EKSTRAK BATANG KEMUNING TERHADAP
Fusobacterium nucleatum SEBAGAI ALTERNATIF
BAHAN MEDIKAMEN SALURAN AKAR (IN VITRO)
SKRIPSI
Diajukan untuk memenuhi tugas dan melengkapi syarat memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Gigi
Oleh:
ANITA SIREGAR
NIM : 100600068
FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
Skripsi ini telah disetujui untuk dipertahankan di hadapan tim penguji skripsi
Medan, 18 November 2014
Pembimbing Tanda Tangan
Skripsi ini telah dipertahankan di hadapan tim penguji pada tanggal 18 November 2014
TIM PENGUJI
KETUA : Prof. Trimurni Abidin, drg., M.Kes., Sp.KG (K) ANGGOTA : 1. Darwis Aswal, drg.
Tahun 2014
Anita Siregar
Efek Antibakteri Kitosan Blangkas Molekul Tinggi Sebagai Perancah
Dengan Ekstrak Batang Kemuning Terhadap Fusobacterium Nucleatum Sebagai
Alternatif Bahan Medikamen Saluran Akar (In Vitro)
xiv + 60 halaman
Mikroorganisme di dalam sistem saluran akar dapat menyebabkan kegagalan dalam perawatan saluran akar, sehingga diperlukan bahan medikamen. Pemakaian bahan alami merupakan salah satu alternatif bahan medikamen, salah satunya adalah kitosan blangkas yang sering digunakan sebagai perancah untuk memudahkan manipulasi bahan. Salah satu bahan herbal yang masih dikembangkan saat ini adalah batang kemuning. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek antibakteri kitosan blangkas molekul tinggi sebagai perancah dengan ekstrak batang kemuning
dengan bakteri Fusobacterium nucleatum.
Jenis penelitian yang digunakan adalah eksperimental laboratorium dengan mencobakan ekstrak batang kemuning 1%, 2.5%, 5%, dan 7.5% yang masing-masing
ditambahkan dengan kitosan 0.2%, 0.4%, 0.6% dan 1% yang selanjutnya diuji terhadap F.nucleatum dengan pengenceran bakteri 104 dan 108 dan dalam waktu inkubasi 3 jam dan 6 jam. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi bahan coba yang memiliki efek antibakteri yang paling efektif dalam menghambat F.nucleatum adalah kitosan 0.6% ditambah ekstrak batang kemuning 2.5%.
Kata kunci : Efek antibakteri, bahan medikamen, ekstrak batang kemuning, kitosan blangkas, bahan perancah Daftar Rujukan : 32 (1991-2013)
Puji dan syukur penulis ucapkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala berkat dan kasihNya yang telah memberi kekuatan serta penyertaan sehingga skripsi ini telah selesai disusun sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan gelar Sarjana Kedokteran Gigi.
Dalam penulisan skripsi ini, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih yang tak terhingga kepada kedua orangtua tercinta, yaitu ayahanda Ir. Rihat Siregar dan ibunda Rouli Batubara yang selalu mendoakan, menyayangi, membimbing, dan memberikan dukungan baik moril maupun materil, semangat, dorongan dan motivasi yang tak pernah putus kepada penulis sehingga dapat mengecap masa pendidikan hingga selesai di Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatera Utara dan menyelesaikan penulisan skripsi ini dengan baik.
Penulis juga ingin menyampaikan rasa sayang yang tak terhingga atas dukungan, perhatian, bantuan, dan rasa persaudaraan yang hangat dan erat dari kedua abang tersayang, yaitu Abda Siregar, SE dan Alfonso Siregar, ST dan adik tercinta,
Aryani Siregar.
Dalam penulisan skripsi ini, penulis juga banyak mendapat bimbingan, pengarahan, saran dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan penuh
ketulusan dan kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Prof. Nazruddin, drg., C.Ort., Ph.D., Sp.Ort selaku Dekan Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatera Utara yang memberi izin dilaksanakannya penelitian.
2. Cut Nurliza, drg.,M.Kes, selaku Ketua Departemen Ilmu Konservasi Gigi FKG USU atas bimbingan dan bantuan kepada penulis sehingga skripsi ini dapat diselesaikan dengan baik.
5. Seluruh staf pengajar dan pegawai di Departemen Ilmu Konservasi Gigi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Sumatera Utara
6. DR. Marline Nainggolan, M.S., Apt. selaku Ketua Laboratorium Fitokimia Farmasi USU atas bimbingan untuk pelaksanaan penelitian ini.
7. Prof. Dr. Harry Agusnar, M.Sc., M.Phill. selaku staf pengajar Departemen Kimia FMIPA USU atas bimbingan dan bantuan untuk pelaksanaan penelitian ini.
8. Prof. Dr. Dwi Suryanto selaku kepala Departemen Biologi FMIPA USU atas bimbingan dan bantuan untuk pelaksanaan penelitian ini.
9. Prof. Boy M Bahtiar, M.S., Ph.D selaku Ketua Laboratorium Biologi Oral Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Indonesia atas bimbingan selama melaksanakan penelitian.
10. Mba May dan Mba Desy selaku laboran Laboratorium Biologi Oral Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Indonesia yang telah membantu dalam melakukan penelitian.
11. Bang Ary selaku laboran laboratorium Fitokimia Farmasi USU atas izin bantuan fasilitas dan bimbingan untuk pelaksanaan penelitian ini.
12. Bu Maya selaku dosen di Fakultas Kesehatan Masyarakat yang telah
membimbing penulisan skripsi ini.
13. Rasa terima kasih yang terdalam penulis sampaikan kepada Juliver Samosir, SE yang telah memberikan motivasi, doa dan dukungan.
12. Sahabat-sahabat penulis Naftalia S.KG, Yolanda S.KG, Letario, Putri, Agnes dan Santi yang senantiasa memberikan motivasi dan masukan kepada penulis selama penelitian dan penulisan skripsi.
13. Teman-teman seperjuangan skripsi di Departemen Ilmu Konservasi Gigi Iqbal, Naftalia, Jeje, Faber, Ajeng, Sondi, Nesya, Erda, Vivi, Vika, Joce, Fajar, dan Nurul, serta teman-teman stambuk 2010 yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
Medan, 18 November 2014 Penulis,
(Anita Siregar)
HALAMAN JUDUL... i 2.1 Fusobacterium nucletum sebagai salah satu bakteri yang terdapat pada infeksi endodonti... 5
2.2 Bahan medikamen saluran akar... 7
2.3 Kitosan sebagai antibakterial... 8
2.3.1 Aplikasi kitosan di bidang kedokteran gigi... 10
2.3.2 Kitosan blangkas sebagai bahan medikamen... 11
2.4 Ekstrak batang kemuning... 12
4.2 Lokasi dan waktu penelitian... 19
4.3 Populasi, sampel dan besar sampel penelitian... 19
4.4 Variabel dan definisi operasional... 22
4.5 Metode pelaksanaan penelitian... 27
BAB 5 HASIL PENELITIAN... 36
BAB 6 PEMBAHASAN... 45
BAB 7 KESIMPULAN DAN SARAN... 50
DAFTAR PUSTAKA... 51
terhadap F.nucleatum (konsentrasi 104) pada inkubasi
3 dan 6 jam... 39 2. Hasil Percobaan Jumlah Koloni PadaPengenceran Bakteri 104
Dengan Waktu Inkubasi 3 Jam... 40 3. Hasil Percobaan Jumlah Koloni Pada Pengenceran Bakteri 108
Dengan Waktu Inkubasi 3 Jam... 41 4. Hasil Percobaan Jumlah Koloni Pada Pengenceran Bakteri 104
Dengan Waktu Inkubasi 6 Jam... 42 5. Hasil Percobaan Jumlah Koloni Pada Pengenceran Bakteri 108
1. (a) Fusobacterium nucleatum dilihat melalui
mikroskop elektron... 6
(b) Fusobacterium nucleatum melalui mikroskop elektron terlihat Outer membran (OM), Periplasmik (P) dan Cell membrane (CM)... 6
(c) Fusobacterium nucleatum melalui mikroskop elektron terlihat Outer membran (OM), Periplasmik (P) dan Cell membrane (CM)... 6
2. Tanaman kemuning... 12
23. Ekstrak cair kemuning... 32
24. Ekstrak kental... 32
25. Ekstrak kental batang kemuning... 36
26. Hasil percobaan setelah 24 jam... 37
27. Kitosan 0.6% + EBK 2.5%... 38
28. Kitosan 1% + EBK 5%... 39
Lampiran 1 Alur pikir... 54
