PEMBUATAN NUKLEOTIDA BERTANDA [γ- 32 P]ATP SEBAGAI PELACAK MUTASI GENETIK.

PEMBUATAN NUKLEOTIDA BERTANDA [γ-

32

_P]ATP

SEBAGAI PELACAK MUTASI GENETIK.

Wira Y Rahman, Endang Sarmini, Herlina, Azmairit Aziz,Triyanto, Hambali

Pusat Teknologi Nuklir Bahan Radiometri- BATAN E-mail: wira@batan.go.id

ABSTRAK

PEMBUATAN NUKLEOTIDA BERTANDA [γ-32P]ATP SEBAGAI PELACAK MUTASI GENETIK. Penyakit akibat infeksi atau ketidaknormalan genetik dapat didiagnosa

dengan mendeteksi deret asam nukleatnya yang spesifik untuk setiap penyakit, diagnosa meliputi PCR (Polymerase Chain Reaction) dan hibridisasi dot blot menggunakan pelacak berlabel radioaktif P-32 yaitu nukleotida bertanda [γ-32P]ATP. Metode untuk mendeteksi gen tersebut menggunakan teknik Southern Blotting. Pembuatan nukleotida bertanda ini dilakukan dengan reaksi enzimatis yang merupakan bagian dari proses glikolisis, diawali dari fruktosa 1,6-diphosphat, nukleotida ADP dan H332PO4 dengan menggunakan enzim aldolase, gliseraldehid 3-phosphat, 3-phosphogliseratkinase dan laktat dehidrogenase. Sementara karakterisasinya menggunakan Thin Layer Chromatography (TLC) PEI Cellulose dan Liquid Scintilation Counter (LSC). H332PO4 yang digunakan mempunyai kemurnian radiokimia 99,85% sedangkan ATP bertanda yang dihasilkan dengan penambahan air

pada temperatur 36⁰C berada pada Rf 0,2 dengan hasil penandaan 33,46%. Hasil

penelitian ini diharapkan sebagai acuan produksi nukleotida bertanda lainnya.

Kata kunci : nukleotida bertanda [γ-32P]ATP, reaksi enzimatis, proses glikolisis

ABSTRACT

PRODUCTION OF LABELED NUCLEOTIDE [γ-32

P])ATP AS THE GENETIC MUTATION TRACKER. Infectious disease or genetic abnormality can be diagnosed

by detecting the nucleic acid sequence that are specific to each disease, diagnostics includes PCR and dot blot hybridization using P-32 labeled tracer that is labeled nucleotide [γ-32P]ATP. The method to detect the gene using Southern Blotting technique. The preparation of labeled nucleotides is done by enzimatic reactions that are part of the glycolisis pathway, starting from fructose 1.6-diphosphate, ADP nucleotide, and H332PO4, using the enzym aldolase, glyseraldehide phosphate, 3-phosphoglycerate kinase, and lactate dehydrogenase. While its characterization using Thin Layer Chromatography (TLC) PEI Cellulose and Liquid Scintilation Counter (LSC). H332PO4 who used to have radiochemical purity of 99.85% while ATP labeled which is produced by adding water at a temperature of 36⁰C marked at Rf 0.2 with 33.46% tagging results. Labeled nucleotide [γ32P]-ATP which is resulted as basis for other labeled nucleotide synthesis.

Key word : [γ-32P]ATP labeled nucleotide, enzimatic reaction, glycolysis pathways

PENDAHULUAN

elama dekade terakhir ini aplikasi radioisotop telah berkembang dengan cepat tidak hanya digunakan dalam pencitraan untuk memperoleh informasi fungsional suatu zat senyawa, juga untuk mendalami berbagai macam proses fisiologi dan patologi. Kendala utama dalam pengobatan penyakit infeksi adalah ditemukannya organisme yang tahan terhadap obat, antibiotika atau insektisida yang disebabkan adanya mutasi

