IDENTIFIKASI ISOLAT RK2 BPPT CC DAN ISOLASI GEN
SELULASE
ANTIN FITRIANI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul berjudul Identifikasi Isolat RK2 BPPT CC dan Isolasi Gen Selulase adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2013
Antin Fitriani
ABSTRAK
ANTIN FITRIANI. Identifikasi Isolat RK2 BPPT CC dan Isolasi Gen Selulase. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan SISWA SETYAHADI
Selulase adalah enzim ekstraseluler yang dapat diproduksi oleh mikroorganisme. Enzim ini dapat menghidrolisis selulosa untuk menghasilkan glukosa. Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi isolat RK2 BPPT CC dan mengisolasi gen selulase dari isolat tersebut. Identifikasi isolat RK2 BPPT CC dilakukan menggunakan urutan basa gen penyandi 16S-rRNA. Isolasi gen selulase dilakukan dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) touchdown
menggunakan primer yang telah didesain. Primer yang didesain adalah primer
degenerated hasil alignment dari berbagai gen selulase yang berasal dari bakteri
yang bergenus sama. Analisis gen 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC menunjukkan bahwa isolat RK2 BPPT CC termasuk ke dalam genus Bacillus dan memiliki kekerabatan yang dekat dengan Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens). Isolasi gen selulase menghasilkan produk PCR yang spesifik sepanjang 1500 bp yang diduga sebagai gen selulase. Analisis sekuen nukleotida menunjukkan bahwa gen selulase isolat RK2 BPPT CC memiliki 99% kemiripan sekuensnya dengan gen selulase dari Bacillus subtilis (B. subtilis) dan B. amyloliquefaciens.
Kata kunci: gen selulase, 16S-rRNA, Bacillus, PCR touchdown
ABSTRACT
ANTIN FITRIANI. Identification of RK2 BPPT CC Isolate and Isolation of Cellulase Gene. Supervised by I MADE ARTIKA and SISWA SETYAHADI.
Cellulase is an extracellular enzyme produced by microorganism. This enzyme is able to hydrolize cellulose to produce glucose. The purpose of this research was to carry out of identification RK2 BPPT isolate and isolation of cellulase gene from this isolat. Identification of RK2 BPPT CC isolate was carried out based on sequence of 16S ribosomal RNA gene and isolation of cellulase gen was carried out using touchdown Polymerase Chain Reaction (PCR) methode using primer that has been designed. The primer has been designed is the degenerated primers based on alignment results of cellulase genes of bacteria of the same genus. Analysis 16S-rRNA gene showed that the RK2 BPPT CC isolate belongs to the genus of Bacillus and closely related to Bacillus amyloliquefaciens
(B. amyloliquefaciens) spesies. Isolation cellulase gene resulted a specific PCR
product along 1500 bp as a putative of cellulase gene. Nucleotide sequence analysis showed that the cellulase gene of RK2 BPPT CC isolate has 99% sequence-similarity to the celluase genes of Bacillus subtilis (B. subtilis) and
Bacillus amyloliquefaciens.
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
IDENTIFIKASI ISOLAT RK2 BPPT CC DAN ISOLASI GEN
SELULASE
ANTIN FITRIANI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Skripsi : Identifikasi Isolat RK2 BPPT CC dan Isolasi Gen Selulase Nama : Antin Fitriani
NIM : G84090010
Disetujui oleh
Dr Ir I Made Artika, M.App.Sc Pembimbing I
Dr Ir Siswa Setyahadi, M.Sc Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, M.App.Sc Ketua Departemen
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat-Nya penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini dengan baik dan lancar. Shalawat dan salam semoga selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW dan keluarganya.
Ucapan terima kasih terutama ditujukan kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc selaku dosen pembimbing utama dan Dr. Siswa Setyahadi M.Sc selaku pembimbing lapangan yang telah membimbing serta memberi saran dan kritik yang membangun. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Djamil S.Si, M.Si selaku Kepala Laboratorium Teknologi Bioindustri, Laboratorium Pengembangan Teknologi Agroindustri dan Biomedika (LAPTIAB), beserta staf Divisi Biokatalis, dan teman-teman Biokimia yang telah membantu selama pengumpulan data penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada kedua orang tua atas doa dan dukungan yang selalu diberikan.
Semoga tulisan ini bermanfaat dalam bidang ilmu pengetahuan khususnya biokimia serta memberikan kemaslahatan bagi masyarakat.
