Ringkasan Pengkajian Keamanan Pangan Kedelai PRG Event GTS 40-3-2
I. Pendahuluan
Kedelai PRG event GTS 40-3-2 merupakan produk kedelai pertama yang mengandung protein CP4 EPSPS yang bertanggung jawab dalam toleransi terhadap herbisida glifosat. Gen EPSPS (5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase) berasal dari Agrobacterium tumefaciens strain CP4.
Berdasarkan Peraturan Kepala Badan POM Nomor HK.00.05.23.3541 Tahun 2008 tentang Pedoman Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik, TTKHKP telah melakukan pengkajian keamanan pangan kedelai PRG event GTS 40-3-2 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pangan yang terdiri atas kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas sebagaimana diuraikan di bawah ini.
II. Informasi Genetik
II.1 Elemen Genetik
Kedelai PRG event GTS 40-3-2 mengandung satu gen interes yaitu CP4 EPSPS. EPSPS adalah 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase yang bertanggung jawab dalam toleransi terhadap herbisida glifosat.
Promoter yang digunakan adalah CaMV-35S (35S dari cauliflower mosaic virus), dengan terminator NOS (nopaline synthase) dari Agrobacterium tumefaciens.
II.2 Sumber Gen Interes
Gen EPSPS berasal dari Agrobacterium tumefaciens strain CP4. Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri tanah yang bukan merupakan sumber alergen atau zat yang bersifat toksik terhadap manusia. Gen EPSPS, di dalam kedelai PRG event GTS 40-3-2 mengekspresikan toleransi terhadap herbisida yang mengandung glifosat.
II.3 Sistem Transformasi
Kedelai PRG event GTS 40-3-2 dirakit melalui teknik transformasi dengan penembakan partikel (particle-acceleration/biolistic) menggunakan plasmid PV-GMGT04 pada sel tanaman kedelai galur A5403.
II.4 Stabilitas Genetik
Analisis stabilitas genetik integrasi gen interes dari kedelai PRG event GTS 40-3-2 dengan Southern blot menunjukkan bahwa gen CP4 EPSPS stabil sampai enam generasi. Stabilitas genetik pewarisan sifat toleransi terhadap herbisida glifosat kedelai PRG event GTS 40-3-2 mengikuti prinsip hukum Mendel. Data dari analisis Southern blot menunjukkan bahwa kedelai PRG event GTS 40-3-2 mengandung satu kopi insert gen CP4 EPSPS.
II.5 Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengkajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa :
1. Kedelai PRG event GTS 40-3-2 mengandung satu kopi insert gen CP4 EPSPS; 2. Gen interes CP4 EPSPS yang diintroduksikan ke kedelai PRG event GTS 40-3-2
masih stabil pada enam generasi; dan
3. Gen interes CP4 EPSPS yang diintroduksikan ke kedelai PRG event GTS 40-3-2 diwariskan mengikuti hukum Mendel.
III. Informasi Keamanan Pangan
III.1 Kesepadanan Substansial
Hasil pengkajian kesepadanan substansial kedelai PRG event GTS 40-3-2 secara lengkap telah dipublikasikan dengan judul “The Composition of Glyphosate-Tolerant Soybean Seeds is Equivalent to That of Conventional Soybeans” (S.R. Padgette, N.B. Taylor, D.L. Nida, M.R. Bailey, J. MacDonald, L.R. Holden dan R.L. Fuchs) dalam Journal of Nutrition Volume 126, halaman 702-716, tahun 1996. Jurnal internasional ini diterbitkan oleh American Institute of Nutrition melalui penilaian oleh peer review team. Pada tahun 2005 telah dipublikasikan juga artikel berjudul: “Glyphosate-Tolerant Soybeans Remain Compositionally Equivalent to Conventional Soybeans (Glycine max L.) during Three Years of Field Testing” (McCann M.C., Liu K., Trujillo W.A., dan Dobert R.C.) dalam Journal of Agricultural and Food Chemistry Volume 53, halaman 5331-5335, tahun 2005. Jurnal internasional ini diterbitkan oleh American Chemical Society melalui penilaian oleh peer review team. Percobaan yang dilaporkan dalam artikel ini pada dasarnya dirancang untuk menentukan apakah kedelai PRG event GTS 40-3-2 masih sepadan secara substansial dengan kedelai non PRG selama beberapa tahun sejak pertama kalinya dilepas. Sampel biji kedelai yang digunakan dalam percobaan ini dipanen selama tahun 2000, 2001, dan 2002.
