Ringkasan Pengkajian Keamanan Pangan Kedelai PRG Event MON 89788
I. Pendahuluan
Kedelai PRG event MON 89788 merupakan kedelai generasi kedua dari kedelai (Glycine max (L.) Merr.) yang toleran terhadap glifosat yang dikembangkan melalui penyisipan gen CP4 EPSPS melalui teknik transformasi mediasi vektor Agrobacterium tumefaciens ke dalam jaringan meristem kedelai.
Berdasarkan Peraturan Kepala Badan POM Nomor HK.00.05.23.3541 Tahun 2008 tentang Pedoman Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik, TTKHKP telah melakukan pengkajian keamanan pangan kedelai PRG event MON 89788 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pangan yang terdiri atas kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas sebagaimana diuraikan di bawah ini.
II. Informasi Genetik
II.1 Elemen Genetik
Kedelai PRG event MON 89788 mengandung satu gen interes yaitu CP4 EPSPS. EPSPS adalah 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase yang bertanggung jawab dalam toleransi terhadap herbisida glifosat.
Promoter yang digunakan adalah promoter kimera yang menggabungkan promoter FMV-35S (35S dari Figwort Mosaic Virus) dengan promoter TSF1 dari Arabidopsis thaliana, dengan terminator RbcS2 (ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase small subunit gen E9 dari Pisum sativum).
II.2 Sumber Gen Interes
Gen EPSPS berasal dari Agrobacterium tumefaciens strain CP4. Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri tanah yang bukan merupakan sumber alergen atau zat yang bersifat toksik terhadap manusia. Gen EPSPS di dalam kedelai PRG event MON 89788 mengekspresikan toleransi terhadap herbisida yang mengandung glifosat.
II.3 Sistem Transformasi
Kedelai PRG event MON 89788 dirakit melalui teknik transformasi dengan mediasi vektor Agrobacterium tumefaciens menggunakan plasmid PV-GMGOX20 pada meristem tanaman kedelai galur A3244.
II.4 Stabilitas Genetik
Analisis stabilitas genetik integrasi gen interes dari kedelai PRG event MON 89788 dengan Southern blot menunjukkan bahwa gen CP4 EPSPS stabil sampai empat generasi. Stabilitas genetik pewarisan sifat toleransi terhadap herbisida glifosat kedelai PRG event MON 89788 mengikuti prinsip hukum Mendel. Data dari analisis Southern blot menunjukkan bahwa kedelai PRG event MON 89788 mengandung satu kopi insert gen CP4 EPSPS, dan tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi PV-GMGOX20.
Berdasarkan hasil pengkajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa :
1. Kedelai PRG event MON 89788 mengandung satu kopi insert gen CP4 EPSPS; 2. Kedelai PRG event MON 89788 tidak mengandung sekuen backbone dari
plasmid transformasi PV-GMGOX20;
3. Gen interes CP4 EPSPS yang diintroduksikan ke kedelai PRG event MON 89788 masih stabil pada empat generasi; dan
4. Gen interes CP4 EPSPS yang diintroduksikan ke kedelai PRG event MON 89788 diwariskan mengikuti hukum Mendel.
III. Informasi Keamanan Pangan
III.1 Kesepadanan Substansial
Hasil pengkajian kesepadanan substansial kedelai PRG event MON 89788 secara lengkap telah dipublikasikan dalam Journal of Agricultural and Food Chemistry Volume 56, halaman 4611-4622, tahun 2008. Jurnal internasional ini diterbitkan oleh American Chemical Society melalui penilaian oleh peer review team. Artikel tentang kesepadanan substansial kedelai PRG event MON 89788 dalam jurnal ini ditulis oleh Lundry D.R., Ridley W.P., Meyer J.J., Riordan S.G., Nemeth M.A., Trujillo W.A., Breeze M.L. dan Sorbet R. dengan judul: “Composition of Grain, Forage and Processed Fractions from Second-Generation Glyphosate-Tolerant Soybean, MON 89788 is Equivalent to That of Conventional Soybean (Glycine max L.)”.
Dalam pengkajian kesepadanan substansial ini, kedelai PRG event MON 89788 dibandingkan dengan kedelai non PRG yaitu kedelai varietas A3244 dan berbagai varietas non PRG lainnya.