genetik. Diagnosis penyakit infeksi dengan biologi molekul adalah mendeteksi asam nukleat mikroorganisme penyebab dengan menggunakan pelacak DNA. Untuk mendeteksi kelainan genetik yang diakibatkan oleh virus, kuman atau bakteri dapat dengan pelacak DNA/RNA menggunakan teknik Southern Blotting [1,4,5,6]. Dimana prinsip dari teknik tersebut adalah memisahkan sampel DNA utas ganda menjadi utas tunggal dan mentransfernya ke membran nilon. Saat diinkubasi dengan membran dalam larutan, pelacak mengikat

bagian-bagian yang merupakan pasangannya dalam DNA dan "melekat" pada membran. Setelah itu, dilakukan kontak antara membran dengan selembar film fotografis yang sensitif terhadap emisi radioaktif. Hanya bagian-bagian dari sampel tempat lokasi gen yang terlihat sebagai titik gelap pada film, karena hanya bagian itulah yang terikat pada pelacak radioaktif.

Salah satu radioisotop yang bisa digunakan untuk pelacak DNA/RNA adalah P-32 dalam senyawa [γ-32

P]ATP. Pemanfaatan teknologi nuklir [γ-32

P]ATP dalam bidang kesehatan menggunakan teknik biologi molekul dengan cara mendeteksi DNA virus, kuman atau bakteri tersebut, melalui DNA virus bisa diketahui apakah virus tersebut menjadi penyebab kanker atau bukan, DNA kuman tersebut sudah resisten atau tidak dengan antibiotika yang akan digunakan

[3,4,8]

. Sehingga bisa diketahui lebih awal dan bisa ditentukan pengobatan yang tepat dan jangka waktu pengobatan sehingga pengobatan lebih efektif dan efisien.

Proses pembuatan [γ-32

P]ATP dapat dilihat pada Gambar 1., dimana sintesis

[γ-32

P]ATP dilakukan dengan penandaan senyawa nukleotida secara enzimatis, dengan memanfaatkan proses glikolisis. Diawali dari perubahan fruktosa -1, 6-difosfat yang memiliki 6 buah atom C menjadi 3-difosfogliseral-dehida (dengan 3 buah atom C) dan dihidroksi-aseton-fosfat dengan bantuan enzim aldolase. Dihidroksi aseton fosfat kemudian menjadi 3-

fosfogliseral-dehida juga dengan pertolongan enzim glycerol -3- phosphate dehydrogenase. Selanjutnya fosfogliseraldehida bersenyawa dengan suatu asam fosfat (H332PO4) dan berubah menjadi 1,3 –

disfosfogliseraldehida. 1,3 – difosfogliseraldehida berubah menjadi asam 1,3 –difosfogliserat dengan bantuan enzim dehidrogenase serta ion – ion Mg++, membantu proses ini. Perubahan terakhir dalam glikolisis adalah pelepasan satu fosfat dari asam 2-fosfoenol piruvat menjadi asam piruvat, sedang ADP meningkat menjadi ATP. Pada proses enzimatis ini ada faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim yaitu : temperatur, kadar air, pH (derajat keasaman), konsentrasi enzim dan substrat serta zat-zat penghambat (inhibitor) [1,2,3].

Pada penelitian ini dilakukan pembuatan [γ-32

P]ATP dari H332PO4 dengan reaksi enzimatis.

H332PO4 direaksikan dengan campuran enzim dan

diinkubasikan dengan memvariasikan waktu inkubasi, kadar air dan temperatur, diharapkan dari penelitian ini diperoleh senyawa nukleotida bertanda [γ-32

P]ATP dengan kemurnian yang memenuhi persyaratan yang diizinkan. Sehingga penelitian ini bisa memenuhi kebutuhan senyawa nukleotida bertanda [γ-32

P]ATP di Indonesia, dalam rangka pemberantasan penyakit mutasi genetik yang diakibatkan oleh virus, kuman atau bakteri. Dan juga akan sangat mendukung peningkatan kemampuan di bidang biologi molekul dan dapat mengurangi ketergantungan impor.