Lampiran 2 Alur penelitian... 56
Lampiran 3 Hasil Identifikasi LIPI... 59
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah
Mikroorganisme yang ada di dalam sistem saluran akar dapat menyebabkan kegagalan dalam perawatan saluran akar baik secara langsung maupun tidak langsung. Idealnya, saluran akar akan bebas dari mikroorganisme setelah perawatan saluran akar selesai. Namun, pada dasarnya debridement yang sempurna dari saluran akar merupakan suatu hal yang mustahil.1 Irigasi dan preparasi biomekanikal tidak dapat mengeliminasi seluruh mikroorganisme yang ada di dalam saluran akar.3 Oleh karena itu, jumlah mikroorganisme akan dapat dikurangi dengan penggunaan medikamen saluran akar untuk perawatan infeksi saluran akar khususnya pada kasus-kasus dengan lesi periapikal. Adapun pengelompokan bahan medikamen yang biasa digunakan adalah fenol, seperti formocresol, camphorated monoparachlorophenol (CMCP), metacresyl acetate, eugenol dan thymol. Kelompok lain yang juga biasa
digunakan adalah aldehid, halida, steroid, kalsium hidroksida, antibiotik, dan kombinasi.1,3
Salah satu bahan medikamen yang sering digunakan adalah kalsium
hidroksida (Ca(OH)2), yang menjadi gold standard dalam perawatan endodonti
hingga saat ini. Kalsium hidroksida tersedia dalam berbagai bentuk, kombinasi, dan senyawa komersial. Jika diletakkan dalam saluran akar, baik dalam waktu yang pendek maupun waktu yang panjang, maka kalsium hidroksida (Ca(OH)2) akan
menimbulkan beberapa efek, antara lain, mereduksi mikroorganisme yang disertai dengan adanya bukti bahwa zat ini memiliki sifat membantu mengurangi inflamasi periapeks.1,2 Namun, aplikasi kalsium hidroksida (Ca(OH)2) yang sulit menyebabkan
kegagalan mengeliminasi bakteri di dalam saluran akar.4
bakteri fakultatif, dan jarang sekali ditemukan kelompok aerob. Sundqvist, mengisolasi 65 saluran akar gigi dengan lesi periapeks, lebih dari 90% adalah bakteri anaerob obligat. Dari hasil penelitian ini, ditemukan bahwa bakteri yang mendominasi terjadinya infeksi saluran akar adalah Eubacterium spp.(59), Peptostreptococcus spp. (54), dan Fusobacterium spp. (50).1
Pada penelitian Boldstad et al., Dahlén dan Möller dan Moraes et al.(2002) menyatakan bahwa Fusobacterium nucleatum merupakan salah satu bakteri yang paling sering ditemukan pada infeksi endodonti.5 Menurut Sundqvist, bakteri anaerob obligat, seperti F.nucleatum yang termasuk ke dalam jenis bakteri gram negatif dan Parvimonas micra yang termasuk ke dalam bakteri gram positif, akan meningkat sebanyak 90% pada saluran akar yang terinfeksi.4
Para peneliti sudah banyak menggunakan tanaman kemuning (Murraya paniculata (L) Jack) sebagai bahan penelitian karena memiliki khasiat dan fungsi. Tanaman kemuning berasal dari dataran India, Asia Selatan. Di Indonesia, kemuning tumbuh liar di semak belukar, tepi hutan, dan belakangan ini sering dijadikan sebagai tanaman hias dan tanaman pagar.10
Tanaman kemuning (Murraya paniculata (L) Jack) berkhasiat sebagai pemati rasa (anastesia), penenang (sedatif), antiradang, dan antitiroid. Bagian yang sering dijadikan sebagai bahan obat adalah daun, ranting, kulit batang, dan akar. Daun dan
rantingnya dapat digunakan untuk mengobati sakit gigi, mengatasi lemak tubuh yang berlebihan, infeksi saluran urin, dan menghaluskan kulit. Akarnya berguna untuk mengatasi memar akibat benturan atau pukulan, nyeri rematik, keseleo, dan digigit ular berbisa atau serangga. Sementara kulit batang dapat digunakan untuk mengatasi sakit gigi, nyeri akibat luka terbuka di kulit, ataupun ulkus.10 Trimurni (1999) berhasil menunjukkan senyawa aktif batang kemuning bersifat biokompatibel. Trimurni (2000) juga berhasil menunjukkan bahwa senyawa aktif batang kemuning dapat meredakan nyeri interdental. Penelitian Steven dan Trimurni (2008) membandingkan kadar hambat minimum (KHM) ekstrak batang kemuning dan ekstrak siwak menunjukkan bahwa pada ekstrak batang kemuning 7.5% yang
Salah satu biomaterial yang diperlukan untuk memudahkan dalam manipulasi bahan ke dalam saluran akar adalah bahan perancah (scaffold). Ada beberapa kondisi yang harus dimiliki oleh biomaterial di dalam aplikasi klinis, seperti biokompatibel, tidak beracun, bioaktif, memiliki kemampuan untuk penyerapan, dan faktor biomekanikal seperti tarikan, tekanan, dan kelenturan.9
Pemakaian bahan alami merupakan salah satu alternatif yang dapat digunakan untuk mengeliminasi mikroorganisme dari saluran akar. Saat ini telah dilakukan beberapa penelitian tentang kitosan blangkas sebagai salah satu bahan medikamen yang berasal dari alam, kompatibel terhadap jaringan, namun tetap memiliki sifat antibakteri yang sama dengan bahan non-biologi.3 Kitosan adalah senyawa turunan
kitin yang disebut juga β-1,4-2 amino-2-dioksi-D-glukosa merupakan polisakarida linier yang berasal dari zat kitin yang telah dihilangkan gugus asetilnya dengan menggunakan basa kuat.6 Kitosan banyak digunakan karena memiliki sifat biokompatibilitas, biodegradasi yang baik , dan tidak bersifat toksik. Kitosan berasal dari ekstrak kulit hewan laut seperti udang, rajungan, dan kepiting.3
Kitosan blangkas (Tachypleus gigas) merupakan hasil diasetilasi kitin yang
diperoleh dari cangkang blangkas.3 Penelitian Banurea dan Trimurni menunjukkan bubuk (powder) kitosan blangkas bermolekul tinggi tanpa bahan pelarut bereaksi positif sebagai antibakteri terhadap F.nucleatum. Namun dalam aplikasi di klinik,
bahan powder sulit dimanipulasi ke dalam saluran akar, sehingga diperlukan pelarut yang akan membawa bahan tersebut agar mudah dimanipulasi ke dalam saluran akar.3,7 Penelitian Fania dan Trimurni membandingkan efektivitas kitosan blangkas bermolekul tinggi yang diaplikasikan dengan pelarut gliserin dan VCO (Virgin Coconut Oil) menunjukkan bahwa hanya kitosan blangkas pada konsentrasi 1% dan 0,5% dengan pelarut gliserin yang memiliki daya hambat terhadap bakteri F.nucleatum.3,8
apabila kitosan blangkas molekul tinggi dikembangkan sebagai perancah dengan penambahan ekstrak batang kemuning (EBK) untuk memudahkan manipulasi bahan ke dalam saluran akar sebagai bahan medikamen saluran akar.
1.2 Permasalahan
Hingga saat ini, belum ada penelitian untuk melihat adanya efek kitosan blangkas molekul tinggi yang dikembangkan sebagai perancah dengan penambahan ekstrak batang kemuning sebagai alternatif bahan medikamen saluran akar terhadap F.nucleatum sebagai bakteri yang paling sering ditemukan dalam saluran akar gigi yang terinfeksi. Sehingga timbul permasalahan sebagai berikut:
1. Apakah kitosan blangkas molekul tinggi sebagai perancah dengan ekstrak batang kemuning memiliki efek antibakteri terhadap F.nucleatum jika digunakan sebagai bahan medikamen saluran akar dilihat dari konsentrasi pengenceran bakteri dan waktu inkubasi?
1.3 Tujuan Penelitian
1. Untuk mengetahui efek antibakteri kitosan blangkas molekul tinggi sebagai perancah dengan ekstrak batang kemuning dengan mengetahui konsentrasi yang dapat menghambat dan membunuh bakteri F.nucleatum
yang patogen dalam saluran akar.
1.4 Manfaat penelitian
1. Meningkatkan pendayagunaan tanaman obat berkhasiat dan mengembangkan bahan alami sebagai alternatif bahan medikamen saluran akar yang ada di Indonesia.