Penanaman kedelai PRG event MON 89788 untuk tujuan pengkajian kesepadanan subtansial ini dilakukan dalam kondisi lingkungan yang berbeda di 10 lokasi di USA dan Argentina selama musim tanam tahun 2004-2005. Lokasi penanaman di Argentina adalah tiga di provinsi Buenos Aires dan masing-masing satu di provinsi Cordoba dan Santa Fe. Sedangkan lokasi penanaman di USA adalah masing-masing satu di Arkansas, Nebraska dan Ohio, serta dua di Illinois.
Analisis komposisi yang dilakukan cukup luas, yaitu sebanyak 63 komponen dari sampel biji kedelai dan seluruh bagian tanaman (forage). Komponen dari sampel forage yang dianalisis adalah termasuk analisis proksimat (protein, lemak, abu, kadar air, dan karbohidrat yang ditetapkan secara perhitungan), Acid Detergent Fiber (ADF), dan Neutral Detergent Fiber (NDF). Komponen untuk sampel biji kedelai adalah termasuk analisis proksimat (protein, lemak, abu, kadar air, dan karbohidrat yang ditetapkan secara perhitungan), ADF, NDF, asam amino, asam lemak (C8-C22), asam fitat, inhibitor tripsin, isoflavon, lektin, rafinosa, stakiosa, dan vitamin E.
Hasil analisis dari semua komponen dalam kedelai PRG event MON 89788 ditemukan bahwa secara umum tidak ada kecenderungan yang berbeda dengan kedelai non PRG A3244 termasuk kedelai non PRG lainnya. Keragaman yang ada masih masuk ke dalam 99% interval toleransi yang dilaporkan sumber pustaka. Dari hasil pengkajian kesepadanan substansial di atas dapat disimpulkan bahwa kedelai PRG event MON 89788 sepadan secara substansial dengan kedelai non PRG.
III.2 Alergenisitas
Protein CP4 EPSPS diperoleh dari bakteri tanah alami yaitu spesies Agrobacterium. Tidak ada laporan adanya sifat alergi untuk spesies Agrobacterium sehingga dapat disimpulkan bahwa protein CP4 EPSPS bukan berasal dari sumber yang dikenal menyebabkan alergi dan tidak ada individu dari suatu populasi yang peka terhadap protein bakteri ini (FAO/WHO, 2001).
Aktivitas spesifik protein CP4 EPSPS yang diproduksi oleh kedelai PRG event MON 89788 diukur berdasarkan phosphate release. Protein CP4 EPSPS yang diproduksi oleh E. coli dan yang diproduksi oleh kedelai PRG event MON 89788 secara fungsional dianggap setara jika aktivitas spesifik protein yang satu tidak lebih dari dua kali lipat yang lain. Hasil pengukuran menunjukkan bahwa aktivitas spesifik yang diperoleh adalah 3,7 U/mg protein untuk CP4 EPSPS dari kedelai PRG event MON 89788 dan 4,4 U/mg protein untuk baku pembanding yang diproduksi E. coli. Uji aktivitas enzim menunjukkan bahwa protein CP4 EPSPS yang diproduksi kedelai PRG event MON 89788 sama aktifnya dengan protein baku pembanding yang diproduksi E. coli. Hasil ini mengkonfirmasi bahwa kedua protein secara fungsional setara.
Analisis glikosilasi dilakukan untuk menunjukkan kesetaraan antara protein CP4 EPSPS yang diproduksi oleh E. coli dibandingkan dengan yang diproduksi oleh kedelai PRG event MON 89788. Hasil dari analisis ini menunjukkan tidak ada gugus karbohidrat yang terdeteksi (tidak terglikosilasi) pada protein CP4 EPSPS yang diisolasi baik dari E. coli maupun dari kedelai PRG event MON 89788.
Protein CP4 EPSPS yang terdapat dalam kedelai PRG event MON 89788 mirip dengan protein EPSPS yang terdapat dalam berbagai makanan dan sumber pakan. Kesamaan protein CP4 EPSPS dengan protein EPSPS dalam berbagai makanan yang dikonsumsi manusia ini mengimplikasikan tidak adanya ancaman kesehatan dalam mengkonsumsi protein tersebut. Selain itu, enzim EPSPS yang bersifat homolog dengan enzim di dalam tanaman pangan dan mikroorganisme menunjukkan bahwa protein EPSPS dan aktivitas enzimnya tidak menimbulkan bahaya bagi kesehatan manusia dan hewan.
Tidak adanya persamaan struktural yang relevan secara biologis antara protein CP4 EPSPS dengan alergen, racun, dan protein yang aktif secara farmakologi, menunjukkan bahwa protein CP4 EPSPS tidak menimbulkan masalah kesehatan bagi manusia. Kesimpulan ini juga didukung oleh degradasi cepat protein CP4 EPSPS pada percobaan simulasi pencernaan protein oleh cairan lambung.