Bogor, Desember 2013
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 1
METODE 2
Bahan 2
Alat 2
Prosedur Analisis Data 3
HASIL DAN PEMBAHASAN 6
Hasil 6
Pembahasan 8
SIMPULAN DAN SARAN 11
Simpulan 11
Saran 11
DAFTAR PUSTAKA 12
LAMPIRAN 13
DAFTAR GAMBAR
1 Hasil elektroforesis DNA genom isolat RK2 BPPT CC 6 2 Hasil elektroforesis gen penyandi 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC 6 3 Hasil BLAST gen penyandi 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC 6
4 Pohon filogenetik isolat RK2 BPPT CC 7
5 Hasil elektroforesis amplifikasi gen selulase 7
6 Hasil BLAST gen selulase isolat RK2 BPPT CC 7 7 Prediksi model selulase isolat RK2 BPPT CC 8
DAFTAR LAMPIRAN
1 Diagram alir penelitian 13
2 Sekuensing gen penyandi 16S-rRNA pimer 27 f 14
3 Sekuensing gen penyandi 16S-rRNA pimer 1525 r 15 4 Susunan nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S-rRNA isolat
RK2 BPPT CC 16
5 Hasil alignment gen selulase Bacillus 16 6 Sekuensing gen selulase isolat RK2 BPPT CC primer forward 17 7 Sekuensing gen selulase isolat RK2 BPPT CC primer reverse 18 8 Susunan nukleotida hasil sekuensing gen penyandi selulase isolat RK2
BPPT CC 19
9 Alignment score selulaseisolat RK2 BPPT CC 19
PENDAHULUAN
Enzim selulase adalah enzim kompleks yang memotong secara bertahap rantai selulosa (Gerhartz 1990). Selulase merupakan o-glikosil hidrolasis (GHs) yang menghidrolisisi ikatan β-1,4-glikosidik dalam selulosa. Enzim ini mengkatalis proses selulolisis (hidrolisis selulosa) dan menghasilkan glukosa, selubiosa dan selooligosakarida (Sukumaran et al. 2005). Selulase dapat diklasifikasikan menjadi tiga kelas utama yaitu endoglukanase (endo-1,4-β -glukanase atau 1,4-β-D-glukan 4-glukanohidrolase) (EC 3.2.1.4), selobiohidrolase (ekso-1,4-β-glukanase atau 1,4-β-D-glukan selobiohidrolase) (EC 3.2.1.19), dan selobiase (β-glucosidase atau β-D-glukosida glukohidrolase) (EC 3.2.1.21) (Nguyen dan Quyen 2010).
Kebutuhan akan enzim selulase saat ini semakin meningkat, terutama untuk memenuhi kebutuhan bioenergi berupa bioetanol. Produksi bioetanol secara massal membutuhkan banyak sumber glukosa sebagai bahan baku utama. Glukosa tersebut akan terfermentasi dan menghasilkan bioetanol. Masalahnya ketersediaan glukosa tidak banyak namun ketersediaan selulosa justru melimpah terutama yang berasal dari limbah pertanian (Howard et al. 2003). Enzim selulase sangat dibutuhkan untuk menguraikan limbah selulosa menjadi monomer glukosa sehingga dapat digunakan untuk kebutuhan bioenergi. Selain itu, selulase juga banyak digunakan dalam berbagai bidang industri temasuk industri bahan kimia, bahan bakar, makanan, pembuatan bir, anggur, pulp dan kertas serta pertanian.
Mikroorganisme penghasil selulase dapat berupa kapang, bakteri atau aktinomisetes. Lingkungan hidup yang mengandung selulosa akan memacu mikroorganisme ini mensekresikan selulase. Mereka berlaku demikian karena menginginkan produk hasil hidrolisis selulosa oleh selulase yaitu glukosa. Glukosa akan digunakan sebagai sumber energi berupa sumber karbon (C). Selulase yang dihasilkan dari mikroorganisme kapang jenis Trichoderma dan
Aspergillus umumnya memiliki aktivitas lebih tinggi dibandingkan selulase yang
berasal dari bakteri. Meskipun demikian, selulase dari bakteri memiliki beberapa keunggulan, antara lain laju pertumbuhan bakteri lebih cepat, selulase dari bakteri juga kurang terinhibisi oleh material yang telah dihidrolisis, selain itu bakteri dapat beradaptasi dalam lingkungan yang ekstrim dan yang lebih menguntungkan adalah selulase dari bakteri lebih mudah dilakukan rekayasa genetika (Ariffin et al.
2006).
2
spesies bakteri sehingga dapat dipilih sebagai dasar untuk identifikasi (Richana et al. 2008). Isolasi dan amplifikasi gen selulase dilakukan menggunakan PCR
touchdown. PCR touchdown sering digunakan untuk proses PCR yang
menggunakan primer degenerated yaitu primer yang tidak spesifik karena memiliki dua atau lebih kemungkinan perbedaan urutan basanya. Primer
degenerated biasanya memiliki suhu annealing (suhu penempelan primer) yang
tidak pasti karena mengandung dua atau lebih urutan basa yang berbeda. Salah satu penyelesaian yang dapat dilakukakan adalah menggunakan teknik PCR
touchdown karena pada PCR ini suhu annealing akan mengalami penurunan di
setiap siklusnya. Teknik PCR ini pernah digunakan untuk mengamlifikasi sekuen cDNA yang mengkode LIF (Leukemia Inhibitor Factor) dengan suhu anealing
awal adalah 65 0C dan mengalami penurunan 1 derajat di setiap siklusnya selama 10 kali siklus hingga mencapai suhu annealing akhir 55 0C (Don et al. 1991).