Gambar. 1. Bagian dari proses glikolisis dengan reaksi enzimatispembentukan ADP menjadi ATP dengan penambahan fosfat radioaktif (H332PO4)

TATA KERJA

Bahan Yang Digunakan

Bahan-bahan yang digunakan adalah H332PO4 bebas pengemban dengan kemurnian

radiokimia diatas 97 % yang diperoleh dari pemurnian H332PO4 yang diproses di PTNBR

Bandung. Enzim aldolase 9 unit/mg, 10 mg/ml, gliseraldehid-3-phosphat dehidrogenase 80 unit/mg, 10 mg/ml, phosphogliserat kinase 450 unit/mg, 10 mg/ml, fruktosa 1.6-bisphosphat, sodium pyruvat, dithiothreitol, Tris-HCL, EDTA dari Sigma Aldrich, laktat dehidrogenase 250 unit/mg, 5 mg/ml, ADP, β-NAD, magnesium klorida dari E.Merck.

Bahan penunjang yang digunakan kolom kromatografi DEAE Sephadex dengan pendingin, TLC plastik PEI Cellulose dari E.Merck, kertas indikator pH universal serta peralatan gelas dan mikrotube.

Alat Yang Digunakan

Peralatan yang digunakan refrigerator sentrifus, penangas air Memmert, Mini TLC Scanner Bioscan AR-2000, dan LSC.

1. Preparasi pereaksi campuran yang digunakan Pembuatan larutan campuran A : 100 μl campuran berikut ini dibuat dalam satu mikrotube 500 mM Tris-HCl  120 mM Magnesium Klorida  (pH 8.0) 50 μl 1 mM EDTA  125 mM Natrium piruvat 20 μl 200 mM Dithiothreitol 15 μl 20 mM FDP 5 μl 5 mM ADP 5 μl 20 mM β-NAD 5 μl

2. Preparasi pereaksi campuran untuk pelarutan pellet enzim

Pembuatan larutan campuran B : 50 μl larutan berikut disiapkan dalam satu miktotube 500 mM Tris-HCl  120 mM Magnesium Klorida  (pH 8,0) 5 μl 1 mM EDTA  200 mM Dithiothreitol 1,5 μl air 43,5 μl

3. Preparasi campuran enzim

Pembuatan campuran enzim : 12 μl campuran enzim berikut dibuat didalam satu mikrotube Aldolase 6 μl (0,54 units) Glyceraldehydes 3-phosphate

dehydrogenase

2 μl (1,6 units) Lactate dehydrogenase 2 μl (2,5 units) 3-phosphoglycerate kinase 2 μl (0,9 units)

Campuran enzim tersebut disentrifuse pada kecepatan 15000 rpm selama 20 menit Setelah diambil cairan supernatantnya, endapannya dilarutkan dengan 10 μl larutan campuran B. 4. Proses penandaan [γ-32P]ATP

Ke dalam mikrotube bervolume 1,5 ml dimasukkan 40 μl H332PO4 (aktivitas terukur)

diatur pH 7 – 9 dengan larutan NaOH 5 M. Selanjutnya ke dalam larutan tersebut ditambahkan berturut-turut 40 μl larutan campuran A dan 10 μl campuran enzim. Inkubasi dilakukan selama (t) menit dan dicuplik setiap waktu tertentu selama 1 jam. Reaksi dihentikan dengan memasukkan mikrotub ke dalam penangas air pada temperatur 70⁰C selama 3 menit untuk menghentikan aktivitas enzim.

5. Pengujian hasil penandaan [γ-32P]ATP

Hasil penandaan diuji dengan KLT PEI

Cellulose sebagai fasa diam dan KH2PO4 0,5 M

pH 3,5 sebagai fasa gerak. Kemudian ditentukan Rf-nya dengan Bioscanner.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Radioisotop P-32, berupa larutan H332PO4 (dalam bentuk orto-fosfat) ternyata tidak stabil selama beberapa hari penyimpanan dan mudah berubah menjadi senyawa polifosfat. Hasil pemeriksaan H332PO4 dengan Bioscanner seperti ditampilkan pada Gambar 2., terlihat bahwa kemurnian H332PO4 86,48 % dan Rf-nya pada 0,7, dengan kemurnian di bawah 97% ini bisa mengakibatkan terjadinya proses inhibisi yang akan menghambat kerja enzim, sehingga proses sintesis [γ-32P]ATP tidak bisa maksimal. Untuk mengatasi hal tersebut H332PO4 yang akan digunakan harus dimurnikan terlebih dahulu ke dalam kolom penukar kation Dowex AG 50 (1 x 8) yang telah dikondisikan dengan HCl 1M, sehingga diperoleh larutan H332PO4 dengan kemurnian radiokimia yang tinggi dan layak digunakan untuk pembuatan nukleotida bertanda [γ-32P]ATP.