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 F.nucleatum sebagai salah satu bakteri yang terdapat pada infeksi
endodonti
Fusobacterium merupakan salah satu genus yang ditemukan oleh Knorr (1922) yang merupakan basil anaerob gram negatif yang ditemukan dalam rongga mulut, baik dalam keadaan normal maupun sakit.15,16 Berdasarkan morfologinya, Fusobacterium terbagi atas tiga spesies, diantaranya F.nucleatum, Fusobacterium polymorphum, dan Fusobacterium plauti-vincentii.15 Perbedaan karakter dari F.nucleatum dibagi menjadi beberapa subspesies, diantaranya subspesies nucleatum, vincentii, polymorphum, fusiforme, dan animalis.16,17,18 Subspesies nucleatum dan vincentii dipercaya berkaitan dengan penyakit periodontal.18
F.nucleatum merupakan salah satu spesies dari genus Fusobacterium, yang berasal dari famili Bacteroidaceae. Gambaran morfologi F.nucleatum memiliki panjang antara 5-10 µm dengan kedua ujungnya yang tajam. Bakteri ini masuk ke
dalam kelompok bakteri anaerob namun masih bisa tumbuh sampai kadar oksigen hingga 6%. Selain itu, F.nucleatum merupakan bakteri gram negatif yang tidak dapat membentuk spora dan tidak bergerak.17
F.nucleatum merupakan salah satu spesies bakteri yang paling sering dijumpai
pada plak subgingival baik dalam keadaan aktif maupun inaktif dari gingivitis maupun periodontitis.18 Bakteri anaerob gram negatif ini juga menunjukkan beberapa aktivitas biologis yang berhubungan dengan etiologi inflamasi gingiva dan penyakit mulut, dan organisme ini memiliki kemampuan untuk berpartisipasi dalam berbagai koagregasi.19 Selain periodontitis, F.nucleatum juga berperan dalam terjadinya infeksi seperti sinusitis, osteomilitis, dan abses pada otak maupun pada paru-paru.20
yang menunjukkan bahwa F.nucleatum adalah bakteri anaerob yang paling banyak ditemukan dari gigi dengan nekrosis pulpa sebanyak 67% yang dijumpai 11 spesimen dari 16 sampel.21
Gambar 1. (A) Fusobacterium nucleatum dilihat melalui mikroskop elektron, (B dan
C) melalui mikroskop elektron terlihat Outer membran (OM), Periplasmik (P) dan
Cell membrane (CM)17
Fusobacterium memerlukan suatu media yang baik dalam pertumbuhannya dan biasanya dapat tumbuh dengan subur di dalam media yang mengandung trypticase, peptone, dan ekstrak ragi. F.nucleatum merupakan salah satu spesies bakteri nonspora yang menggunakan asam amino dalam proses katabolisme untuk menghasilkan energi dan beberapa strain F.nucleatum memerlukan peptida untuk proses pertumbuhannya. F.nucleatum juga memerlukan glukosa untuk membandingkannya dengan spesies lainnya dan dalam pertumbuhannya, bakteri ini tidak menggunakan glukosa sebagai sumber energi utamanya. Oleh karena itu, F.nucleatum memerlukan glukosa untuk proses biosintesis molekul intraselular dan bukan untuk metabolisme energi.17,19
F.nucleatum memiliki karakteristik membran luar bakteri gram negatif.
oleh ruang periplasma yang terdiri atas lapisan peptidoglikan. Pada umumnya, lapisan dalam bakteri gram negatif mengandung lapisan fosfolipid simetris dengan kadar fosfolipid dan protein dalam jumlah yang sama. Lapisan luar membran berfungsi sebagai penyaring molekul dan merupakan membran asimetris yang terdiri atas fosfolipid, lipopolisakarida (LPS), lipoprotein, dan protein. Sepertiga dari massa lapisan luar Fusobacterium adalah protein.17
F.nucleatum berperan dalam desulfurasi sistein dan methionin sehingga menghasilkan ammonia, hydrogen sulfida, asam butirat dan methyl mercapthan.17 Kemampuan patogenesis F.nucleatum tidak hanya sebagai bakteri tunggal namun dapat dikaitkan dengan keberadaan bakteri lain. Adanya interaksi F.nucleatum dengan jenis bakteri lain berhubungan dengan beberapa hal, diantaranya adalah kemampuan mengumpulkan glukosa dalam bentuk glukan intraseluler yang dapat digunakan sebagai sumber energi. Apabila jumlah glukosa berkurang, maka glukosa yang ada dapat dieksresikan dari sel bakteri. Hal ini memungkinkan bakteri lain mendekati permukaan F.nucleatumdan selanjutnya berikatan dengan dinding selnya (Kolenbrander et al., 1992).17,19
Kemampuan koagregasi F.nucleatum dengan Candida albicans terjadi melalui ikatan protein permukaan sel bakteri dengan residu karbohidrat pada permukaan Candida albicans (Bagg., 1986). Selain itu, F.nucleatum mampu
berkoagregasi dengan P.gingivalis karena adanya ikatan karbohidrat yaitu galaktosa pada permukaan P.gingivalis dan protein lapisan luar pada F.nucleatum. (Kinder et al., 1983)17
2.2 Bahan medikamen saluran akar
Dalam mengeliminasi jumlah mikroorganisme di dalam saluran akar diperlukan bahan medikamen, seperti fenol, seperti formocresol, camphorated monoparachlorophenol (CMCP), metacresyl acetate, eugenol dan thymol. Adapun kelompok lain yang juga biasa digunakan adalah aldehid, halida, steroid, kalsium hidroksida, antibiotik, dan kombinasi.1,3
Penggunaan bahan medikamen fenol dan aldehid mampu mengeliminasi mikroorganisme dengan efektif, namun kedua bahan ini juga bersifat toksik. Selain itu, penggunaan fenol maupun aldehid tidak efektif dalam mengatasi nyeri.
Salah satu bahan medikamen yang sering digunakan adalah kalsium hidroksida (Ca(OH)2), yang menjadi gold standard dalam perawatan endodonti
hingga saat ini. Kalsium hidroksida tersedia dalam berbagai bentuk, kombinasi, dan senyawa komersial.1,2 Pada penelitian yang dilakukan oleh Ferreira et al (2002) menunjukkan adanya sifat antibakteri kalsium hidroksida terhadap beberapa bakteri anaerob, diantaranya F.nucleatum, Provotella nigrescens, Clostridium perfringens, dan Bacteroides fragilis.13 Pada penelitian sebelumnya, kalsium hidroksida memiliki efek antibakteri terhadap Enterococcus faecalis pada studi in vitro. Hal ini didukung
oleh penelitian yang dilakukan Rathke et al (2012) yang menunjukkan bahwa bahan medikamen kalsium hidroksida memiliki efek antibakteri terhadap F.nucleatum dan Parvimonas micra.4 Meskipun bahan ini memiliki sifat antimikroba yang baik, namun
kalsium hidroksida ini juga memiliki efek terhadap jaringan yang perlu dipertimbangkan.1
2.3 Kitosan sebagai antibakterial
Keutamaan kitosan adalah bersifat biodegradable dan biocompatible (Maachou et al. 2008). Saraswaty et al. (2001) menambahkan bahwa kitosan juga memiliki biodegradabilitas, fleksibilitas dan ketahanan terhadap panas yang tinggi karena ikatan intramolekul hidrogen yang terbentuk antara gugus hidroksil dan amino.23
Kemampuan dalam menekan pertumbuhan bakteri disebabkan kitosan memiliki polikation bermuatan positif yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri. Salah satu mekanisme yang mungkin terjadi adalah molekul kitosan memiliki kemampuan untuk berinteraksi dengan senyawa pada permukaan sel bakteri kemudian teradsorpsi membentuk suatu lapisan (layer) yang menghambat saluran transportasi sel bakteri sehingga mengalami kekurangan substansi untuk berkembang dan mengakibatkan matinya sel bakteri tersebut. Secara kimiawi, proses pelarutan cukup aman karena dapat dilarutkan dengan asam asetat encer (1%) sehingga membentuk larutan kitosan homogen yang relatif aman.22
Penelitian menyatakan bahwa kitosan memiliki kemampuan dalam menghambat pertumbuhan bakteri. Pada penelitian yang dilakukan El-Ghaouth et al.