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi isolat RK2 BPPT CC sehingga dapat dilakukan isolasi terhadap gen selulase dari bakteri tersebut. Setelah gen selulase berhasil diisolasi diharapkan dapat mempermudah penelitian lanjutan tentang rekayasa genetika sehingga dapat meningkatkan produksi dan aktifitas enzim selulase.
METODE
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
bactotryptone, yeast extract, NaCl dan agar yang digunakan untuk media
pertumbuhan sedangkan untuk isolasi dan amplifikasi DNA digunakan etilendiamintetraasetat (EDTA), HCl, NaOH, sodium dodesyl sulfate (SDS), lisozim, proteinase K, Na asetat, asam asetat glasial, isopropanol, etanol (70% 96% 100% ), tris-HCl, dapar TAE (Tris base, Asam asetat, dan EDTA), dapar tris-EDTA (TE), etidium bromide (EtBr), dNTP, primer selulase (telah didesain dan disintesis sebelumnya), marker 1 kb Plus DNA ladder, loading dye, aquabidestilata steril, aquadest, enzim Taq Polymerase, primer 16S-rRNA, agarose, dan DNA fragment extraction kit dari Geneaid..
Sampel yang digunakan adalah isolat RK2 BPPT CC sebagai sumber gen selulase. Bakteri isolat RK2 BPPT CC adalah bakteri koleksi Laboratorium Bioseparasi, LABTIAP, PUSPIPTEK, BPPT.
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
thermal cycler [Eppendorf Master Cycler Personal, Jerman], elektroforesis
[Mupid ex U Submarine Electrophoresis System], shaker [Koehner Shaker, Heidolph Unimax 1010], sentrifuge [Sorval Fresco, Cool Sertrifuge Hitachi CR-21G, Jepang, Eppendorf Mini Spin, Jerman], milipore [Simpak 1], pH meter, autoklaf [Iwaki Autoclave ACV-2450], kamera digital [Kodak DC 290 200m Digital Camera], neraca analitik [RAD WAG WAS 220/C/2], thermomixer
3 Consentrator 5301, Jerman], microwave [Sharp], oven, inkubator, magnetic stirrer,
lemari asam, pipet berukuran ml dan μl, tube eppendorf, tips pipet, falkon, dan alat-alat gelas.
Prosedur Analisis Data
Ekstraksi DNA Genom Isolat RK2 BPPT CC
Satu koloni tunggal dari bakteri yang telah ditumbuhkan dalam petri agar diinokulasikan dalam labu Erlenmeyer 250 ml yang berisi 25 ml Luria-Bertani (LB) cair. Kultur diinkubasi pada suhu 37 oC dan dikocok dengan kecepatan 120 rpm selama ±24 jam. Sel yang telah berumur 24 jam disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 4 oC. Supernatan dibuang secara aseptis dan pelet bakteri diresuspensi dengan dapar TE sebanyak 1250 μl dengan cara dipipet berulang-ulang. Suspensi bakteri disimpan dalam temperatur -80 ºC selama 1 jam. Pemecahan dinding sel dilakukan dengan penambahkan larutan lisozim 10 mg/ml sebanyak 125 μl ke dalam suspensi bakteri dilanjutkan dengan mencairkan suspensi bakteri beku tersebut pada temperatur ruang. Tabung yang berisi suspensi bakteri yang telah mencair kemudian ditaruh di dalam es selama 45 menit. Untuk tahap pelisisan sel ditambahkan larutan STEP sebanyak 250 μl dan diinkubasi pada temperatur 50 ºC selama 1 jam dengan sesekali dilakukan pengocokan. Tris-dapar fenol sebanyak 1500 μl ditambahkan dan dicampurkan perlahan selama 5 menit tanpa menggunakan vortex. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm dalam temperatur 4 ºC selama 15 menit untuk memisahkan lapisan DNA, lapisan DNA berada di lapisan bagian atas. Lapisan bagian atas dipindahkan ke dalam tabung eppendorf steril yang baru, pada tahap ini lapisan yang berada di bawah tidak boleh terambil. Selanjutnya dilakukan tahap presipitasi. Ditambahkan larutan Na asetat 3 N sebanyak 0,1 dari volume lapisan atas yang dipisahkan dan dicampurkan perlahan tanpa menggunakan vortex. Ditambahkan etanol 100% sebanyak dua kali dari volume terakhir dan diaduk dengan membolak-balik tabung. Untuk mengendapkan DNA dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm dalam temperatur 4 ºC selama 20 menit dan supernatan dibuang. Pelet DNA dibersihkan dengan ditambahkan sebanyak 0.5 ml etanol 70% ke dalam tabung eppendorf dan kocok perlahan baru kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 5 menit. Pelet DNA dikeringkan dalam konsentrator selama 15 menit dan kemudian dilarutkan dalam aquabidestila steril (ddH2O). DNA selanjutnya disimpan pada temperatur -20ºC
(Sambrook dan Russell 2001).
