Laporan Pengkajian Keamanan Pangan Kedelai PRG event GMB151
I. Pendahuluan
Kedelai PRG event GMB151 merupakan tanaman hasil produk rekayasa genetik dari perusahaan PT. BASF Indonesia yang mengandung dua gen sisipan yaitu cry14Ab-1.b dan hppdPf-4Pa yang membawa sifat ketahanan terhadap nematoda kista kedelai dan toleran terhadap herbisida isoksaflutol.
Kedelai PRG event GMB151 telah memperoleh sertifikat aman pangan di Negara Australia (2020) dan sedang diajukan untuk mendapatkan sertifikat keamanan pangan di 9 (sembilan) negara yaitu Amerika Serikat (2019), Brasil (2019), Kanada (2019), Eropa (2019), Swiss (2019), Uruguay (2019), Jepang (2019), Korea (2019), dan Taiwan (2019). Kedelai PRG event GMB151 juga sedang diajukan untuk mendapatkan sertifikat keamanan pakan di 9 (sembilan) negara yaitu Amerika Serikat (2019), Brasil (2019), Kanada (2019), Eropa (2019), Swiss (2019), Uruguay (2019), Jepang (2019), Korea (2019), dan Taiwan (2019). Kedelai PRG event GMB151 juga sedang diajukan untuk mendapatkan sertifikat keamanan lingkungan di 3 (tiga) negara yaitu Brasil (2019), Kanada (2019), dan Uruguay (2019).
Pengkajian keamanan pangan kedelai PRG event GMB151 dilakukan berdasarkan Peraturan Badan POM 6 Tahun 2018 tentang Pengawasan Pangan Produk Rekayasa Genetik dan surat penugasan Ketua Komisi Keamanan Hayati kepada Wakil Ketua Bidang Keamanan Pangan KKH PRG Nomor B-126/KKH PRG/12/2020 Tanggal 30 Desember 2020 Perihal Penugasan Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik (PRG) Komoditas Kedelai Event GMB151.
TTKH telah melakukan pengkajian keamanan pangan kedelai PRG event GMB151 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pangan yang terdiri atas kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas sebagaimana diuraikan di bawah ini.
II. Informasi Genetik
II.1. Elemen Genetik
Kedelai PRG
event
GMB151 mengandung dua gen sisipan yaitu cry14Ab-1.b yang mengekspresikan protein Cry14Ab-1 untuk sifat ketahanan terhadap nematoda kista kedelai dan hppdPf-4Pa yang menyandi protein HPPD-4 yang memberikan toleransi terhadap herbisida isoksaflutol. Gen cry14Ab-1.b dikendalikan oleh promoter Pubi10At dan terminator T35S. Sementara itu, gen hppdPf-4Pa dikendalikan oleh promoter P2x35S dan terminator T35S. Elemen genetik dari kaset gen sisipan pada kedelai PRGevent
GMB151 secara lengkap adalah sebagai berikut (Peeters, 2018):• Gen cry14Ab-1.b, penyandi protein Cry14Ab-1;
• gen hppdPf-4Pa, penyandi protein HPPD-4;
• Pubi10At, sekuen promoter gen ubiquitin-10 Arabidopsis thaliana;
• P2x35S, sekuen promoter ganda yang disempurnakan dari 35S CaMV;
• T35S, sekuen terminator dari transkrip 35S CaMV; dan
• TPotpY-1Pf, penyandi protein peptida transit dari gen subunit kecil RuBisCo.
II.2. Sumber Elemen Genetik
Sumber elemen genetik dari kaset gen sisipan pada kedelai PRG event GMB151 secara lengkap adalah sebagai berikut:
• Gen cry14Ab-1.b diisolasi dari bakteri Bacillus thuringiensis (Sampson et al., 2012);
• gen hppdPf-4Pa diisolasi dari Pseudomonas fluorescens (Poree et al., 2014);
• Pubi10At berasal dari gen ubiquitin-10 Arabidopsis thaliana (Grefen et al., 2010);
• P2x35S berasal dari transkrip 35S Cauliflower Mosaic Virus (Kay et al., 1987);
• T35S berasal dari transkrip 35S Cauliflower Mosaic Virus (Sanfacon et al., 1991); dan
• TPotpY-1Pf, berasal dari gen subunit kecil RuBisCo dari Jagung (Zea mays) dan bunga matahari (Helianthus annuus) (Lebrun et al., 1996).