Gambar 2. Radiokromatogram dari larutan H332PO4 sebelum proses pemurnian

Pengujian kemurnian radiokimia dilakukan dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) PEI cellulose, dengan melewatkan larutan H332PO4

ke dalam kolom terjadi peningkatan kemurnian larutan H332PO4 dari 86,48 % menjadi 99,85 %

seperti terlihat pada Gambar 2 dan Gambar 3.

Gambar 3.Radiokromatogram dari larutan H332PO4

setelah proses pemurnian

Larutan H332PO4 setelah proses pemurnian

ini diinkubasikan dengan campuran enzim, selama reaksi enzimatik berlangsung pada tiap (t) menit inkubasi dicuplik untuk melihat pembentukan

[γ-32

P]ATP yang diuji dengan KLT PEI Cellulose. Hasil pemeriksaan KLT PEI cellulose menggunakan bioscanner dari reaksi inkubasi tersebut dapat dilihat pada Gambar 4. Pada gambar tersebut menunjukkan hasil penandaan [γ-32

P]ATP 33,46 %, dengan nilai Rf 0,241. Selain itu dari hasil penandaan tersebut masih terdapat H332PO4

bebas dengan persentase 65,90% dengan Rf 0,608. Rendahnya hasil penandaan [γ-32

P]ATP tersebut disebabkan oleh beberapa faktor yang dapat mempengaruhi tidak maksimalnya daya kerja campuran enzim, yaitu kadar air dan temperatur.

Gambar 4. Radiokromatogram pembentukan

[γ-32

P]ATP setelah inkubasi (60) menit Pada Gambar 5. terlihat penambahan kadar air sebanyak 50 μl sangat berpengaruh terhadap persentase rendemen penandaan

[γ-32

P]ATP yang dihasilkan, dibandingkan dengan tanpa penambahan kadar air. Selain itu dari Gambar 5. terlihat pola yang hampir sama antara reaksi yang ditambahkan kadar air dan yang tidak ditambahkan kadar air untuk waktu inkubasi (t) 50 menit dan (t) 60 menit, dimana ADP telah terfosforilasi menjadi ATP sehingga pembentukan [γ-32

P]ATP sudah stabil.

Sedangkan pengaruh temperatur terhadap hasil penandaan [γ-32

P]ATP ditampilkan pada Gambar 6., dari gambar tersebut menunjukan bahwa pada suhu 36⁰C mempunyai rendemen pembentukan lebih tinggi dibandingkan pada suhu kamar (22⁰C). Adanya perbedaan tersebut dikarenakan kerja enzim lebih maksimal dengan adanya penambahan air pada temperatur 36⁰C dengan persentase penandaan 33,46 %.

Gambar 5. Pengaruh penambahan kadar air (50 μl) pada hasil penandaan [γ-32

Gambar 6. Pengaruh temperatur pada hasil penandaan [γ-32P]ATP

KESIMPULAN

Larutan H332PO4 yang digunakan untuk

pembuatan nukleotida bertanda [γ-32

P]ATP dalam penyimpanannya tidak stabil mudah berubah menjadi senyawa polifosfat. Sebelum digunakan terlebih dahulu dimurnikan untuk meningkatkan kemurnian radiokimianya. Setelah dilakukan proses pemurnian didapatkan hasil pemurnian larutan H332PO4 meningkat menjadi 99,85%.

Pembuatan nukleotida bertanda [γ-32

P]ATP menggunakan larutan H332PO4 hasil pemurnian

dengan campuran enzim menghasilkan rendemen pembentukan 33,46 % dengan Rf 0,241 setelah ditambahkan air dan temperatur inkubasi 36⁰C. Diharapkan rendemen hasil penandaan bisa mencapai diatas 90%. Hasil penandaan ini dipengaruhi oleh kadar air reaktan, temperatur dan waktu inkubasi. Untuk meningkatkan hasil penandaan perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menaikkan aktivitas H332PO4 yang

digunakan.