menunjukkan terdapat kemampuan aksi antibakterial kitosan dan derivatnya. Pada penelitian tersebut pula dikemukakan bahwa kitosan bereaksi dengan permukaan sel, mengubah permeabilitas sel, dan mencegah kebocoran material. Menurut Chen et al
(2002), antibakteri kitosan lebih efektif terhadap bakteri gram negatif daripada bakteri gram positif. Hal ini juga didukung oleh penelitian Chung et al b(2004) yang menyatakan bahwa penyerapan kitosan oleh bakteri gram negatif lebih besar dari bakteri gram positif. Hasil dari penelitian tersebut menyatakan bahwa penyerapan kitosan juga berhubungan dengan lingkungan sekitar, yaitu nilai pH dan derajat deasetilisasi. Pernyataan tersebut terbukti dengan suasana yang lebih asam (pH 4) dan derajat asetilisasi yang tinggi (95%), kitosan akan bermuatan lebih positif dan lebih mudah mengangkut gugus amino (NH3+) yang akan mempermudah penyerapan
Kombinasi kitosan dan chitooligosaccharide menunjukkan adanya aktivitas antibakteri terhadap Escherihia coli, Pseudomonas aeruginosa, sedangkan kombinasi kitosan dan kopolimer memiliki aktivitas antibakteri terhadap Candida albicans, Trichophyton rubrum, dan Trichophyton violaceum.25
2.3.1 Aplikasi kitosan di bidang kedokteran gigi
Kitosan memiliki kualitas kimia dan biologi yang sangat baik dan dapat digunakan secara luas dibidang industri mupun bidang kesehatan.26 Kitosan dapat dimanfaatkan di berbagai bidang, seperti biokimia, obat-obatan atau farmakologi, pangan dan gizi, pertanian, mikrobiologi, penanganan air limbah, industri kertas, tekstil membran atau film, kosmetik dan lain sebagainya.22 Kitosan dianggap sebagai polisakarida yang potensial karena memiliki gugus amino bebas yang berperan sebagi polikation, cheleating agent, dan sebagai bahan dispersi apabila telah dilarutkan terlebih dahulu dalam pelarut asetat.26
Dalam bidang kesehatan, kitosan dapat berupa serat, membran, spons, atau hidrogel dan digunakan sebagai desinfektan seperti, pembalutan luka, ortopedi,
rekayasa jaringan, penghantaran obat dan hemodialisis. Bahan pembalutan luka yang ideal harus mampu menyerap cairan yang berasal dari permukaan luka, memungkinkan terjadinya penguapan pada tingkat tertentu, dan meminimalkan
adanya mikroba. Polisakarida seperti kitosan dalam bentuk hidrogel telah dipertimbangkan keuntungannya dalam aplikasinya sebagai bahan pembalutan luka (Chen et al., 2005).27
Aplikasi kitosan di bidang kedokteran gigi dapat berpotensi dalam proses differensisasi sel osteoprogenitor dan dapat memfasilitasi pembentukan tulang (Lee et al., 2000a). Sebagai faktor pertumbuhan, khususnya sel T yang dapat meningkatkan regenerasi periodontal apabila digabungkan dengan bahan yang bersifat biodegradasi sehingga mampu membentuk konsentrasi terapeutik selama proses reaksinya(Lee et al., 2000b).28 Selain itu, kitosan juga telah digunakan pada kasus periodontitis untuk mengurangi tingkat kegoyangan gigi, kedalaman poket dan
2.3.2 Kitosan blangkas (Tachypleus gigas) sebagai bahan medikamen saluran akar
Pemakaian bahan alami merupakan salah satu alternatif yang dapat digunakan untuk mengeliminasi mikroorganisme dari saluran akar. Saat ini telah dilakukan beberapa penelitian tentang kitosan blangkas sebagai salah satu bahan medikamen yang berasal dari alam, kompatibel terhadap jaringan, namun tetap memiliki sifat antibakteri yang sama dengan bahan non-biologi. Kitosan banyak digunakan karena memiliki sifat biokompatibilitas, biodegradasi yang baik , dan tidak bersifat toksik.3
Penelitian yang dilakukan oleh Trimurni (2007) yang melakukan penelitian efektivitas kitosan blangkas sebagai bahan kaping pulpa melalui pemeriksaan immunohistokimia dari sampel pulpa terbuka gigi tikus menunjukkan bahwa bahan tersebut bersifat biokompatibel dan dapat merangsang bioaktivitas sel-sel pulpa gigi untuk membentuk dentin reparatif yang ditandai dengan meningkatnya ekspresi fosfatase alkali.12
Penelitian yang dilakukan oleh Banurea dan Trimurni (2008) menunjukkan bahwa bahan coba kitosan bermolekul tinggi yaitu kitosan blangkas dan kitosan
komersial memiliki efek antibakteri terhadap F.nucleatum dengan konsentrasi 10%.7 Hal ini didukung oleh penelitian Fania dan Trimurni yang membandingkan efektivitas kitosan blangkas bermolekul tinggi yang diaplikasikan dengan pelarut
gliserin dan VCO (Virgin Coconut Oil) menunjukkan bahwa hanya kitosan blangkas pada konsentrasi 1% dan 0,5% dengan pelarut gliserin yang memiliki daya hambat terhadap bakteri F.nucleatum.8 Pada penelitian yang dilakukan oleh Trimurni dan Tika menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi larutan kitosan blangkas bermolekul tinggi dengan pelarut gliserin, maka semakin efektif dalam menghambat pertumbuhan Candida albicans dan nilai kadar hambat larutan kitosan blangkas dengan pelarut gliserin adalah 0,006%.3
silika yang mengandung 2% khlorheksidine aktif yang dilapisi sodium alginate dan kitosan juga dapat digunakan sebagai bahan medikamen saluran akar.30
2.4 Ekstrak Batang Kemuning
Para peneliti sudah banyak menggunakan tanaman kemuning (Murraya paniculata (L) Jack) sebagai bahan penelitian karena memiliki khasiat dan fungsi. Tanaman kemuning berasal dari dataran India, Asia Selatan. Di Indonesia, kemuning tumbuh liar di semak belukar, tepi hutan, dan belakangan ini sering dijadikan sebagai tanaman hias dan tanaman pagar.10 Tumbuhan kemuning tumbuh kira-kira sampai setinggi 400 m di atas permukaan laut. Tumbuhan yang termasuk suku Rutaceae ini, merupakan perdu atau pohon kecil yang bercabang banyak, tinggi 3 – 8 m, batangnya keras, beralur, tidak berduri. Daunnya merupakan daun majemuk menyirip ganjil dengan anak daun 3 – 9, yang tumbuh berseling, bentuk bundar telur sungsang, dengan ujung dan pangkal daun meruncing, tepi rata atau agak beringgit, panjang 2 – 7 cm, lebar 1 – 3 cm, permukaan licin dan mengkilat. Panjang tangkai daun 3 – 4 mm. Daun bila diremas tidak berbau. Bunganya bunga majemuk 1 – 8, warnanya
putih, wangi keluar dari ujung batang atau ketiak daun. Buahnya buni berdaging, bulat telur atau bulat memanjang, lebar, merah mengkilat, panjang 8 – 12 mm, berbiji dua. Bagian tumbuhan yang sering digunakan sebagai obat adalah daun, buah dan
kulit.31
Tumbuhan ini dikenal dengan beberapa nama daerah, di Sumatera: Kemuning, kamunieng, di Jawa: kamuning, kamoneng, kemuning, Nusa tenggara: kajeni, kemuning, kamuni, kahabar, karizi, Sulawesi: kemuning, kamuni, kayu gading, kamoni, kamuning, palopo, Maluku: esehi, fanasa, kamoni, kamone.31
Tanaman kemuning (Murraya paniculata (L) Jack) berkhasiat sebagai pemati rasa (anastesia), penenang (sedatif), antiradang, dan antitiroid. Bagian yang sering dijadikan sebagai bahan obat adalah daun, ranting, kulit batang, dan akar. Daun dan rantingnya dapat digunakan untuk mengobati sakit gigi, mengatasi lemak tubuh yang berlebihan, infeksi saluran urin, dan menghaluskan kulit. Akarnya berguna untuk mengatasi memar akibat benturan atau pukulan, nyeri rematik, keseleo, dan digigit ular berbisa atau serangga. Sementara kulit batang dapat digunakan untuk mengatasi sakit gigi, nyeri akibat luka terbuka di kulit, ataupun ulkus.10 Trimurni, dkk (1999) berhasil menunjukkan senyawa aktif batang kemuning bersifat biokompatibel. Trimurni et al (2000) juga berhasil menunjukkan bahwa senyawa aktif batang kemuning dapat meredakan nyeri interdental. Hal tersebut didukung juga dengan
penelitian Steven dan Trimurni (2008) yang membandingkan kadar hambat minimum (KHM) ekstrak batang kemuning dan ekstrak siwak menunjukkan bahwa pada ekstrak batang kemuning 7.5% yang memiliki daya hambat terbesar terhadap F.nucleatum.11
2.5 Bahan Perancah (Scaffold)
beracun, bioaktif, memiliki kemampuan untuk penyerapan, dan faktor biomekanikal seperti tarikan, tekanan, dan kelenturan.9
Gambar 3. Kombinasi tiga elemen yang memungkinkan terjadinya regenerasi jaringan atau organ12
Aplikasi bahan perancah pada jaringan bertujuan agar mampu mendukung pembentukan jaringan suatu lingkungan mikro dengan struktur tiga dimensi yang mempunyai sifat fisikokimia dan biologis menunjang bagi migrasi, perlekatan, proliferasi dan diferensiasi sel-sel dari jaringan sekitarnya, atau dari sel-sel yang ditanamkan dalam porus bahan perancah untuk membentuk jaringan yang diinginkan.12
2.5.1 Penggunaan Kitosan sebagai Perancah bila dikembangkan dengan
bahan lain
sodium alginate dan kitosan juga dapat digunakan sebagai bahan medikamen saluran akar karena ukuran yang kecil memungkinkan masuk ke dalam tubulus dentin dan mampu menjadikan kondisi pH menjadi 6,5 pada saluran akar yang terinfeksi.30
Bhupendra GP (2010) melakukan penelitian tentang penggunaan gel kitosan sebagai penghantar obat clotrimazole (CLZ) yang dilakukan terhadap tikus. Hasilnya dapat disimpulakan bahwa kitosan dapat digunakan dalam bentuk gel karena sifat fisiknya yang stabil dan mampu menyerap air secara alami.32
2.6 Kerangka Teori
Perawatan saluran akar
Penggunaan bahan medikamen saluran akar untuk mengeliminasi jumlah mikroorganisme
Alternatif bahan medikamen saluran akar Bahan Medikamen Gold standar
Ca(OH)2
Kitosan blangkas sebagai perancah dengan ekstrak batang kemuning
Kitosan derajat deasetilasi >> dan suasana pelepasan ion OH- asam gugus amino (NH3+) >> penyerapan - hidrolisa lemak LPS
kitosan oleh bakteri >> permeabilitas membran bakteri perubahan sel terganggu dan terjadi kebocoran materi bakteri struktur sel membran
sel lisis daya antibakteri (+) sitoplasma
Ekstrak batang kemuning bersifat biokompatibel - aktivasi enzim alkali dan dapat meredakan inflamasi jaringan pulpa phospatase << gigi oksidasi enzim dan protein
- mengganggu DNA replikasi terhambat
F.nucleatum
Sel lisis
BAB 3
KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS
3.1 Kerangka konsep
Kitosan blangkas + ?? Pertumbuhan bakteri
ekstrak batang kemuning F.nucleatum
- Waktu (3 jam, 6 jam) - Suhu
Penelitian yang dilakukan pada bakteri anaerob F.nucleatum. Bahan coba yang digunakan adalah kitosan blangkas + ekstrak batang kemuning. Kitosan banyak digunakan karena memiliki sifat biokompatibilitas, biodegradasi yang baik, dan tidak bersifat toksik.3 Salah satu mekanisme yang mungkin terjadi adalah molekul kitosan memiliki kemampuan untuk berinteraksi dengan senyawa pada permukaan sel bakteri kemudian teradsorpsi membentuk suatu lapisan (layer) yang menghambat saluran transportasi sel bakteri sehingga mengalami kekurangan substansi untuk berkembang dan mengakibatkan matinya sel bakteri tersebut.22
Penelitian menggunakan tanaman kemuning semakin meningkat karena memiliki khasiat dan fungsi. Bagian tumbuhan yang sering digunakan sebagai obat adalah daun, buah dan kulit.31 Ekstrak batang kemuning bersifat biokompatibel dan dapat meredakan inflamasi jaringan pulpa gigi.11
disekitarnya, atau dari sel-sel yang ditanamkan dalam bahan perancah untuk membentuk jaringan yang diinginkan.9,32
3.2 Hipotesis
BAB 4
METODOLOGI PENELITIAN
4.1 Rancangan dan Jenis Penelitian
4.1.1 Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah posttest only control group design.