Elektroforesis Gel Agarosa dan Pemurnian DNA
Sebanyak 0.25 gram agarosa ditambah dengan 25 mL TAE 1x, lalu dipanaskan dalam microwave selama 2 menit. Setelah larut dengan sempurna, larutan tersebut dibiarkan sampai hangat, kemudian dituang ke dalam cetakan yang telah dilengkapi dengan sisir. Campuran tersebut didiamkan selama kira-kira 20 menit sampai gelnya benar-benar beku. Gel tersebut kemudian dimasukkan dalam alat elektroforesis dan direndam dengan bufer TAE 1x sampai terendam sempurna.
4
dari alat elektroforesis kemudian direndam dalam larutan EtBr selama 10 menit dan hasilnya dilihat dengan bantuan sinar Ultra Violet (UV). Profil DNA yang terlihat kemudian disimpan dalam perangkat dokumentasi gel (gel-documentation).
Perangkat dokumentasi gel adalah alat yang terdiri atas kotak berbahan metal tempat penyinaran sinar UV yang dihubungkan dengan kamera digital. Kamera digital tersebut terpasang pada komputer atau laptop yang sudah terdapat software
yang dapat menyimpan fotografi dari hasil elektroforeis. Dokumentasi gel berfungsi untuk mengambil foto gel hasil elektroforesis kemudian menyimpannya dalam bentuk data fotografi yang dapat dicetak. Hasil elektroforesis dipotong selanjutnya dilakukan pemurinan DNA.
Pemurnian DNA dilakukan mengguakan DNA fragment extraction kit sesuai dengan Protokol Geneaid. Sebayak ±300 mg potongan agar yang mengandung pita DNA dimasukkan ke tabung ependrof 1.5 ml dan ditambahkan 500 µL buffer lalu divortek. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 55-60 0C atau sampai agar benar-benar mencair. Setelah agar mencair dinginkan pada suhu ruang. Langkah selanjutnya tempatkan kolom DF pada 2 mL colection tube. Pindahkan 800 µL campuran sampel dari langka sebelumnya ke kolom, sentrifugasi 14-16000 xg selama 30 detik, buang larutannya dan tempatkan kembali kolom DF pada 2 mL
colection tube. Kemudian tambahkan 400 µL buffer W1 ke kolom DF dan
sentrifugasi 14-16000 xg selama 30 detik, buang larutannya dan tempatkan kembali kolom DF pada 2 mL colection tube. Setelah itu buffer pencuci yang mengandung ethanol ditambahkan ke dalam kolom dan biarkan dalam posisi tegak selama 1 menit, sentrifugasi 14-16000 xg selama 30 detik dan buang larutannya, tempatkan kembali kolom DF pada 2 mL colection tube. Sentrifugasi 14-16000 xg selama 30 detik untuk mengeringkan kolom. Kolom yang sudah kering dipindahkan ke tabung ependrof 1.5 ml dan ditambahkan 20-50 µL buffer elusi atau bauffer TE pada tengah-tengah kolom. Tabung dibiarkan dalam posisi tegak selama 2 menit atau sampai buffernya terserap dalam matriks. Tahap terakhir yaitu sentrifugasi 14-16000 xg selama 2 menit untuk memperoleh hasil pemurnian yang selanjutnya disimpan pada suhu -4 oC.
Identifikasi Bakteri Menggunakan Analisis Gen Penyandi 16S-rRNA
Tahap awal analisis 16S-rRNA dilakukan dengan teknik PCR. Sebanyak 1 μL DNA yang telah diisolasi dilarutkan dalam campuran berisi 18.5 μL Molecular
Water (MW), 2.5 μL Bufer B with Mg2+10X, 1 μL dNTPs, 1 μL primer forward,
1 μL primer reverse dan 0.2 μL Taq polymerase. Campuran tersebut kemudian dimasukkan dalam mesin PCR, proesesnya diawali dengan denaturasi pada suhu 94 oC selama 45 detik, annealing pada 61 oC selama 45 detik, dan suhu pemanjangan 72 oC selama 2 menit. Program ini dilakukan sebanyak 35 siklus. Proses PCR diakhiri dengan pemanjangan akhir pada suhu 72 oC selama 10 menit. Hasil amplifikasi diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1% dengan tegangan 110 volt selama 25 menit. Pita DNA yang terbentuk dibandingkan dengan marker.
Tahap selanjutnya adalah pemurnian hasil PCR menggunakan DNA
fragment extraction kit sesuai dengan Protokol Geneaid seperti yang telah
dilakukan sebelumnya. Hasil PCR yang telah dimurnikan dikirim ke First Base
sequencing service (Genetika Science) di Singapura untuk dilakukan sekuensing.
5
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) di situs http://www.ncbi.nlm.
nih.gov. Kekerabatan bakteri disajikan dalam bentuk gambar pohon filogenenetik yang dibuat dengan batuan program Phylogeny.fr. Program ini tersedia di situs http://www.phylogeny.fr/.
