Kisaran Inang Potyvirus Isolat Nilam Bogor
Tanaman nilam sakit banyak terdapat di daerah Bogor yang memperlihatkan gejala mosaik dengan ciri-ciri hampir sama dengan yang pernah diutarakan oleh beberapa peneliti terdahulu (Natsuaki et al. 1994; Filho et al. 2002 dalam Sukamto et al. 2007). Hasil uji serologi menggunakan berbagai antiserum terhadap sampel tanaman nilam sakit yang bergejala mosaik memperlihatkan bahwa antiserum Potyvirus memberikan sinyal yang sangat kuat (Gambar 2). Hal ini menandakan bahwa sampel tanaman tersebut terinfeksi oleh Potyvirus. Oleh karena itu, penelitian diarahkan untuk mengetahui spesies Potyvirus yang berasosiasi dengan penyakit mosaik pada tanaman nilam di daerah Bogor tersebut.
Gambar 2 Hasil enzyme-linked immunosorbent assay menggunakan antiserum
Broad bean wilt virus (BBWV), Cucumber mosaic virus (CMV), Tobacco mosaic virus (TMV), dan Potyvirus terhadap sampel
tanaman nilam bergejala mosaik dan tanpa gejala yang dikoleksi dari daerah Bogor (Noveriza et al. 2010)
Virus tersebut berhasil diperbanyak pada tanaman nilam N2A1 hasil kultur jaringan koleksi rumah kaca Balittro. Berdasarkan pengamatan yang dilakukan selama 30 hari berturut-turut setelah inokulasi mekanik, muncul gejala mosaik pada tanaman nilam uji yaitu dua minggu setelah inokulasi Potyvirus.
Gejala yang tampak dari daun yang diinokulasi berupa gradasi warna hijau tua dan hijau muda (mosaik), klorosis, serta berkerut. Sedangkan, gejala yang tampak pada daun pucuk berupa gradasi warna hijau tua dan hijau muda (mosaik), mengeras, berubah bentuk (malformasi), serta terpilin. Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa gejala awal berupa mosaik ringan yang kemudian menjadi mosaik parah, terpilin, maupun malformasi daun. Gejala penyakit merupakan aspek yang sangat penting untuk menentukan tindakan pengendalian penyakit (Akin 2006). Pada penelitian ini, telah dilakukan ELISA untuk mendeteksi adanya Potyvirus pada tanaman nilam asal Bogor menggunakan antiserum
Potyvirus. Hasil yang diperoleh dari deteksi dengan ELISA tersebut
menunjukkan bahwa sepuluh sampel tanaman nilam yang diuji menunjukkan gejala positif terinfeksi Potyvirus berupa gejala mosaik (Gambar 3a).
Gambar 3 Gejala yang muncul pada tanaman nilam N21 (a), C. amaranticolor (b), dan C. quinoa (c) setelah diinokulasi mekanik dengan Potyvirus isolat nilam Bogor
Pengetahuan tentang keragaman gejala yang ditimbulkan oleh suatu virus pada beberapa spesies tanaman diperlukan untuk mempermudah identifikasinya (Akin 2006). Spesies tanaman yang sering digunakan sebagai tanaman indikator tersebut antara lain C. quinoa, C. amaranticolor, mentimun (C. sativus), kacang panjang (V. sinensis), kedelai (G. max), D. metel, G. globosa, cabai (C. annum),
N. benthamiana, dan tomat (L. esculentum). Pada penelitian ini, terdapat
beberapa tanaman indikator yang menunjukkan gejala positif terinfeksi Potyvirus