UCAPAN TERIMAKASIH

Penulis mengucapkan terimakasih kepada sejawat dari PTNBR – BATAN Bandung, atas kerjasamanya yang baik dalam penyediaan P-32 (H332PO4), Bapak Abdul Mutalib yang telah

memberikan kepercayaan untuk melakukan penelitian ini, Ibu Santi Nurbaiti dari Kelompok Keahlian Biokimia, Fakultas Matematika & Ilmu Pengetahuan Alam, ITB dan Bapak Sunarhadiyoso S. yang telah membantu dalam penulisan ini.

DAFTAR PUSTAKA

1. Lehninger, A.L,”Dasar-dasar Biokimia Jilid I”, Erlangga, Jakarta, 1982

2. Roger A. Johnson, Timothy F. Walseth,”Enzymatic Process For Preparing

[γ-32

P]-Labeled Nucleotides”, United State Patent, 1980

3. F. Sakamoto, M. Izumo, K. Hashimoto, Y. Fuji,”Study of optimum condition for synthesis of [y-32P]ATP with high specific radioactivity”, Journal of Radioanalytycal and Nuclear Chemistry, Vol. 239, No.2 (1999) 423-427.

4. Mukh Syaifudin dan Devita Tetriana, “ANALISIS MUTASI GEN inhA UNTUK UJI RESISTENSI M. tuberculosis TERHADAP ISONIAZID DENGAN METODE SSCP RADIOAKTIF”, Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi, BATAN Jakarta

5. Maria Lina R, “Deteksi Resistensi

Mycobacterium Tuberculosis Terhadap

Rifampisin Berdasarkan Mutasi Gen RPOO (RNA Polymerase Sub Unit B) Dengan Metode PCR (Polymerase Chain Reaction) - Hibridasi DOT Blot dan PCR-Sekuensing, Jurnal Respir Indo, Vol 7, no. 3 Juli 2007

6. Suharsono, ”Struktur dan Ekspresi gen”, Jurusan Bilologi FMIPA Institut Pertanian Bogor.

7. Maria Lina R, Budiman Bela, dan Andi Yasmon, ”Deteksi Mutasi Gen KATG (Mycobacterium Tuberculosis) dengan Metode PCR (Polymerase Chain Reaction) – Hibridisasi Dot Blot menggunakan Pelacak Oligonukleotida Bertanda 32P”, Jurnal Ilmiah

Aplikasi Isotop dan Radiasi Vol. 5 No. 1 Juni 2009.

8. Budiawan, ”Pengembangan Teknik 32P-Postlabelling untuk Mendeteksi Dini Resiko Kanker”, Risalah Pertemuan Ilmiah Penelitian dan Pengembangan Teknologi Isotop dan Radiasi, 2000.

9. Wira Y Rahman, Endang Sarmini, Herlina, dkk, ”Sintesa ATP Bertanda P-32 Sebagai Perunut Biologi Molekul”, Pertemuan Ilmiah Radioisotop, Radiofarmaka dan Siklotron, 2010.

10. IAEA-TECDOC-1340,”Manual for Reactor Produced Radioisotop”, International Atomic Energy Agency, IAEA, January 2003.

TANYA JAWAB Budi Setiawan  Apa arti PCR ?

 Hasil Randemen 33,46% apakah sesuai target?

Wira Y Rahman

 Arti PCR adalah Polymerase Chain Reaction,

reaksi untuk melipatgandakan fragmen-fragmen DNA yang sudah berhasil diisolasi

 Sebetulnya randemen pembentukan 33,46%

belum mencapai target yang diinginkan, diharapkan rendemen pembentukannya adalah diatas 90% banyak faktor yang mempengaruhi randemen pembentukan tersebut, yang terutama adalah enzim-enzim yang digunakan, sama seperti radioisotop enzimpun mempunyai waktu paruh