Dalam pengkajian kesepadanan substansial ini, kedelai PRG event GTS 40-3-2 dibandingkan dengan kedelai non PRG komersial varietas A5403. Bersamaan dengan ini dibandingkan pula hasilnya dengan kedelai PRG event GTS 61-67-1 non komersial. Penanaman kedelai untuk percobaan ini dilakukan di 9 lokasi di USA pada tahun 1992, yaitu di Macon, MO; Washington, LA; Martinsville, IN; Greenville, MS; Newport, AR; Proctor, AR; Winterville, GA; Seven Springs, NC dan Marion, AR. Penanaman pada tahun 1993 dilakukan di Gordon, AL; Salisbury, MD; Steele, MO dan Marion, AR. Selain terhadap biji kedelai segar, percobaan juga dilakukan terhadap biji kedelai yang sudah diproses, khususnya toasting, baik dalam skala kecil maupun besar.
Analisis laboratorium yang dilakukan adalah analisis asam-asam amino yang tahan asam, asam-asam amino bersulfur, triptofan, karbohidrat, lemak, profil asam lemak, serat kasar, isoflavon bebas dan terikat, lesitin, kadar air, protein, asam fitat, gula, inhibitor tripsin dan urease.
Hasil dari semua analisis yang dilaporkan menunjukkan bahwa komposisi kedelai PRG event GTS 40-3-2 serta bagian yang diproses (bungkil yang dipanggang, bungkil tanpa
lemak, isolat protein, konsentrat protein, Refined Bleached Deodorized Oil (RBDO) dan lesitin) sepadan dengan biji kedelai non PRG dan fraksi-fraksinya. Dalam publikasi berjudul “Glyphosate-Tolerant Soybeans Remain Compositionally Equivalent to Conventional Soybeans (Glycine max L.) during Three Years of Field Testing” (McCann M.C., Liu K., Trujillo W.A., dan Dobert R.C.) dalam Journal of Agricultural and Food Chemistry Volume 53, halaman 5331-5335, tahun 2005, dilaporkan bahwa komposisi dari kedelai PRG event GTS 40-3-2 selama tiga tahun pemuliaan, tetap sepadan dengan komposisi kedelai non PRG.
Isoflavon dan zat anti gizi (inhibitor tripsin dan lektin) kedelai diuji baik tanpa pengolahan maupun setelah pemanasan. Zat anti gizi lainnya, yaitu fitat, stakiosa dan rafinosa hanya diuji pada kedelai setelah pemanasan, dan urease diuji pada kedelai tanpa pengolahan. Dari hasil pengujian dapat disimpulkan bahwa zat anti gizi pada kedelai PRG event GTS 40-3-2 tidak berbeda dengan kedelai non PRG.
Dari hasil pengkajian kesepadanan substansial di atas dapat disimpulkan bahwa kedelai PRG event GTS 40-3-2 sepadan secara substansial dengan kedelai non PRG. III.2 Alergenisitas
Protein EPSPS diproduksi oleh gen EPSPS yang berasal dari Agrobacterium tumefaciens strain CP4. Protein ini bertanggung jawab untuk toleransi terhadap herbisida glifosat. Umumnya bakteri ini hidup di tanah dan rhizosphere tanaman, tidak menimbulkan alergi dan tidak ada populasi penduduk yang peka terhadap protein dari bakteri tersebut (FAO/WHO, 1991).