setelah diinokulasi mekanik, yaitu C. amaranticolor, C. quinoa, dan
N. benthamiana. Setelah dua minggu diinokulasi gejala yang tampak pada C. amaranticolor berupa gejala lesio lokal nekrotik kemerahan pada daun yang
diinokulasi (Gambar 3b). Gejala yang tampak pada C. quinoa berupa gejala lesio lokal klorotik pada daun yang diinokulasi (Gambar 3c). Sedangkan, gejala yang tampak pada N. benthamiana berupa daun yang kekuningan disertai klorosis secara sistemik. Sedangkan tanaman mentimun, kacang panjang, kedelai,
D. metel, G. globosa, cabai, dan tomat yang juga diinokulasi tidak
memperlihatkan gejala dan tidak terdeteksi adanya infeksi Potyvirus berdasarkan uji ELISA. Kisaran inang Potyvirus pada penelitian ini agak berbeda dengan
Potyvirus yang diteliti oleh Sukamto et al. (2007) (Tabel 4). Pada penelitiannya,
Sukamto et al. (2007) belum mengidentifikasi spesies virus sehingga belum dapat dipastikan Potyvirus yang terdapat pada penelitian ini merupakan salah satu strain atau spesies yang berbeda dengan Potyvirus yang diteliti Sukamto et al. (2007). Tabel 4 Gejala yang muncul pada berbagai tanaman indikator setelah diinokulasi
mekanik dengan Potyvirus Spesies tanaman
Gejala (Uji)
Gejala (Sukamto et al. 2007) Lokal Sistemik Lokal Sistemik
Chenopodium amaranticolor Nekrotik - Klorotik -
Chenopodium quinoa Klorotik - Klorotik Gomphrena globosa - - Klorotik -
Kacang panjang (Vigna
sinensis) - - Klorotik -
Nicotiana benthamiana - Mosaik - Mosaik
Cabai (Capsicum annum) - - nt nt
Datura metel - - nt nt
Kedelai (Glycine max) - - nt nt
Mentimun (Cucumis sativus) - - nt nt Tomat (Lycopersicon
esculentum) - - nt nt
Nicotiana tabacum nt nt - Mosaik Phaseolus vulgaris nt nt - -
Mentha sp. nt nt - -
Keterangan: - : tidak memperlihatkan gejala dan tidak terinfeksi Potyvirus setelah diuji ELISA; nt: tidak diuji
Amplifikasi Gen Coat Protein Virus
Tanaman nilam asal Bogor dengan nomor sampel N4, N5, dan N6 merupakan sampel nilam yang mempunyai nilai absorbansi ELISA tinggi (data tidak diperlihatkan) sehingga digunakan sebagai sampel untuk amplifikasi gen CP Potyvirus. Amplifikasi dengan teknik RT-PCR menggunakan pasangan primer CPUP-F dan CP9502-R berhasil mendapatkan fragmen nukleotida
Potyvirus dengan ukuran sekitar 800 bp (Gambar 3; lajur N4, N5, dan N6).
Fragmen DNA hasil PCR selanjutnya digunakan dalam sikuen nukleotida. M K(-) K(+) N4 N5 N6
Gambar 4 Hasil amplifikasi DNA genom virus pada daerah gen coat protein dengan metode RT-PCR menggunakan pasangan primer CPUP(F) dan CP9502(R) terhadap sampel daun tanaman nilam (lajur N4, N5, dan N6) yang bergejala mosaik, lajur K(-) dan K(+) adalah masing-masing kontrol negatif dari tanaman sehat dan kontrol positif dari tanaman sakit (Noveriza et al. 2010) dan lajur M adalah marker 100 bp DNA
ladder
Sikuen Nukleotida Gen Coat Protein Virus
Produk RT-PCR (Gambar 4; lajur N5) berhasil disikuen dan sebagian sikuen nukleotida gen CP Potyvirus asal Bogor tersebut disajikan pada Gambar 5.