Desain Primer
Primer didesain secara manual menggunakan lima nukleotida penyandi gen selulase dari genus Bacillus yang diunduh di situs web http://www.ncbi.nlm. nih.gov dengan nomor akses masing-masing sekuen adalah HQ214668.1, DQ782954.1, KC477685.1, EF070194.1, dan CP000560.1. Sekuen dari kelima bakteri tersebut di-align selanjutnya diambil 15-25 di awal sebagai primer
forward dan 15-25 di akhir sebagai primer reverse. Untuk primer reverse
dilakukan reverse complement terlebih dahulu. Setelah sekuen primer diperoleh untuk mendapatkan temperature melting (Tm) masing-masing sekuen primer tersebut dimasukkan dalam situs online http://www.basic.northwestern.edu /biotools/OligoCalc.html.
Isolasi Gen Penyandi Selulase
Isolasi dan amplifikasi gen penyandi selulase dilakukan dengan teknik PCR. Total volume PCR yang digunakan adalah 20 μL dengan komposisinya 15.8 μL
MW (Molecular Water), 2. μL Buffer B with Mg2+, 0.4 μL dNTPs, 0.8 μL primer
forward, 0.8 μL primer reverse, 2 μL DNA yang telah diisolasi dan 0.2 μL Kappa
Taq polymerase. Campuran tersebut kemudian dimasukkan dalam mesin PCR.
Program PCR yang digunakan adalah PCR Touchdown. Tahap pertama diawali dengan denaturasi pada suhu 94 oC selama 1 menit. Kemudian dilanjutkan dengan
annealing pada suhu 54 oC selama 35 detik (suhu annealing ini akan turun
sebanyak 0.3 oC setiap siklusnya) dilanjutkan dengan suhu pemanjangan 72 oC selama 2 menit. Tahap pertama ini dilakukan sebanyak 25 siklus. Proses PCR tahap ke-2 diawali dengan denaturasi pada suhu 94 oC selama 1 menit, annealing
pada suhu 46 oC selama 35 detik dan dilanjutkan dengan suhu pemanjangan 72oC selama 2 menit. Tahap ke dua dilakukan sebanyak 9 siklus. Tahap pertama dan ke-2 diakhiri dengan pemanjangan akhir pada suhu 72 oC selama 10 menit. Hasil amplifikasi diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1% dengan tegangan 110 volt selama 25 menit. Pita DNA yang terbentuk dibandingkan dengan marker. Bagian gel yang menunjukkan adanya fragmen DNA hasil amplifikasi dipotong menggunakan pemotong steril dan dimasukkan dalam tabung mikro untuk dilakuakan pemurnian mengunakan DNA fragment extraction kit sesuai dengan Protokol Geneaid. Gen hasil pemurnian dikirim ke First Base sequencing service
(Genetika Science) di Singapura untuk dilakukan sekuensing. Hasil sekuensing digunakan untuk memverifikasi gen yang telah berhasil diisolasi dengan cara membandingkan sekuen yang diperoleh dengan sekuen bakteri lain menggunakan bantuan progam BLAST di situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Ekstraksi DNA Genom Isolat RK2 BPPT CC
Ekstraksi genom isolat RK2 BPPT CC menghasilkan DNA berukuran lebih dari 10000 bp (Gambar 1).
Gambar 1 Hasil elektroforesis DNA genom isolat RK2 BPPT CC Identifikasi Bakteri Menggunakan Gen Penyandi 16S-rRNA
Gen penyandi 16S-rRNA yang berada pada DNA genom isolat RK2 BPPT CC berhasil diamplifikasi dengan PCR. Produk PCR yang dihasilkan berukuran kurang lebih 1500 pb (Gambar 2).
Gambar 2 Hasil elektroforesis gen penyandi 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC Hasil sekuensing produk PCR gen penyandi 16S-rRNA ditampilkan pada Lampiran 4. Urutan basa nukleotida hasil sekuensing selanjutnya di-BLAST di situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov (Gambar 3). Hubungan kekerabatannya digambarkan dengan pohon filogenetik (Gambar 4).
7
Gambar 4 Pohon filogenetik isolat RK2 BPPT CC Desain Primer
Sepasang primer didesain untuk mengisolasi gen selulase dari DNA genom isolat RK2 BPPT CC. Primer forward yang berhasil didesain adalah 5’-ATGAAACGGTCAATYTC-3’ dengan Temperature melting (Tm) 45.4 oC. Simbol Y dalam primer tersebut mewakili nukleotida timin atau sitosin untuk
degenerate primer sesuai dengan keterangan simbol di situs online
http://www.basic.morthwestern.edu/biotool/OligoCalc.html. Primer reverse yang berhasil didesain adalah 5’CTAATTTGGTTCTGTTCC-3’ dengan Tm 45.2 oC. Isolasi Gen Penyandi Selulase
Gen selulase diisolasi dan diamplifikasi dari DNA genom isolat RK2 BPPT CC menggunakan PCR. Hasil elektroforesis produk PCR nya ditampilkan pada Gambar 5. Berdasarkan gambar tersebut ukuran gen selulase berkisar 1500 pb.
Gambar 5 Hasil elektroforesis amplifikasi gen selulase
Gen selulase disekuensing untuk mengetahui urutan nukleotidanya (Lampiran 7). Urutan nukleotida yang diperoleh di-BLAST untuk memverifikasi gen yang diisolasi adalah gen selulasae (Gambar 6).