II.3. Sistem Transformasi
Kedelai PRG event GMB151 dirakit melalui metode transformasi dengan perantara Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 yang membawa vektor pSZ8832 yang mengandung kaset gen cry14Ab-1.b dan hppdPf-4Pa. Eksplan dari varietas kedelai Thorne diko-kultivasi dengan kultur A. tumefaciens dan diinkubasi pada media ko- kultivasi untuk transfer gen. Setelah itu, eksplan diseleksi pada media seleksi yang mengandung agen seleksi tembotrione (TBT) untuk memilih eksplan transforman.
Tunas transforman yang terbentuk dipindahkan ke media perakaran dan selanjutnya dipindahkan ke rumah kaca (Cornelissen and Vanderwiele, 1989; Dufourmantel et al., 2007, Peeters, 2018).
II.4 Stabilitas Genetik
Karakterisasi jumlah kopi dari gen sisipan dilakukan dengan metode Next Generation Sequencing (NGS) dan Junction Sequence Analysis (JSA) pada genom DNA biji kedelai PRG event GMB151 (Schilling and Windhager, 2018). Kedelai non PRG varietas Thorne digunakan sebagai kontrol negatif. Hasil menunjukkan bahwa kedelai PRG event GMB151 mengandung lokus tunggal yang terdiri dari satu salinan T-DNA yang mengandung gen cry14Ab-1.b dan hppdPf-4Pa.
Pembuktian tidak adanya sekuen vektor backbone pada kedelai PRG event GMB151 dilakukan juga menggunakan teknik NGS/JSA. Untuk mengidentifikasi 2 daerah junction yang spesifik dari kedelai PRG event GMB151 dilakukan JSA. Hasil menunjukkan bahwa tidak ada sekuen dari daerah vektor backbone yang ditemukan pada kedelai PRG event GMB151. Berdasarkan hasil ini, kedelai PRG event GMB151 tidak mengandung sekuen vektor backbone plasmid transformasi pSZ8832 (Schilling and Windhager, 2018).
Analisis kestabilan sisipan gen dan pola pewarisan gen dilakukan dengan menggunakan NGS dan PCR pada lima generasi kedelai PRG event GMB151 yaitu T2, T4, T5, T6 dan BC2F3. Hasil analisis menunjukkan bahwa kedelai PRG event GMB151 mengandung satu sisipan T-DNA yang terintegrasi pada lokus tunggal pada genom dan diwariskan secara stabil sampai lima generasi serta mengikuti hukum Mendel (Schilling and Windhager, 2018; Cisneros, 2018).
Berdasarkan hasil kajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa:
1. kedelai PRG event GMB151 mengandung satu kopi T-DNA yang berisi gen cry14Ab- 1.b dan hppdPf-4Pa yang terintegrasi pada lokus tunggal;
2. kedelai PRG event GMB151 tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi pSZ8832; dan
3. T-DNA dalam kedelai PRG event GMB151 stabil sampai lima generasi yaitu T2, T4, T5, T6, dan BC2F3, dan diwariskan mengikuti hukum Mendel.
III. Informasi Keamanan Pangan
III.1. Kesepadanan Substansial
Pengkajian kesepadanan substansial dari kedelai PRG event GMB151 dilakukan dengan menggunakan tanaman kedelai PRG event GMB151 dan tanaman kedelai non PRG sebagai kontrol. Kedelai ditanam dalam rancangan randomized block pada tahun 2016 di dua lokasi penanaman di Amerika Serikat, yaitu di Kimballton, Audubon, IA, dan Shane, Andersen, MO. Sebagian tanaman kedelai diberi perlakuan herbisida isoksaflutol.