4.1.2 Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimental laboratorium.
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
4.2.1 Lokasi Penelitian
Lokasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah: 1. Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi USU
2. Laboratorium Biologi Oral Fakultas Kedokteran Gigi UI
4.2.2 Waktu Penelitian
Waktu penelitian ini adalah 4 bulan (Maret – Juli 2014)
4.3 Populasi, Sampel dan Besar Sampel
4.3.1 Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah bakteri F.nucleatum
4.3.2 Sampel
4.3.3 Besar Sampel
Dalam penelitian ini bahan yang digunakan dibagi menjadi 17 kelompok, yaitu 16 (enam belas) kelompok bahan coba dan 1 (satu) kelompok kontrol.
Kelompok I : Kitosan blangkas 1% dicampur dengan ekstrak batang kemuning 7.5%.
Kelompok II : Kitosan blangkas 1% dicampur dengan ekstrak batang kemuning 5%.
Kelompok III : Kitosan blangkas 1% dicampur dengan ekstrak batang kemuning 2.5%.
Kelompok IV : Kitosan blangkas 1% dicampur dengan ekstrak batang kemuning 1%.
Kelompok V : Kitosan blangkas 0.6% dicampur dengan ekstrak batang kemuning 7.5%.
Kelompok VI : Kitosan blangkas 0.6% dicampur dengan ekstrak batang kemuning 5%.
Kelompok VII: Kitosan blangkas 0.6% dicampur dengan ekstrak batang kemuning 2.5%.
Kelompok VIII : Kitosan blangkas 0.6% dicampur dengan ekstrak batang kemuning
1%.
Kelompok XII : Kitosan blangkas 0.4% dicampur dengan ekstrak batang kemuning
1%.
Kelompok XIII : Kitosan blangkas 0.2% dicampur dengan ekstrak batang kemuning
7.5%.
Kelompok XIV: Kitosan blangkas 0.2% dicampur dengan ekstrak batang kemuning
Kelompok XV: Kitosan blangkas 0.2% dicampur dengan ekstrak batang kemuning 2.5%.
Kelompok XVI : Kitosan blangkas 0.2% dicampur dengan ekstrak batang kemuning
1%.
Kelompok XVII : Kontrol bakteri
4.4 Variabel dan Definisi Operasional
4.4.1 Variabel Penelitian
Variabel tergantung
Pertumbuhan bakteri
F.nucleatum pada media BHI Variabel bebas
b. Perlakuan terhadap batang kemuning c. Lama penyimpanan batang kemuning
sampai proses ekstraksi
d. Suhu penyimpanan batang kemuning sampai proses ekstraksi
e. pH lingkungan saat dilakukan uji sensitivitas bakteri
f. Volume etanol yang dipakai 6 liter g. Konsentrasi etanol yang dipakai (70%) h. Nomor kertas saring yang dipakai
(Whatman No.42)
i. Jumlah kertas saring saat perkolasi (3 lapis)
j. Kecepatan tetes cairan dalam percolator (20 tetes/menit)
k. Suhu penguapan rotavapor (40 oC) l. Media pertumbuhan bakteri yaitu BHI m. Sterilisasi alat, bahan coba, dan media n. F.nucleatum ATCC 25586
o. Suhu inkubasi (37 oC)
p. Teknik pembiakan F.nucleatum
q. Waktu pembiakan F. nucleatum (24jam)
r. Waktu pengamatan (24jam)
Variabel tidak terkendali
a. Cara penyimpanan bahan coba kitosan blangkas dan ekstrak batang kemuning
b. Lingkungan (kondisi tanah dan iklim) tempat tumbuh batang kemuning
4.4.2 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah kitosan blangkas dengan perancah ekstrak batang kemuning.
4.4.3 Variabel Tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah pertumbuhan bakteri Fucobacterium nucleatum pada media BHI
4.4.4 Variabel Terkendali
Variabel terkendali pada penelitian ini terdiri atas: a. Asal batang kemuning
b. Perlakuan terhadap batang kemuning
c. Lama penyimpanan batang kemuning sampai proses ekstraksi d. Suhu penyimpanan batang kemuning sampai proses ekstraksi e. pH lingkungan saat dilakukan uji sensitivitas bakteri
f. Volume etanol yang dipakai 6 liter
g. Konsentrasi etanol yang dipakai (80%)
h. Nomor kertas saring yang dipakai (Whatman No.42) i. Jumlah kertas saring saat perkolasi (3 lapis)
j. Kecepatan tetes cairan dalam percolator (20 tetes/menit) k. Suhu penguapan rotavapor (40 oC)
l. Media pertumbuhan bakteri yaitu BHI (Brain Heart Infusion Agar) m. Sterilisasi alat, bahan coba, dan media
n. Suspensi F.nucleatum ATCC 25586 o. Suhu inkubasi (37 oC)
p. Teknik pembiakan F.nucleatum
4.4.5 Variabel Tidak Terkendali
Variabel tidak terkendali pada penelitian ini terdiri atas:
a. Cara penyimpanan bahan coba kitosan blangkas dan ekstrak batang kemuning
4.4.6 Definisi Operasional
4.5 Metode Penatalaksanaan Penelitian
4.5.1 Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan adalah
1. Kitosan Tachypleus gigas (hasil penelitian Harry A,2005)
2. Batang kemuning (Murraya paniculata (L) Jack) yang diambil dari daerah Patumbak di Medan, Sumatera Utara, Indonesia
3. Etanol 80% sebanyak 6 liter (Kimia Farma, Indonesia)
4. Larutan asam asetat 1% sebanyak 2 liter (Kimia Farma, Indonesia) 5. Akuades 1 liter (Kimia Farma, Indonesia)
6. F.nucleatum ATCC 25586
7. Media BHI (Brain Heart Infusion Agar)
4.5.2 Alat Penelitian
Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah 1. Timbangan (Home Line, China)
2. Timbangan analitik (Vibra, Japan)
3. Kertas perkamen 2 kajang 4. Blender (Panasonic, Japan)
5. Kapas 250 gram (Bio Panca, Indonesia)
6. Kertas saring (Whatman no.42, England)
7. Aluminium foil 1 gulungan (Total Wrap, Indonesia) 8. Perkolator
9. Erlenmeyer (Pyrex, USA)
10.Vaccum rotavapor (Stuart, 2010)
11.Electronic balance (Ohyo JP2 6000, Japan dan Denver Instrument Company, USA)
12.Autoklaf (Tomy, Japan)
13.Vortex ( Iwaki model TM-100, Japan) 14.Inkubator CO2 (Sanyo, Japan)
16.Piring petri (Pyrex, Japan) 17.Ose dan spiritus
18.Kaca pembesar (Ootsuka ENV-CL, Japan)
Gambar 4. Autoklaf Gambar 5. Timbangan analitik
Gambar 8. Timbangan Gambar 9. Blender
Gambar 10. Rotary Evaporator
4.5.3 Prosedur Penelitian
4.5.3.1 Pembuatan ekstrak batang kemuning (Murraya paniculata (L)
Jack)
Proses pembuatan ekstrak batang kemuning (Murraya paniculata (L) Jack)
dilakukan berdasarkan Standart Operasional Prosedur Laboratorium Fitokimia Fakultas Farmasi USU dengan langkah-langkah sebagai berikut:
a. Pembuatan simplisia
mudah hancur. Selanjutnya batang kemuning yang telah kering tersebut dihaluskan dengan blender dan disaring (Gambar 13 & 14) dan didapat serbuk simplisia (Gambar 15).
b. Proses perkolasi
Siapkan 500 gram serbuk simplisia (Gambar 16) dan dimasukkan ke dalam bejana tertutup, kemudian dituang etanol 80% (Gambar 17) sampai semua simplisia terendam sempurna dan dibiarkan sekurang-kurangnya 3 jam (Gambar 18). Kemudian massa simplisia yang telah direndam tersebut dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator (Gambar 19) dengan hati-hati sambil sesekali ditekan dan di atasnya dilapisi selapis kertas saring. Kemudian etanol dituangkan secukupnya ke dalam perkolator sampai cairan mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyaring. Selanjutnya, perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam.