8
Urutan nukleotida gen selulase yang berhasil diperoleh ditranslasi menjadi urutan asam amino dengan bantuan porgram Translate tool di situs web http://web.expasy.org/translate/. Hasil translasi dari sekuen gen selulase ditampilkan pada Lampiran 10. Urutan asam amino gen selulase digunakan untuk memprediksi model struktur selulase isolat RK2 BPPT CC dengan program pemodelan dari situs http://swissmodel.expasy.org. Selanjutnya hasil pemodelannya dianalisis dengan bantuan program Viasual Molecular Dynamics
(VMD) (Gambar 7). Template yang digunakan adalah selulase dari B. subtilis 168 dengan nomor akses 3PZT.
Gambar 7 Prediksi model selulase isolat RK2 BPPT CC menggunakan program VMD
Pembahasan
Ekstraksi DNA Genom Isolat RK2 BPPT CC
Proses ini dilakukan untuk mengisolasi DNA genom dari isolat bakteri yang nantinya akan digunakan sebagai DNA cetakan untuk proses amplifikasi gen yang dibutuhkan. Proses ekstraksi DNA genom diawali dengan homogenisasi jaringan yang dilakukan dengan menginokulasikan koloni tunggal dalam media pertumbuhan berupa LB cair. Homogenisasi dilakukan untuk meningkatkan jumlah sel identik yang akan dipanen. Selanjutnya untuk mengeluarkan DNA dari dalam sel, dinding sel perlu dihancurkan terlebih dahulu. Metode umum yang digunakan pada bakteri adalah dengan bantuan enzim lysozyme. Enzim ini akan memotong peptidoglikan yang merupakan komponen utama pada dinding sel (Clark dan Pazdernik 2009). Selanjutnya penambahan larutan STEP (SDS, Tris-Cl, EDTA dan proteinase K) bertujuan meningkatkan permeabilitas membran sel dan merusak proteinnya. SDS akan merusak dinding sel dengan cara menghilangkan molekul lipid pada membran sel sedangkan EDTA akan mengkelat ion magnesium yang penting dalam menjaga struktur dinding sel dan merupakan kofaktor enzim-enzim selular perusak DNA (Brown 1991).
9 membiarkan asam nukleat (DNA dan RNA) tetap dalam larutan (Brown 1991). Hasil ekstrak genom yang masih kotor dimurnikan menggunakan DNA
fragment extraction kit. Keberhasilan ekstrak genom dapat divisualisasikan
menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%. Hasil dokumentasinya ditampilkan pada Gambar 1. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa ukuran DNA genom isolat RK2 BPPT CC di atas 10000 pb karena posisi pitanya berada di atas marker. Gambar hasil dokumentasi menunjukkan pita tunggal yang cukup bersih yang menandakan jumlah pengotor yang sedikit.
Ukuran DNA genom suatu organisme sangat bervariasi tergantung pada kerumitan organisme tersebut. Organisme prokariot umunya memiliki genom yang lebih kecil, baik pada pasangan basanya maupun jumlah gennya dibandingkan organisme eukariot. Menurut penelitian Kunst et al. (1997) bakteri
B. subtilis memiliki ukuran 4214810 pb yang mengkode 4100 protein. Bakteri
Bacillus thuringiensis, berdasarkan pola restriksinya diprediksi memiliki ukuran
DNA genom sekitar 1100-2600 kpb (Saputra 2008). Ukuran genom terbesar dari organisme prokariot dimiliki oleh mikroba Amoeba dubia yang memiliki ukuran genom lebih dari enam milyar pasang basa (Cavalier-Smith 1985).
Identifikasi Bakteri Menggunakan Gen Penyandi 16S-rRNA
Bakteri diidentifikasi meggunakan gen penyandi 16S-rRNA. 16S-rRNA merupakan salah satu bagian dari 30S subunit ribosom prokariot yang disandi oleh DNA sepanjang ±1500 pb. Identifikasi menggunakan gen penyandi 16S-rRNA dipilih karena sifatnya yang spesifik untuk masing-masing spesies bakteri dan merupakan daerah yang urutan basanya sangat konservatif secara evolusi. Daerah konservatif tersebut dapat digunakan sebagai situs pelekatan primer sehingga gen penyandi 16S-rRNA dapat disiolasi dan diidentifikasi untuk membedakan suatu organisme ke dalam taksa yang lebih rendah seperti genus dan spesies (Richana et al. 2008).
Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen ini adalah primer yang telah digunakan oleh Weisburg et al. (1991), yaitu: primer forward, 16S-27f (5’GAGTTTGATCCTGGCTCA G-3’) dan primer reverse, 16S-1525r (5’AGAAAGGAGGTGATCCAGGC-3’). Hasil dokumentasi gen penyandi 16S-rRNA dari isolat RK2 BPPT CC yang telah dimurnikan ditampilkan pada Gambar 2. Pemurnian dilakukan untuk menghilangkan komponen-komponen sisa PCR yang dapat mengganggu proses sekuensing.