Setelah dipanen biji kedelai dikirim ke laboratorium EPL Bio Analytical Services, Niantic, Illinois, Amerika Serikat yang sudah menerapkan good laboratory practices (GLP) untuk dianalisis komposisinya. Analisis komposisi mencakup kadar proksimat (air, protein, lemak, abu, dan karbohidrat by-difference), ADF (acid detergent fiber), NDF (neutral detergent fiber), TDF (total dietary fiber), mineral (kalium, natrium, magnesium, mangan, besi, tembaga, seng, dan fosfor), vitamin (tiamin, riboflavin, niasin, asam pantotenat, piridoksin, asam folat, -tokoferol, dan vitamin K1), asam amino (alanin, arginin, asam aspartat, sistin, asam glutamat, glisin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, fenilalanin, metionin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirosin, dan valin), asam lemak (miristat, palmitat, palmitoleat, heptadekanoat, heptadekenoat, stearat, oleat, linoleat, linolenat, arakhidat, eikosenoat, behenat, dan lignoserat), zat antigizi (lektin, asam fitat, rafinosa, stakiosa, dan inhibitor tripsin), dan metabolit sekunder lainnya (daidzein total, genistein total, glisitein total dan isoflavon total).
Hasil analisis komposisi kedelai menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata di antara kedelai PRG event GMB151 dengan kedelai kontrol non PRG, dan masuk ke dalam kisaran komposisi kedelai komersial pada umumnya.
Berdasarkan pengkajian, kedelai PRG event GMB151 sepadan secara substansial dengan kedelai non PRG.
III.2 Alergenisitas
Pengkajian alergenisitas terhadap protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 yang diekspresikan pada kedelai PRG event GMB151 dilakukan melalui analisis bioinformatika, konsentrasi protein, dan pengujian stabilitas protein yang meliputi stabilitas cerna dan stabilitas panas. Pengujian alergenisitas dilakukan di laboratorium yang telah menerapkan GLP.
III.2.1 Analisis Bioinformatika
Evaluasi kemiripan sekuen asam amino protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 dengan protein alergen dilakukan dengan menggunakan basis data protein alergen COMPARE (COMprehensive Protein Allergen Resource, www.comparedatabase.org) versi 2018 dengan perangkat FASTA, serta pencarian kesamaan sekuen asam amino fragmen delapan atau lebih peptide dengan sekuen protein dalam basis data dengan menggunakan SeqMatchAll dari EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite).
Hasil analisis menunjukkan bahwa tidak terdapat kemiripan sekuen asam amino yang relevan secara biologis (35% atau lebih kesamaan asam amino di dalam peptida yang mengandung 80 asam amino) antara protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 dengan protein alergen. Selain itu, tidak terdapat kesamaan sekuen asam amino pada fragmen 8 peptida atau lebih protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 dengan protein alergen dalam basis data (Ranjan, 2018a; 2018b).
III.2.2 Analisis Konsentrasi Protein
Konsentrasi protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 pada biji kedelai PRG event GMB151 ditentukan menggunakan metode enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
Konsentrasi protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 di dalam biji kedelai PRG event GMB151 masing-masing ditemukan sebesar 95,91 μg/g berat kering dan 4,46 μg/g berat kering.
Kandungan protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 dalam biji kedelai sangat kecil, masing- masing sebesar 0,024% dan 0,0011% dari protein total dalam biji kedelai PRG event GMB151 (Sathischandra, 2018; Gottula et al., 2018).