Potensi kemiripan struktural protein CP4 EPSPS dan protein dalam database toksin juga dievaluasi dengan menggunakan perangkat alignment sekuen FASTA. Hasilnya menunjukkan tidak adanya kesamaan secara struktural antara protein CP4 EPSPS dengan protein beracun yang diketahui atau protein yang aktif secara farmakologi. Pencarian sekuen 8 asam amino berurutan (8-mer) dilakukan menggunakan algoritma (Allergen Search) yang dikembangkan untuk mengidentifikasi apakah ada persamaan sekuen 8 asam amino antara protein CP4 EPSPS dengan sekuen asam amino dalam database alergi (AD5). Hasil menunjukkan tidak ditemukan adanya persamaan.
Harrison et al. (1996) menunjukkan bahwa protein CP4 EPSPS cepat tercerna dalam simulasi cairan pencernaan. Berdasarkan analisis Western blot, half life dari protein CP4 EPSPS dalam sistem lambung ditemukan kurang dari 15 detik dan
dalam sistem usus kurang dari 10 menit. Jika ada protein CP4 EPSPS yang masih bertahan di sistem lambung, akan segera dicerna dalam usus. Sebagai perbandingan, 50% dari makanan padat dapat dicerna dalam perut manusia dalam waktu dua jam, sementara 50% dari cairan itu dicerna dalam waktu 25 menit (Sleisenger dan Fordtran, 1989).
Uji daya cerna protein in vitro telah dilakukan terhadap protein CP4 EPSPS yang berasal dari E. coli. Uji ini dilakukan untuk mengkonfirmasi secara in vitro kecepatan kecernaan protein CP4 EPSPS dalam Simulated Mammalian Gastric Fluid (SGF) dengan menggunakan metode standar yang diterbitkan oleh International Life Science Institute (ILSI; Thomas et al., 2004). Seperti pada studi sebelumnya oleh Harrison et al. (1996), protein CP4 EPSPS dari E. coli yang digunakan dalam penelitian ini dianalisis berdasarkan Western blot dan aktivitas enzimatiknya. Hasil percobaan ini mengkonfirmasi bahwa protein CP4 EPSPS dari E. coli dicerna secara cepat setelah inkubasi dalam Simulated Mammalian Gastric Fluid (SGF). Pewarnaan setelah SDS-PAGE menunjukkan bahwa lebih dari 98% protein CP4 EPSPS dicerna dalam waktu 15 detik. Analisis Western blot mengkonfirmasi bahwa lebih dari 95% dari protein CP4 EPSPS dari E. coli dicerna dalam SGF dalam waktu 15 detik. Demikian pula aktifitas EPSPS berkurang menjadi <10% dalam waktu 15 detik inkubasi protein CP4 EPSPS dalam SGF. Hasil percobaan menyimpulkan bahwa protein CP4 EPSPS dari E. coli dengan cepat tercerna dalam simulasi cairan lambung dan tidak akan menimbulkan masalah kesehatan manusia.
Pengujian untuk menentukan tingkat pengikatan antibodi IgE terhadap ekstrak protein dari kedelai PRG event MON 89788 dan kedelai non PRG A3244 dimulai dengan penyiapan ekstrak cair dari biji kedelai PRG event MON 89788, kedelai non PRG A3244, dan varietas komersial, kemudian analisis dilanjutkan dengan metoda ELISA. IgE spesifik kedelai terdeteksi menggunakan goat anti-human biotin conjugated IgE. Interval toleransi dari masing-masing serum ditentukan oleh nilai-nilai IgE dari 24 ekstrak kedelai komersial. Nilai IgE-binding kedelai PRG event MON 89788 dan kedelai non PRG A3244 ditentukan dan dibandingkan dengan interval toleransi yang telah dihitung. Hasilnya menunjukkan bahwa semua nilai IgE binding kedelai PRG event MON 89788 dan kedelai non PRG A3244 ada pada interval toleransi untuk masing-masing serum dengan pengecualian satu serum, dimana IgE mengikat kedelai non PRG A3244 ditemukan di bawah batas deteksi. Tak satu pun dari varietas kedelai menunjukkan IgE binding terhadap serum dari pasien non alergi.