Setelah 24 jam, perkolator dibuka kembali dan cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit atau 20 tetes per menit (Gambar 20). Tambahkan etanol secukupnya dengan berulang-ulang sehingga selalu terdapat selapis cairan
penyari di atas simplisia, hingga diperoleh ekstrak (Depkes RI, 1979).
Perkolat yang telah didapat (Gambar 21) dipekatkan dengan alat rotary evaporator (Gambar 22) dan dikeringbekukan dengan menggunakan freeze dryer.
Gambar 13. Batang diblender Gambar 14. Simplisia disaring
Gambar 15. Serbuk simplisia Gambar 16. Timbang 500gram
Gambar 19. Masukkan ke perkolator Gambar 20. Proses penetesan
Gambar 21. Dipekatkan dengan Gambar 22. ekstrak kemuning
Rotary evaporator didapat
Gambar 23. Ekstrak cair kemuning Gambar 24. Ekstrak kental didapat dan di keringkan di waterbath disimpan dalam lemari pendingin
4.5.3.2 Pengenceran Bahan Coba
Ekstrak batang kemuning (Murraya paniculata (L) Jack) dalam etanol ditimbang menggunakan electronic balance dan massanya disesuaikan dengan
konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan.
Untuk penyiapan bahan coba kitosan dengan konsentrasi yang diinginkan
(konsentrasi 5%) dapat dilakukan dengan cara menimbang 0.5 gram kitosan dan dicampurkan ke dalam 10 ml asam asetat 1%. Setelah itu, divorteks sampai semua bubuk kitosan dan larutan asam asetat tercampur, maka larutan yang didapat memiliki viskositas yang sangat tinggi dan berupa gel.
4.5.3.3 Pencampuran Bahan Coba
Untuk penyiapan bahan coba kitosan, timbang 0.5 gram kitosan dan campurkan ke dalam 10 ml asam asetat 1%. Setelah itu, divorteks sampai semua bubuk kitosan dan larutan asam asetat tercampur, maka larutan yang didapat memiliki viskositas yang sangat tinggi. Untuk penyiapan bahan coba ekstrak batang kemuning, timbang 2 gram ekstrak kental dan campurkan ke dalam 10 ml DMSO. Setelah itu, divorteks hingga larutan tercampur.
Selanjutnya, pada konsentrasi kitosan 1% diperlukan 1,6 ml larutan kitosan, pada konsentrasi kitosan 0.6% diperlukan 0.96 ml larutan kitosan, pada konsentrasi kitosan 0.4% diperlukan 0.64 ml larutan kitosan, dan pada konsentrasi kitosan 0.2% diperlukan 0.32 ml larutan kitosan.
Untuk konsentrasi ekstrak batang kemuning 7.5% diperlukan 3 ml bahan coba, konsentrasi ekstrak batang kemuning 5% diperlukan 2 ml bahan coba,
konsentrasi ekstrak batang kemuning 2.5% diperlukan 1 ml bahan coba, dan konsentrasi ekstrak batang kemuning 1% diperlukan 0.4 ml bahan coba.
4.5.3.4 Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Brain Heart Infusion (BHI), sebanyak 37 gram BHI dilarutkan dalam 1000 ml akuades kemudian dituangkan ke dalam 50 petri (20ml/petri) lalu media disterilkan dalam autoklaf selama 3 jam dan suhu 27 oC. Setelah disterilkan, media sedikit didinginkan menggunakan alat. Setelah media tidak terlalu panas, media dapat dituang ke dalam masing –masing petri dan dibiarkan hingga dingin.
4.5.3.5 Pembiakan Spesimen
F.nucleatum yang digunakan adalah spesimen stem sel F.nucleatum ATCC 25586 yang dibiakkan secara murni pada media BHI dalam suasana anaerob hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil beberapa koloni bakteri dengan ose steril lalu diencerkan dengan larutan NaCl 0,9% hingga konsentrasi 108 CFU/ml atau setara dengan 0.5 Mc Farland.
4.5.3.6 Inkubasi bakteri dan bahan coba
Konsentrasi bakteri yang digunakan (104 dan 108) yang masing –masing berisi bahan coba tiap konsentrasi diinkubasi dalam inkubator selama 3 jam dan 6
jam. Pemilihan waktu inkubasi selama 3 jam dan 6 jam adalah berdasarkan kurva pertumbuhan bakteri dimana bakteri berada dalam fasa log yang berjenjang dari 3-15 jam. Setelah diinkubasi masing-masing selama 3 jam dan 6 jam, dilakukan plating pada tiap petri yang sudah diberi label di atas BHI agar kemudian diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam.
4.5.3.7 Penentuan Efek Antibakteri dengan Menggunakan Metode
Cakram
coba, kemudian teteskan bakteri yang telah dikultur ke atas agar, lalu diose. Pada tahap selanjutnya, letakkan 3 (tiga) buah cakram di atas agar, kemudian dari masing-masing konsentrasi bahan coba ditetesi ke atas cakram (10µl/cakram). Masukkan seluruh petri ke dalam tabung anaerob dan diberikan gas minus oksigen agar didapati suasana anaerob. Selanjutnya, tabung dimasukkan ke dalam inkubator, diamkan selama 24 jam. Kemudian amati perubahan kekeruhan yang terjadi. Tabung dengan kekeruhan yang mulai tampak jernih untuk setiap kelompok perlakuan merupakan konsentrasi minimal ekstrak yang memiliki efek antibakteri terhadap pertumbuhan F.nucleatum dalam media pembenihan setelah diinkubasi 24 jam dan diamati secara visual.
4.5.3.8 Penentuan Efek Antibakteri dengan Menggunakan Metode
Hitung Koloni Bakteri
Penentuan efek antibakteri bahan coba dilakukan dengan melakukan penghitungan jumlah koloni menggunakan metode dilusi yaitu setiap konsentrasi kitosan blangkas molekul tinggi sebagai perancah dengan ekstrak batang kemuning
setelah diinkubasi selama 3 jam dan 6 jam, bahan coba pada setiap konsentrasi di vortex dan diambil 10l dengan mikropipet untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke
dalam BHI agar, dilakukan 2 kali replikasi. Selanjutnya diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 37oC selama 24 jam.
Jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri. Apabila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka faktor pengenceran x 1. Selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50l, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor
BAB 5
HASIL PENELITIAN
5.1 Ekstrak Kental Batang Kemuning
Ekstrak etanol batang kemuning diperoleh dari 500 gram batang kemuming yang telah dihaluskan menjadi serbuk simplisia, kemudian dimaserasi dan diperkolasi dengan melarutkan simplisia batang kemuning dengan menggunakan pelarut etanol 80% sebanyak 5 liter hingga dihasilkan maserat cair. Selanjutnya maserat cair diuapkan menggunakan vaccum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental berwarna hijau gelap sebanyak 61 gram. Sebelum digunakan, ekstrak tersebut dimasukkan kedalam wadah tertutup dan disimpan dalam freeze dryer.
Gambar 25. Ekstrak kental batang kemuning
5.2 Kitosan Tachypleus gigas
5.3 Uji Efektivitas Antibakteri
Dalam melihat efektivitas antibakteri, dapat dilihat dengan adanya zona bening yang terdapat di sekitar cakram pada petri. Setelah dilakukan penetesan bahan coba tiap konsentrasi pada setiap petri dan dilakukan pengamatan setelah 24 jam, tidak terlihat zona bening disekitar cakram. Yang dimaksud dengan zona bening ini adalah adanya area bening disekitar cakram yang menunjukkan F.nucleatum dihambat pertumbuhannya oleh bahan coba.
(a) (b)
(c) (d)
Pada gambar 26, tidak terlihat adanya zona bening disekitar cakram dengan menggunakan konsentrasi kitosan 1% ekstrak batang kemuning (a)7.5%, (b) 5%, (c) 2.5% dan (d) 1% .
Dalam pengujian efektivitas antibakteri dengan menggunakan metode hitung koloni, digunakan 2 (dua) kelompok konsentrasi bakteri yaitu konsentrasi 104 dan 108. Masing-masing kelompok konsentrasi bakteri diinkubasi selama 3 jam dan 6 jam yang bertujuan untuk melihat adanya hubungan antara perbedaan waktu inkubasi dengan jumlah bakteri yang dapat terhambat dan mati. Kemampuan antibakteri bahan coba yang paling efektif yang diperoleh adalah kitosan 0.6% dengan ekstrak batang kemuning 2.5% pada konsentrasi 108 dengan waktu inkubasi 6 jam, yang ditandai dengan tidak terbentuknya koloni bakteri, yaitu permukaan agar terlihat jernih. (Gambar 27).