500 bp
Gambar 5 Alignment sikuen nukleotida sebagian gen coat protein (CP) Potyvirus asal Bogor, Telosma mosaic virus (TeMV) asal Hanoi, Passionfruit
woodiness virus (PWV) asal Thailand, Peanut stripe virus (PStV) asal
India, dan Patchouli mild mosaic virus (PatMMV) asal Filipina menggunakan program ClustalW [tanda * menunjukkan nukleotida yang identik]
Terhadap hasil sikuen nukleotida tersebut kemudian dilakukan blast pada www.ncbi.nlm.nih.gov untuk memetakan spesies-spesies Potyvirus yang mempunyai kedekatan dengan Potyvirus isolat nilam Bogor. Berdasarkan www.ncbi.nlm.nih.gov terdapat beberapa spesies dari Potyvirus yang kemiripannya mendekati hasil sikuen tersebut antara lain, yaitu Telosma mosaic
virus (TeMV) asal Hanoi, Passionfruit woodiness virus (PWV) asal Thailand, Peanut stripe virus (PStV) asal India, dan Patchouli mild mosaic virus (PatMMV)
asal Filipina. Alignment sikuen nukleotida dengan Clustal W menunjukkan bahwa gen CP virus tanaman nilam asal Bogor memiliki homologi dengan virus-virus tersebut dan beberapa perbedaan nukleotida pada beberapa lokasi diperlihatkan pada Gambar 5.
Analisis Similaritas dan Filogenetika Potyvirus pada Tanaman Nilam
Analisis similaritas nilai penjajaran (alignment score) juga dilakukan untuk mengindikasikan kesamaan urutan nukleotida antar isolat virus. Hasil analisis tersebut menunjukkan bahwa sikuen gen CP isolat Potyvirus asal Bogor memiliki tingkat homologi dengan TeMV asal Hanoi, Vietnam sebesar 91,1% (Tabel 5). Tabel 5 Tingkat kesamaan sikuen nukleotida sebagian gen coat protein (CP)
Potyvirus isolat nilam Bogor dengan Telosma mosaic virus (TeMV)
asal Hanoi, Passionfruit woodiness virus (PWV) asal Thailand,
Peanut stripe virus (PStV) asal India, dan Patchouli mild mosaic virus
(PatMMV) asal Filipina menggunakan program Bioedit V.7.0.5
Berdasarkan data pada www.ncbi.nlm.nih.gov, TeMV adalah Potyvirus yang ditemukan menginfeksi secara alami Telosma cordata (famili Apocynaceae,
ordo Gentianales) yang merupakan tanaman hias asli Cina. Sedangkan tingkat homologi sikuen nukleotida gen CP Potyvirus asal Bogor
dengan PWV asal Thailand, PStV asal India, dan PatMMV asal Filipina masing-masing sebesar 89,1; 71,4; dan 37,3%. Menurut Fauquet et al. (2005) apabila terdapat persamaan sikuen nukleotida dari gen CP antara satu virus dengan virus yang lain dengan nilai lebih dari 90%, maka virus-virus tersebut merupakan
Isolat Virus No. Aksesi
Tingkat homologi (%) Potyvirus. Bogor TeMV. Hanoi PWV. Thailand PStV. India PatMMV. Filipina Potyvirus.Bogor - 100 TeMV.Hanoi DQ851493.1 91,1 100 PWV.Thailand AM409188.1 89,1 88,9 100 PStV.India AJ851894.1 71,4 74,8 76,2 100 PatMMV.Filipina NC003974.1 37,3 38,4 38,6 37,9 100
spesies virus yang sama. Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa Potyvirus asal Bogor ini merupakan salah satu isolat TeMV.
Analisis filogenetika pada kladogram menunjukkan kejelasan hubungan kekerabatan kelima Potyvirus tersebut (Gambar 6). Potyvirus asal Bogor paling dekat dengan TeMV asal Hanoi kemudian PWV asal Thailand, dan paling jauh dengan PStV asal India. PatMMV asal Filipina yang tergolong ke dalam genus
Fabavirus dan digunakan sebagai outgroup dalam analisis ini. Berdasarkan data
dari NCBI, PatMMV asal Filipina ini dilaporkan juga dapat menginfeksi tanaman nilam secara alami.
Gambar 6 Filogenetika kekerabatan Potyvirus isolat nilam Bogor, Telosma
mosaic virus (TeMV) asal Hanoi, Passionfruit woodiness virus
(PWV) asal Thailand, Peanut stripe virus (PStV) asal India, dan
Patchouli mild mosaic virus (PatMMV) asal Filipina berdasarkan
sikuen nukleotida sebagian gen coat protein (CP) menggunakan program Mega5.0