Kedelai PRG event MON 89788 memiliki nilai IgE serupa dengan kedelai non PRG A3244 pada 15 dari 16 serum yang diperiksa, dan dalam semua kasus, nilai IgE kedelai PRG event MON 89788 berada dalam rentang nilai IgE varietas kedelai komersial. Hasil ini menunjukkan bahwa kedelai PRG event MON 89788 tidak memiliki potensi alergi lebih besar daripada varietas kedelai yang saat ini berada di pasar.
Dari hasil pengkajian alergenisitas dapat disimpulkan bahwa protein CP4 EPSPS tidak menunjukkan adanya potensi dapat menimbulkan alergi.
III.3 Toksisitas
Pengujian toksisitas dilakukan melalui studi toksisitas pada mencit terhadap protein CP4 EPSPS kedelai PRG event MON 89788. Uji toksisitas ini dilakukan pada CD-1
Protein in Glyphosate-Tolerant Soybean, 5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase from Agrobacterium sp. strain CP4, is Rapidly Digested In Vitro and Not Toxic to Acutely Gavaged Mice”, (Harrison L.A., Bailey M.R., Naylor M.W., Ream J.E., Hammond B.G., Nida D.L., Burnette B.L., Nickson T.E., Mitsky T.A., Taylor M.L., Fuchs R.L. dan Padgette S.R.) dalam Journal of Nutrition Volume 126, halaman 728-740, tahun 1996.
Protein yang diuji adalah protein CP4 EPSPS yang diproduksi oleh E. coli strain GB100, dengan kemurnian >90%, kemudian disimpan pada suhu -80°C sampai saatnya dianalisis.
Hewan coba yang digunakan adalah CD-1 Albino mice (50 jantan, 50 betina), berumur 5,5 minggu (jantan) dan 7 minggu (betina), dengan berat badan 25,2 - 29,8 g (jantan) dan 22,7 - 27,2 g (betina), yang diperoleh dari Charles River Breeding Laboratory, Portage, MI. Ransum basal yang digunakan adalah Purina Certified Rodent Chow no. 5002.
Pengujian diawali dengan pemberian makan dan minum ad libitum pada mencit. Protein yang diuji dilarutkan dalam larutan dapar (Na-bikarbonat, sistein dan sukrosa). Larutan protein diberikan pada mencit secara gavage dengan dosis target 40 mg/kg BB, 100 mg/kg BB dan 400 mg/kg BB (masing-masing dosis target tersebut setara dengan dosis aktual 49 mg/kg BB, 154 mg/kg BB dan 572 mg/kg BB). Hewan kontrol diberi Bovine Serum Albumin (BSA), dengan dosis protein yang disesuaikan dengan perlakuan. Mencit dimatikan pada hari ke-8 atau ke-9 setelah diberi larutan protein, kemudian organ dalam diperiksa.
Pengujian menunjukkan hasil bahwa tidak terdapat perbedaan berat badan mencit, berat badan kumulatif dan konsumsi ransum antara grup perlakuan dan grup kontrol. Tidak terdapat kelainan pada organ mencit yang disebabkan oleh perlakuan pemberian protein CP4 EPSPS.
Tidak terdapat pengaruh merugikan akibat pemberian protein CP4 EPSPS pada mencit secara gavage pada dosis tinggi 572 mg/kg BB. Dosis tersebut melebihi 1000 kali perkiraan tingkat konsumsi kedelai yang mengandung protein CP4 EPSPS. Dari hasil pengkajian toksisitas dapat disimpulkan bahwa protein CP4 EPSPS termasuk dalam golongan zat yang dianggap tidak toksik.
IV. Kesimpulan dan Saran
Atas dasar beberapa uraian tentang informasi genetik dari gen CP4 EPSPS yang berasal dari Agrobacterium tumefaciens yang disisipkan dalam kedelai PRG event MON 89788; analisis kesepadanan substansial antara komposisi kedelai PRG event MON 89788 dengan kedelai non PRG; serta alergenisitas dan toksisitas dari protein CP4 EPSPS, disimpulkan bahwa kedelai PRG event MON 89788 dapat dinyatakan aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pangan.
Disarankan selama kedelai PRG event MON 89788 belum memperoleh sertifikat keamanan lingkungan, jika ditemukan adanya biji kedelai yang tumbuh (tanaman volunteer) harus segera dimusnahkan. Meskipun demikian, karena hal ini terkait dengan aspek keamanan lingkungan, saran ini dapat diabaikan apabila kedelai PRG event MON 89788 telah memperoleh sertifikat keamanan lingkungan.