Pada percobaan dengan menggunakan kitosan 1% + EBK 5% (Gambar 28) dan
kitosan 0.4% + EBK 7.5% (Gambar 29) pada konsentrasi bakteri 104
dan dengan waktu inkubasi 3 jam, masih terdapat pertumbuhan koloni bakteri.
Gambar 28. Kitosan 1% + EBK 5% Gambar 29. Kitosan 0.4% + EBK 7.5% pada konsentrasi bakteri 104 pada konsentrasi bakteri 104
Dari grafik 1 menunjukkan bahwa terdapat adanya perbedaan efek antibakteri kitosan + ekstrak batang kemuning terhadap konsentrasi F.nucleatum 104 pada waktu inkubasi 3 jam dan 6 jam.
Tabel 2 : HASIL PERCOBAAN JUMLAH KOLONI PADA KONSENTRASI 104 PADA INKUBASI 3 JAM
Konsentrasi bahan coba Percobaan Rata-rata
1 2
Pada tabel 2 dapat diketahui bahwa rata-rata jumlah koloni yang tumbuh pada konsentrasi 104 pada inkubasi 3 jam dengan bahan coba kitosan 0.2% + EBK 1% adalah 22 koloni. Pada bahan coba kitosan 0.2% + EBK 2.5% memiliki rata-rata koloni 27.5, sementara pada bahan coba kitosan 0.2% + EBK 5% rata-rata koloninya 50, dan rata-rata jumlah koloni pada kitosan 0.2% + EBK 7.5% adalah 56.5.
Rata-rata jumlah koloni yang tumbuh pada konsentrasi kitosan 0.6% + EBK 1% adalah 4.5, pada kitosan 0.6% + EBK 5% ada 5.5 koloni. Sedangkan pada konsentrasi kitosan 0.6% + EBK 7.5% rata-ratanya 4 koloni, sementara pada konsentrasi kitosan 1% + EBK 1% adalah 2.5 dan pada konsentrasi kitosan 1% + EBK 7.5% memiliki rata-rata 2 koloni.
Pada konsentrasi bakteri 104 dengan waktu inkubasi 3 jam, konsentrasi kitosan 0.6% + EBK 2.5% memiliki rata-rata jumlah yang sama dengan konsentrasi kitosan 1% + 2.5% dan kitosan 1% + 5%.
Tabel 3 : HASIL PERCOBAAN JUMLAH KOLONI PADA KONSENTRASI 108 PADA INKUBASI 3 JAM
Konsentrasi bahan coba Percobaan Rata-rata
1 2
Konsentrasi kitosan 0.2% + EBK 2.5% memiliki rata-rata 27 koloni. Pada bahan coba kitosan 0.2% + EBK 5% rata-rata jumlah koloninya 30 dan pada kitosan 0.2% + EBK 7.5% tidak ada dijumpai pertumbuhan koloni bakteri.
Pada konsentrasi kitosan 0.4% + EBK 1% memiliki rata-rata 3.5 koloni. Rata-rata jumlah koloni pada kitosan 0.4% + EBK 2.5% adalah 1 koloni. Pada konsentrasi kitosan 0.4% + EBK 5% memiliki 5.5 koloni, dan pada konsentrasi kitosan 0.4% + EBK 7.5% rata-ratanya 2 koloni.
Rata-rata jumlah koloni pada kitosan 0.6% + EBK 1% adalah 4.5 dan pada kitosan 0.6% + EBK 2.5% adalah 9.5 koloni. Pada konsentrasi kitosan 1% + EBK 1% memiliki rata-rata 4.5 koloni, sementara pada konsentrasi kitosan 1% + EBK 2.5% memliki rata-rata 1 koloni, dan pada konsentrasi kitosan 1% + EBK 5% memiliki rata-rata 0.5 koloni.
Tabel 4 : HASIL PERCOBAAN JUMLAH KOLONI PADA KONSENTRASI 104 PADA INKUBASI 6 JAM
Konsentrasi bahan coba Percobaan Rata-rata
1 2
Pada tabel 4 menunjukkan bahwa rata-rata jumlah koloni pada konsentrasi bakteri 104 dengan waktu inkubasi 3 jam dengan konsentrasi bahan coba kitosan 0.2% + EBK 1% adalah 3.5 koloni. Pada konsentrasi kitosan 0.2% + EBK 2.5% rata-ratanya 45 koloni, sedangkan pada konsentrasi kitosan 0.2% + EBK 5% memiliki rata-rata 49.5 koloni, dan pada konsentrasi kitosan 0.2% + EBK 7.5% memiliki 54.5 koloni.
Rata-rata jumlah koloni pada konsentrasi 0.4% + EBK 1% adalah 5 koloni, sementara pada kitosan 0.4% + EBK 2.5% adalah 3 koloni, pada konsentrasi kitosan 0.4% + EBK 5% rata-ratanya 18.5 koloni, dan pada konsentrasi kitosan 0.4% + EBK 7.5% memiliki rata-rata 8.5 koloni. Pada kitosan 0.6% + EBK 1% rata-rata jumlah koloninya sama dengan kitosan 1% + EBK 5% yaitu 0.5 koloni.
Tabel 5 : HASIL PERCOBAAN JUMLAH KOLONI PADA KONSENTRASI 108 PADA INKUBASI 6 JAM
Konsentrasi bahan coba Percobaan Rata-rata
1 2
Kitosan 0.2% EBK 1% 0 0 0
Kitosan 0.2% EBK 2.5% 0 0 0
Kitosan 0.2% EBK 5% 0 0 0
Kitosan 0.2% EBK 7.5% 0 0 0
Kitosan 0.4% EBK 1% 0 0 0
Kitosan 0.4% EBK 2.5% 0 0 0
Kitosan 0.4% EBK 5 % 0 0 0
Kitosan 0.4% EBK 7.5% 0 0 0
Kitosan 0.6% EBK 1% 0 0 0
Kitosan 0.6% EBK 2.5% 0 0 0
Kitosan 0.6% EBK 5% 0 0 0
Kitosan 0.6% EBK 7.5% 0 0 0
Kitosan 1% EBK 1% 0 0 0
Kitosan 1% EBK 2.5% 0 0 0
Kitosan 1% EBK 5% 0 0 0
Kitosan 1% EBK 7.5% 0 0 0
Kontrol bakteri 0 0 0
BAB 6
PEMBAHASAN
Penelitian eksperimental laboratorium secara in vitro mengenai kitosan blangkas sebagai perancah ekstrak batang kemuning terhadap F.nucleatum adalah untuk membuktikan bahwa kitosan blangkas sebagai perancah ekstrak batang kemuning memiliki efek antibakteri dalam menghambat pertumbuhan F.nucleatum. Dalam penelitian ini, telah dilakukan prosedur ekstraksi batang kemuning dengan menggunakan pelarut etanol 80% karena senyawa aktif yang terdapat pada batang kemuning dapat larut dengan etanol 80%. Konsentrasi pelarut yang digunakan adalah konsentrasi yang sedang dengan tujuan agar pelarut tidak mudah menguap dan tidak susah untuk mengeringkan pelarutnya. Selain itu, pelarut etanol merupakan pelarut yang lebih aman dari metanol. Batang kemuning yang digunakan adalah batang yang segar dan dikeringkan dalam lemari pengering. Batang kemuning yang digunakan sebanyak 500 gram dan menghasilkan ekstrak kental yang cukup untuk dilakukan pengujian antibakteri terhadap F.nucleatum.
Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini adalah dengan cara maserasi. Adapun tujuan maserasi adalah untuk memberikan kesempatan simplisia untuk berdifusi ke dalam pelarut. Setelah itu, dilakukan perkolasi hingga diperoleh
maserat cair, kemudian dilakukan penguapan dengan menggunakan Vaccum Rotary Evaporator untuk memisahkan antara ekstrak dengan etanol dan juga menghindari
terjadinya kerusakan kandungan kimia dari bahan yang diekstraksi.
Kitosan yang akan digunakan kitosan blangkas komersil yaitu kitosan bermolekul tinggi dengan berat molekul 810.000 Mv (Harry A, 2005) yang berasal dari cangkang hewan laut.
mikroorganisme, sehingga hasil yang diperoleh lebih akurat bila dibandingkan dengan metode difusi.
Pada penelitian ini, konsentrasi yang digunakan untuk ekstrak batang kemuning ialah 1%, 2.5%, 5%, dan 7.5% karena pada penelitian sebelumnya Steven P. (2007) menggunakan konsentrasi yang sama dan hasilnya adalah dari masing-masing kosentrasi dapat menghambat pertumbuhan bakteri S. mutans. Untuk kitosan blangkas, konsentrasi yang digunakan adalah 1%, 0.6%, 0.4%, dan 0.2%. Peneliti menggunakan metode pengamatan zona bening pada cakram untuk menentukan daya hambat bakteri. Penggunaan metode ini dilakukan pada peneliti sebelumnya supaya lebih mudah dalam melihat zona hambat bakteri.