Sekuensing dilakukan terhadap primer forward (16S-27f) dan primer
reverse (16S-1525r). Hasil sekuensing dikoreksi berdasarkan kromatogram
menggunakan bantuan program BioEdit sehingga diperoleh urutan nukleotida yang lebih akurat. Berdasarkan primer yang digunakan nukleotida yang dihasilkan sebenarnya berukuran 1498 pb. Akan tetapi, saat awal pembacaan sekuensing sekitar 20 pb tidak dapat terbaca dengan baik karena reaksi kimianya belum stabil sehingga sekitar 40 pb tidak digunakan. Setelah dikoreksi diperoleh urutan nukleotida sepanjang 1442 pb (Lampiran 4). Urutan nukleotida yang telah diperoleh selanjutnya digunakan untuk mencari kemiripan sekuennya dengan
database dari GeneBank menggunakan program BLAST di situs
10
program Phylogeny.fr. Berdasarkan pohon filogenetiknnya (Gambar 4) isolat RK2 BPPT CC mempunyai jarak kekerabatan paling dekat dengan B. amyloliquefaciens.
B. amyloliquefaciens memang memiliki kekerabatan yang sangat dekat
dengan B. subtilis. Bahkan sampai tahun 1980-an B. amyloliquefaciens masih satu spesies dengan B. subtilis hingga akhirnya pada tahun 1987 kedua spesies tersebut berhasil dibedakan menggunakan beberapa cara seperti kromatografi gas-cair firolisis, analisis perbedaan ciri-ciri fenotip dan berdasarkan profil elektroforesis enzim yang dihasilkan oleh masing-masing bakteri (Priest et al. 1987).
Isolasi Gen Penyandi Selulase
Tahap awal untuk mengisolasi gen selulase adalah mendesain primer. Primer didesain menggunakan urutan nukleotida gen seluluse dari spesies B.
amyloliquefacies, B. subtilis, dan Bacillus sp. karena bakteri tersebut memiliki
kekerabatan yang paling dekat dengan isolat RK2 BPPT CC. Urutan nukleotida yang akan digunakan diunduh dari situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Sebanyak lima nukleotida di-align menggunakan program ClustalW di situs http://www.genome.jp/tools/clustalw. Daerah yang terkonservasi diambil sebagai basis untuk mendesain primer (Lampiran 5).
Primer yang berhasil didesain adalah primer degenerated dan masih memiliki beberapa kekurangan antara lain komposisi basa nukleotida guanin dan sitosin kurang dari 50% serta Tmnya yang rendah. Rendahnya suhu Tm akan sangat berpengaruh dalam menentukan suhu annealing (Ta) secara pasti. Suhu
annealing adalah suhu dimana primer akan menempel pada DNA cetakan.
Pencarian konsisi optimal Ta sangat penting karena berkaitan dengan spesifitas dan sensitifitas proses penempelan primer. Ta yang terlalu tinggi menyebabkan penempelan primer tidak sensitif sehingga proses amplifikasi tidak terjadi. Sebaliknya Ta yang terlalu rendah menyebabkan proses penempelan primer tidah spesifik, primer akan menempel di sisi lain DNA cetakan yang bukan sisi homolognya sehingga dapat menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan (Asy’ari dan Noer 2005). Oleh karena itu, amplifikasi gen selulase dilakukan dengan program PCR Touchdown, yaitu program PCR yang Ta nya mengalami degradasi suhu di setiap siklusnya. Pada tahap pertama Ta yang digunakan adalah 54 oC dengan degradasi suhu di setiap siklusnya sebesar 0.3 oC sehingga tercapai Ta sebesar 49.5 oC setelah 25 kali siklus. Program PCR dilanjutkan dengan 9 kali siklus dengan Ta 46 oC. DNA cetakan yang digunakan adalah DNA genom isolat RK2 BPPT CC. Hasil PCR yang telah dimurnikan dielektroforesis menggunakan gel agarose 1% (Gambar 5). Melalui hasil elektroferis dapat dilihat bahwa gen selulase isolat RK2 BPPT CC memiliki ukuran lebih dari 1500 pb.
11 adalah gen selulase dan primer yang didesain dapat digunakan untuk mengisolasi gen selulase tersebut.