Metode pemurnian protein yang digunakan adalah kromatografi kolom disertai dengan analisis Western blot (Padgette et al., yang dipublikasikan dalam Arch. Biochem. Biophys Volume 258, halaman 564-573, tahun 1987; Padgette et al., yang dipublikasikan dalam Journal Crop. Sci. Volume 35, halaman 1451-1461, tahun 1995). Studi bioinformatik dilakukan untuk membandingkan sekuen asam amino protein hasil ekspresi dengan sekuen asam amino berbagai protein yang sudah diketahui bersifat alergen yang sudah ada di berbagai database. Hasil studi menunjukkan tidak ada kemiripan sekuen asam amino dan tidak ditemukan pula active site homology.
Tidak ada homologi antara sekuen asam amino protein CP4 EPSPS dengan protein-protein yang diketahui bersifat toksin yang terdapat pada database PIR, Swiss-Prot, EMBL dan GenBank. Hal ini didukung dengan beberapa hasil pengujian lainnya, yaitu analisis protein CP4 EPSPS di dalam sistem pencernaan dan uji toksisitas.
Kedelai sebagai sumber protein CP4 EPSPS tidak dikenal sebagai bahan pangan yang mengandung alergen. Kemungkinan adanya protein yang bersifat alergen dari kedelai PRG event GTS 40-3-2 secara kualitatif maupun kuantitatif dianalisis dengan immunoblot assay. Hasilnya menunjukkan bahwa antibodi IgE sebagai respons spesifik alergenisitas dari tubuh individu yang normal maupun sensitif terhadap alergi tidak mengalami perubahan selama mengkonsumsi kedelai PRG event GTS 40-3-2.
Analisis glikosilasi protein menunjukkan bahwa protein CP4 EPSPS tidak mengalami glikosilasi (Harrison et al., 1993). Pada tumbuhan, reaksi glikosilasi terjadi di dalam retikulum endoplasma dan badan golgi (Taiz dan Zieger, 1991), dan protein CP4 EPSPS tidak terdapat didalamnya. Selain itu CP4 EPSPS dibawa ke kloroplas yaitu
tempat sintesis asam amino dan diketahui bahwa di dalam kloroplas tidak dilakukan proses glikosilasi. Berdasarkan hal tersebut, protein CP4 EPSPS tidak mengalami glikosilasi.
Sifat biokimia protein CP4 EPSPS menunjukkan bahwa protein ini tidak bersifat alergen. Protein CP4 EPSPS memiliki berat molekul 47,6 kD dan bersifat labil terhadap protease yang ada pada saluran pencernaan mamalia sehingga kemungkinan untuk diabsorpsi oleh mukosa usus sangat kecil.
Uji daya cerna protein in vitro telah dilakukan terhadap protein CP4 EPSPS pada Simulated Mammalian Gastric Fluid (SGF). Hasil menunjukkan protein CP4 EPSPS terdegradasi dalam waktu 15 detik setelah inkubasi seperti dibuktikan dengan analisis Western blot. Berdasarkan hasil ini diperkirakan protein CP4 EPSPS akan terdegradasi dalam saluran pencernaan manusia dalam waktu yang sangat cepat. Sebagai perbandingan, 50% dari bahan padat dikosongkan dari lambung dalam waktu 2 jam, sedangkan bahan cair dikosongkan dari lambung dalam waktu 25 menit (Sleisenger dan Fordtran, 1989). Dapat disimpulkan bahwa protein CP4 EPSPS dapat dicerna dengan cepat.
Konsentrasi protein CP4 EPSPS juga ditemukan hanya sebesar 0,03% dari berat segar biji kedelai PRG event GTS 40-3-2 dan diperkirakan sebesar 0,08% dari jumlah total protein (Padgette et al., 1993). Protein CP4 EPSPS menjadi inaktif setelah melalui proses pemanasan. Hampir seluruh kedelai yang dikonsumsi sebagai makanan oleh manusia telah melalui proses pemanasan. Protein CP4 EPSPS yang diinkubasi pada suhu 55°C selama 15 menit lebih sedikit jumlahnya dibandingkan dengan yang diinkubasi pada suhu 25°C. Inaktivasi enzim secara sempurna dicapai pada suhu 65°C setelah diinkubasi selama 15 menit. Sebagai perbandingan, kedelai untuk pakan hewan biasanya melalui proses pemanasan pada suhu 66-107°C selama 38 menit. Hasil analisis dengan ELISA menunjukkan bahwa enzim CP4 EPSPS terurai (hilang) setelah proses pemanasan (Padgette et al., 1993).