Peneliti mengkultur F.nucleatum dengan menggunakan media Brain Heart Infusion (BHI) karena F.nucleatum dapat tumbuh dengan baik dalam media BHI. Penelitian sebelumnya menggunakan media MHA untuk mengkultur bakteri, tetapi disebabkan bakteri yang berbeda, maka peneliti menggunakan media BHI.
Peneliti juga menggunakan 2 konsentrasi bakteri yang berbeda yaitu 104 dan 108 untuk melihat apakah bakteri yang terhambat oleh kitosan blangkas sebagai
perancah ekstrak batang kemuning tergantung pada konsentrasi bakteri yang digunakan, atau tergantung pada konsentrasi kitosan blangkas sebagai perancah ekstrak batang kemuning yang digunakan.
Penelitian ini juga menggunakan interval waktu inkubasi untuk mengetahui perbedaan jumlah bakteri yang terhambat pada waktu inkubasi yang berbeda yaitu selama 3 jam dan 6 jam, seperti yang sudah dikemukakan oleh peneliti sebelumnya (Thilages 2012) dengan pemberian waktu untuk bakteri tumbuh dan berinteraksi dengan ekstrak bahan selama 3 jam dan 6 jam. Interval waktu ini adalah sesuai dengan kurva pertumbuhan bakteri dimana bakteri akan berada dalam fase pertumbuhan yang optimal.
zona bening diduga akibat bahan coba EBK yang berwarna hijau kehitaman, sehingga ketika diuji semua konsentrasi bahan coba berwarna hijau kehitaman, coklat keruh dan tidak jernih sehingga tidak representatif untuk dicari nilai daya hambatnya. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efek antibakteri dengan menggunakan metode yang lain.
Pada penelitian digunakan juga metode hitung jumlah koloni bakteri, yang mana setelah ditanam di BHI agar dan diinkubasi selama 24 jam, diperoleh pada konsentrasi bahan coba K 0.6% + EBK 2.5% dengan konsentrasi bakteri 104 di mana tidak terdapat pertumbuhan bakteri pada BHI agar sehingga tampak permukaan jernih.
Dari hasil penelitian, semua konsentrasi bahan coba mampu menghambat pertumbuhan F.nucleatum. Dalam waktu inkubasi 3 jam dengan konsentrasi bakteri 104, tidak dapat dijumpai bakteri yang mati total. Konsentrasi bahan coba yang paling efektif dalam menghambat pertumbuhan F.nucleatum adalah pada K 1% + EBK 5%, K 1% + EBK 2.5%, dan K 0.6% + EBK 2.5%, dimana nilai CFU/ml terendah bila dibandingkan dengan konsentrasi bahan coba yang lain. Sedangkan, dalam waktu
inkubasi 3 jam dengan konsentrasi bakteri 108, ada dijumpai bakteri yang mati total sehingga terdapat permukaan yang jernih di atas BHI agar, yaitu pada konsentrasi K 0.2% + EBK 7.5%.
Apabila waktu inkubasi 6 jam dengan konsentrasi bakteri 104, maka konsentrasi bahan coba yang paling efektif dalam menghambat pertumbuhan F.nucleatum adalah pada K 1% + EBK 7.5%, K 1% + EBK 2.5%, K 1% + EBK 1%, K 0.6% + EBK 7.5%, K 0.6% + EBK 5%, dan K 0.6% + EBK 2.5%, dimana tidak dijumpai adanya koloni bakteri yang tumbuh di atas agar.
tersebut juga dapat terjadi akibat lama waktu inkubasi yang menyebabkan bakteri tidak dapat tumbuh pada media.
Dari hasil penelitian yang dilakukan terdapat perbedaan efek antibakteri ekstrak batang kemuning terhadap beberapa jenis bakteri. Penelitian yang dilakukan Steven (2007) menunjukkan bahwa adanya peningkatan besar konsentrasi bahan coba maka memiliki korelasi positif terhadap peningkatan efek antibakteri terhadap pertumbuhan Streptococcus mutans.11 Sedangkan hasil yang didapat pada penelitian ini tidak menunjukkan adanya peningkatan efek antibakteri bila besar konsentrasi bahan coba mengalami peningkatan. Adanya perbedaan hasil penelitian bisa disebabkan karena bakteri yang digunakan pada penelitian sebelumnya merupakan bakteri aerob yaitu Streptococcus mutans, sementara bakteri yang digunakan peneliti merupakan bakteri anerob yaitu F.nucleatum. Selain itu, hal tersebut bisa disebabkan karena dalam penelitian ini digunakan waktu inkubasi 3 jam dan 6 jam yang dapat memengaruhi daya hambat terhadap pertumbuhan bakteri.
Dalam penelitian ini, diketahui bahwa dalam waktu inkubasi 3 jam dengan konsentrasi bakteri 104, konsentrasi bahan coba yang paling memiliki efek antibakteri
terhadap pertumbuhan F.nucleatum adalah pada K 1% + EBK 5%, K 1% + EBK 2.5%, dan K 0.6% + EBK 2.5%,. Sedangkan pada waktu inkubasi 6 jam dengan konsentrasi bakteri 104, konsentrasi bahan coba yang paling efektif adalah pada K 1%
Pada penelitian yang telah dilakukan juga terdapat kesalahan peneliti yang mana untuk melakukan uji analisis data diperlukan lebih dari tiga data, sementara pada penelitian yang dilakukan hanya memiliki dua data di mana hanya dilakukan dua kali pengulangan pada tiap konsentrasi bahan coba.
BAB 7
KESIMPULAN DAN SARAN
7.1 Kesimpulan
Dari penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa kitosan sebagai perancah dengan ekstrak batang kemuning memiliki efek antibakteri dan mampu menghambat pertumbuhan F.nucleatum. Pada percobaan yang dilakukan dengan waktu inkubasi 3 jam dan konsentrasi bakteri 104, makakonsentrasi bahan coba yang paling efektif adalah K 0.6% + EBK 2.5%, dimana konsentrasi tersebut memiliki jumlah koloni bakteri terendah. Apabila waktu inkubasi 3 jam dan konsentrasi bakteri 108, maka konsentrasi bahan coba yang paling efektif adalah K 0.2% + EBK 7.5% dimana tidak dijumpai adanya koloni bakteri. Bila waktu inkubasi 6 jam dengan konsentrasi bakteri 104, maka konsentrasi bahan coba yang paling efektif dalam menghambat pertumbuhan F.nucleatum adalah K 0.6% + EBK 2.5%, dimana tidak dijumpai adanya koloni bakteri.
7.2 Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui Kadar Hambat Minimum dan Kadar Bunuh Minimum.
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efek antibakteri dari bahan coba terhadap bakteri patogen endodontik lainnya.
DAFTAR PUSTAKA Pelarut Gliserin Sebagai Alternatif Bahan Dressing Saluran Akar Terhadap Candida Albicans. Indonesian J Dent 2010; 15(1): 71-4.
4. Rathke A, Meisohle D, Bokelmann J, Haller B. Antibacterial Activity of Calcium Hydroxide and Chorhexidine Containing Points Against F.nucleatum and Parvimonas micra. Europe J Dent 2012; 6: 434-9.
5. Haraldsson G. Oral Comensal Provotella species and F.nucleatum: Identification and Potential Pathogenic Role. Dissertation. Helsinki: Faculty of Medicine of the University of Helsinki, 200554k,: 16-7, 23-5.
6. Yuliusman, Adelina PW. Pemanfaatan Kitosan dari Cangkang Rajungan pada Proses Adsorpsi Logam Nikel dari Larutan NiSO4. Seminar Rekayasa Kimia Jur. Teknik Kimia Udiponegoro 2010: 1-7.
7. Banurea FE, Trimurni A. Antibacterial Effect of High Molecule Chitosan Blangkas ( Limulus Polyphenus) Against F.nucleatum. Arch Orofasial Sc Kelantan, Malaysia2008: 3(2): 73.
8. Fania R, Trimurni A. Efek Kitosan Blangkas Bermolekul Tinggi dengan Pelarut Gliserin dan VCO Terhadap F.nucleatum. e-repository USU 2009: 63-76.
9. Mauth C, Huwig A, Graf-Hausner U, Roulet JF. Restorative Applications for Dental Pulp Therapy. Topics in Tissue Engineering 2007; 3: 1-32.
10.Sulaksana J, Jayusman DI. Kemuning dan Jati Belanda. Jakarta: Penebar Swadaya, 2005: 10-2, 19-21.
11.Steven P, Trimurni A. Perbedaan Daya Antibakteri Senyawa Aktif Batang Kemuning dan Batang Siwak Terhadap Pertumbuhan Streptococcus mutans. Skripsi USU 2007: 42-49.
12.Trimurni A. Inovasi Perawatan Konservasi Gigi melalui Teknologi Tissue Engineering. Pidato Pengukuhan Jabatan Guru Besar USU 2007: 7-8.