Sekuen gen selulase juga dapat digunakan untuk memprediksi sekuen asam amino dan struktur tersier selulase isoalat RK2 BPPT CC. Prediksi struktur tersier selulase isolat RK2 BPPT CC dilakukan dengan salah satu metode pemodelan protein komparatif yaitu pemodelan homologi. Pada metode ini struktur protein target ditentukan berdasarkan protein lain yaitu protein templat yang sudah diketakui struktur tersiernya. Protein templat yang dipilih adalah protein yang memiliki kemiripan sekuens terbesar dengan sekuen protein target. Templat yang digunakan adalah selulase dari B. subtilis 168 karena sekuens nya memiliki skor alignment terbesar dibanding selulase bari bakteri lain yang ada di Protein Data
Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) (Lampiran 9). Nomor akses
sekuen asam amino selulase B. subtilis 168 adalah P10475 sedangkan nomor akses sekuen lain yang digunakan sebagai pembanding adalah Q59232, Q85465, Q86099, dan Q9X273. Proses pemodelan dilakukan menggunakan bantuan program di situs http://swissmodel.expasy.org. Model protein yang dipilih adalah model protein yang memiliki nilai QMEAN Z atau nilai kualitas yang paling baik. Hasil pemodelan diunduh dalam bentuk file dengan tipe pdb sehingga dapat dilakukan analis setrukturnya. Analalis struktrur enzim selulase dilakukan dengan program VMD (Gambar 7). Hasil analisis menunjukkan bahwa ujung N ada di asam amino nomor 12 dengan residu asparagin, sedangkan ujung C diisi oleh asam amino glisin pada urutan ke 304. Melalui gambar tersebut juga dapat ditentukan jumlah α-heliks (berbentuk tabung warna ungu) dan β-pleated sheet
(berbentuk panah berwarna kuning) yang menyusun selulase isolat RK2 BPPT CC. Gambar 7 menunjukkan bahwa selulase isolat ini tersusun atas delapan rantai α -heliks dan sebelas rantai β-pleated sheet.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Identifikasi isolat RK2 BPPT CC menggunakan gen penyandi 16S-rRNA menunjukkan bahwa isolat ini memiliki kekerabatan terdekat dengan B.
amyloliquefaciens. Gen selulase berhasil diisolasi menggunakan primer yang telah
didesain dan memiliki tingkat kemiripan 99% dengan gen selulase dari B. subtilis
dan B. amyloliquefaciens.
Saran
12
DAFTAR PUSTAKA
Ariffin H, Abdullah N, Kalsom MSU, Shirai Y, Hassan MA. 2006. Production and characterisation of cellulase by Bacillus pumilus Eb3. I J of Eng. 3:47-53. Asy’ary M, Noer As. 2005. Optimasi konsentrasi MgCl2 dan suhu annealing pada
proses amplifikasi multifragments mtDNA dengan metode PCR. JKSA. 3: 24-25.
Bakti C P. 2012. Optimasi produksi enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC RK2 dengan variasi pH dan suhu menggunakan response surface methodology
[skripsi]. Depok (ID): Universitas Indonesia.
Brown T. 2001. Gene cloning and DNA Analysis: an Introduction, 5th Ed. Australia: Blackwell Publishing Asia Pty Ltd. 29-30
Cavalier-Smith T. 1985. Eukaryotic gene numbers, non-coding DNA, and genom size. Di dalam: Calier-Smith, editor. The Evolution of Genome Size.
Chichester: John Wiley.
Clark DP, Pazdernik NJ. 2009. Biotechnologi Applying the Genetic Revolution. Elsevier Press. 60-61
Don R H, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS. 1991. ‘Touchdown’ PCR to cirkumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res.
19: 4008
Gerhartz W. 1990. Enzyme in industry : production and applications. Starch. 43:161
Howard RL, Abotsi EJ, van Rensburg EL, Howard S. 2003. Lignocellulose biotechnology: issue of bioconversion and enzyme production. African J
Biotech. 2: 602-619.
Kunst F, Ogasawara N, Moszer I, Albertini AM, Alloni G, Azevedo V, Bertero MG, Bessières P, Bolotin A, Borchert S et al. 1997. The complete genome sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature. 390: 249-256.
Nguyen VT, Quyen DT. 2010. Optimazing culture conditions for the production of endo-1,4-glucanase by Aspergillus awamori strain vietnam type culture collection (vtcc)-f099. J Biotechnol. 9:6337-6344.
Priest FG, Goodfellow M, Shute LA, Berkeley RCW. 1987. Bacillus
amyloliquefacies sp. nov., nom. rev. I J Systematic Bacteriol. 37: 69-71
Richana N, Irawadi TT, Nur A, Syamsu K. 2008. Isolasi identifikasi bakteri pengkasilxilanase serta karakterisasi enzimnya. J AgroBiogen. 4: 24-34
Sambrook J, Russell D. 2001. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. New york: Col Spring Harbor Laboratory Press.
Saputra A. 2008. Analisis ukuran kromosom dan pola restriksi Bacillus
thuringiensis dengan elektroforesis medan berpulsa [skripsi]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Sukumaran RK, Singhania RR, Pandey A. 2005. Mikrobial cellulase production, applications and challenges. Scientific & Industrial Research. 64: 823-844. Weisbur WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 1991. 16S ribosomal DNA
13 Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Studi Literatur
PCR untuk Amplifikasi Gen Selulase Perancangan primer
Isolasi DNA Genom
Pembuatan Media dan Kultur Bakteri
Sekuensing
Analisis gen penyandi 16S-rRNA
Sekuensing
BLAST BLAST
Elektroforesis
14
16
Lampiran 4 Susunan nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC
Lampiran 5 Hasil alligment gen selulase Bacillus
18
19
Lampiran 8 Susunan nukleotida hasil sekuensing gen penyandi selulase isolat RK2 BPPT CC
Lampiran 9 Alignment score selulaseisolat RK2 BPPT CC
20