Dari hasil pengkajian alergenisitas dapat disimpulkan bahwa protein CP4 EPSPS tidak menunjukkan adanya potensi dapat menimbulkan alergi.
III.3 Toksisitas
Pengujian toksisitas dilakukan melalui uji toksisitas terhadap protein CP4 EPSPS kedelai PRG event GTS 40-3-2. Uji toksisitas telah dilakukan pada CD-1 Albino mice dan hasilnya dilaporkan dalam publikasi berjudul “The Expressed Protein in Glyphosate-Tolerant Soybean, 5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate Synthase from Agrobacterium sp. strain CP4, is Rapidly Digested In Vitro and Not Toxic to Acutely Gavaged Mice”, (Harrison L.A., Bailey M.R., Naylor M.W., Ream J.E., Hammond B.G., Nida D.L., Burnette B.L., Nickson T.E., Mitsky T.A., Taylor M.L., Fuchs R.L. dan Padgette S.R.) dalam Journal of Nutrition Volume 126, halaman 728-740, tahun 1996. Protein yang diuji adalah protein CP4 EPSPS yang diproduksi oleh E. coli strain GB100, dengan kemurnian >90%, kemudian disimpan pada suhu -80°C sampai saatnya dianalisis. Hewan coba yang digunakan adalah CD-1 Albino mice (50 jantan, 50 betina), berumur 5,5 minggu (jantan) dan 7 minggu (betina) dengan berat badan 25,2 - 29,8 g (jantan) dan 22,7 - 27,2 g (betina) yang diperoleh dari Charles River Breeding
Laboratory, Portage, MI. Ransum basal yang digunakan adalah Purina Certified Rodent Chow no. 5002.
Pengujian diawali dengan pemberian makan dan minum ad libitum pada mencit. Protein yang diuji dilarutkan dalam larutan dapar (Na-bikarbonat, sistein dan sukrosa). Larutan protein diberikan pada mencit secara gavage dengan dosis target 40 mg/kg BB, 100 mg/kg BB dan 400 mg/kg BB (masing-masing dosis target tersebut setara dengan dosis aktual 49 mg/kg BB, 154 mg/kg BB dan 572 mg/kg BB). Hewan kontrol diberi bovine serum albumin (BSA) dengan dosis protein yang disesuaikan dengan perlakuan. Mencit dimatikan pada hari ke-8 atau ke-9 setelah diberi larutan protein, kemudian organ dalam diperiksa. Pengujian menunjukkan hasil bahwa tidak terdapat perbedaan berat badan mencit, berat badan kumulatif dan konsumsi ransum antara grup perlakuan dan grup kontrol. Tidak terdapat kelainan pada organ mencit yang disebabkan oleh perlakuan pemberian protein CP4 EPSPS.
Tidak terdapat pengaruh merugikan akibat pemberian protein CP4 EPSPS pada mencit secara gavage pada dosis tinggi 572 mg/kg BB. Dosis tersebut melebihi 1000 kali perkiraan tingkat konsumsi kedelai yang mengandung protein CP4 EPSPS.
Dari hasil pengkajian toksisitas dapat disimpulkan bahwa protein CP4 EPSPS termasuk dalam golongan zat yang dianggap tidak toksik.
IV. Kesimpulan
Atas dasar beberapa uraian tentang informasi genetik dari gen CP4 EPSPS yang berasal dari Agrobacterium tumefaciens yang disisipkan dalam kedelai PRG event GTS 3-2; analisis kesepadanan substansial antara komposisi kedelai PRG event GTS 40-3-2 dengan kedelai non PRG; serta alergenisitas dan toksisitas dari protein CP4 EPSPS, disimpulkan bahwa kedelai PRG event GTS 40-3-2 dapat dinyatakan aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pangan.
