian
mengenai karakterisasi gen pga (Ratnaningsih et al., 1999) dengan mengamplifikasi
gen tersebut menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction).
Dari hasil uji aktivitas Penisilin Asilase diperoleh bahwa Bacillus sp. strain BAC4
selain memiliki aktivitas Penisilin G Asilase, juga menunjukkan aktivitas Penisilin
V
Apakah gen pengkode Penisilin
V
Asilase dari Bacillus sp. Strain BAC4 dapatdiamplifikasi dengan primer-primer yang disintesis berdasarkan
urutan
nukleotidagen Penisilin V Asilase Bacillus subtilis ?
13. Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengamplifikasi gen pengkode Penisilin
V
Asilasedari Bacillus sp. Strain BAC4 dengan menggunakan teknik PCR.
1.4. kegunaan penelitian
Usaha amplifikasi gen pengkode Penisilin V Asilase dari Bacillus sp. Strain BAC4 dapat digunakan sebagai langkah awal untuk melakukan penelitian lanjutan penentuan Urutan nukleotida gen ini dan untuk memproduksi enzim Penisilin Asilase
yang sudah direkayasa secara genetik, sehingga dapat digunakan untuk membuat
antibiotika semisintetik turunan penisilin yang baru, yang dapat digunakan untuk
mengatasi masalah resistensi yang sedang berkembang saat ini.
1.5. Metodologi Penelitian
Eksperimental eksploratif
1.6. Lokasi dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengembangan
Ilmu
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1. Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa
amplifikasi gen pengkode Penisilin V Asilase dari DNA kromosom bacillus sp. Strain BAC4 secara in vitro, dengan teknik PCR menggunakan primer yang disintesis berdasarkan urutan nukleotida gen Penisilin V Asilase Bacillus subtilis,
belurn rnemberikan hasil
5.2. Saran
Untuk memperoleh hasil yang lebih baik perlu dilakukan reamplifikasi dengan
menggunakan primer-primer baru yang berbeda dari ptinier-primer yang digunakan dalam penilitian ini. Primer baru yang lebih spesifik tersebut dapat diperoleh melalui perancangan primer-primer berdasarkan data GenBank yang
sudah ada
Selain dengan mencari primer-primer baru yang lebih spesifik, reamplifikasi juga sebaiknya dilakukan dengan mencari kondisi PCR yang lebih tepat.
DAFTAR PUSTAKA
to Menthod and Applications, Academic Press, Inc., California, 3-12.
Khiong. 1999.
Hibridisasi
Genom Bacillus sp. Strain BAC4 menggunakan“Probe” Gen Pengkode PeniSilin G Asilase. Tesis Magister. Bidang Khusus
Genetika dan Biologi Molekuler Program Studi Biologi. Program Pascasarjana. Institut Teknologi Bandung.
Mahajan, P.B. 1984. Review Penicillin Acylase. Appl. Biochem & Biotech.
Humania Press Inc.
Martin, L., Prieto, M.A., Cortes, E., dan Garcia, J.L. 1995. Cloning
and
sequencing of the PAC gene and
coding
the penicillin G acylase of Bucillusmegaterium ATCC 14945. Fems Microbiology Letters, 125: 287-292.
Meevotisom, V., dan Saunders,
J.R.
1987. Cloning and expression of penicillinacylase gene from overproducting strains of Escherichia coli and Bacillus
megaterim. Applied and Microbiology Biotechnology, 25: 372-378.
Mosher, H.Roy, Leo,C., Vining. 1992. Antibiotic Resistance. Encyclopedia of Microbiology. I:97-106.
strain of Bacillus sp: culture enzyme, purification, and
PCR
experiments employing primers derivedfrom
B. megaterium pga gene. Annual report I.Graduate team Research Grant. URGE Project Directorate General of Higher Education Ministry of Education and culture. Indonesia.
Riniati.
1999. Usaha amplifikasi dan kloning fragmen gen penisilin G asilaseBacillus sp.
BAC4
strain lokal. Tesis Magister. Bidang Kimia Organik.Program Magister Kimia. Institut Teknologi Bandung.
sambrook, J., Fritsch, E.F.,
dan
Manniatis, T. 1989. Molecular cloning, Alaboratorium manual. edition Cold Spring Harbor Laboratories Press. Cold
Spring Harbor.
Soeng et al 2000. Determinasi Spesies Bacillus sp. Strain BAC Penghasil
Penisilin
Asilase
Secara Molekuler MenggunakanPCR.
Laporan Penelitian.Bagian Biologi. Fakultas
Kedokteran.
Universitas Kristen Maranatha.Syamsuriputra, A.A. 1993. Iden tifikasi, Penentuan Kondisi-kondisi Optimum
dan
Pemuliaan Isolat Bakteri Lokal BAC4 Penghasil Penisilin Asilase,
laporan
Mikrobiologi PAU ITB,
Laporan Akhir
Kegiatan Penelitian. 1992. Vol.2 Bandung.Utami et al. 2001. Spesifisitas substrat Bacillus sp. BAC, strain lokal penghasil