III.2.3 Analisis Stabilitas Protein
Protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 dihasilkan dalam jumlah yang sedikit oleh tanaman kedelai PRG event GMB151, sehingga untuk keperluan pengujian stabilitas protein digunakan protein Cry14Ab-1 yang diproduksi pada bakteri Bacillus thuringiensis serta protein HPPD-4 yang diproduksi pada bakteri Escherichia coli. Kesetaraan protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 yang diekspresikan pada tanaman kedelai PRG event GMB151 dengan protein yang dihasilkan pada kedua bakteri tersebut diuji dengan menggunakan metode SDS-PAGE, Western blot, analisis sekuen N-terminal, glikosilasi, pemetaan peptida dengan UPLC-UV-Mass Spectrometry, aktivitas nematicidal terhadap Caenorhabditis elegans untuk protein Cry14Ab-1, serta analisis aktivitas enzimatik untuk protein mEPSPS. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 yang diproduksi pada kedua bakteri ekivalen dengan protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 yang diproduksi oleh tanaman kedelai PRG event GMB151 (De Leener, 2017; Schouppe 2014; Vandermarliere, 2018a; 2018b).
III.2.3.1 Analisis Stabilitas Cerna Protein
Analisis stabilitas cerna protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 dilakukan melalui uji kecernaan menggunakan simulasi cairan lambung (Simulated Gastric Fluid – SGF) dan simulasi cairan usus (Simulated Intestinal Fluid – SIF) selama 60 menit pada suhu 37°C. Hasil hidrolisis protein dievaluasi dengan menggunakan metode SDS-PAGE dan Western blot.
Evaluasi dengan SDS-PAGE dan Western blot menunjukkan bahwa setelah inkubasi selama 30 detik dalam SGF dengan menggunakan pepsin pada pH 1,2, tidak terdeteksi adanya pita protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 maupun fragmen-fragmennya (Totis, 2014a; 2014b). Dalam SIF dengan menggunakan pankreatin pada pH 7,5, protein Cry14Ab-1 hanya terhidrolisis sebagian setelah inkubasi selama 60 menit, sedangkan protein HPPD-4 dapat terhidrolisis sempurna setelah inkubasi selama 10 menit (Totis, 2014c; 2014d).
III.2.3.2 Analisis Stabilitas Panas Protein
Analisis pengaruh pemanasan terhadap stabilitas protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 yang masing-masing diproduksi pada bakteri B. thuringiensis dan E. coli dilakukan melalui evaluasi dengan SDS-PAGE dan Western blot untuk protein Cry14Ab-1, serta melalui pengujian aktivitas enzimatik untuk protein HPPD-4.
Hasil evaluasi menunjukkan bahwa setelah pemanasan pada suhu 75°C atau lebih selama 30 menit, pita protein Cry14Ab-1 tidak terdeteksi, yang menunjukkan bahwa protein Cry14Ab-1 kehilangan stabilitasnya dengan pemanasan pada suhu tersebut (Serrano, 2015). Pengujian aktivitas enzimatik menunjukkan bahwa protein HPPD-4 kehilangan seluruh aktivitasnya setelah pemanasan selama 10 menit pada suhu 65°C atau lebih (Moreau, 2018).
Berdasarkan pengkajian alergenisitas yang meliputi analisis bioinformatika, konsentrasi protein, maupun analisis stabilitas cerna dan stabilitas panas protein, dapat disimpulkan bahwa protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 tidak menunjukkan adanya potensi menimbulkan alergi.
III.3 Toksisitas
Pengkajian toksisitas terhadap protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 yang diekspresikan pada kedelai PRG event GMB151 dilakukan melalui analisis bioinformatika dan toksisitas oral akut yang dilakukan di laboratorium yang menerapkan GLP.
III.3.1 Analisis Bioinfomatika
Analisis kemiripan sekuen asam amino protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 dengan protein toksin dilakukan dengan perangkat FASTA dan BLOSUM50 menggunakan basis data protein yang terdapat dalam National Center for Biotechnology Information (NCBI) Entrez® Protein Database dari GenBank CDS translations, UniProtKB/Swiss- Prot, Protein Data Bank (PDB), Protein Information Resource (PIR) dan Protein Research Foundation/Protein Sequence Database (PRF/SEQDB), serta Bayer 2018 Internal Toxin Database. Hasil analisis menunjukkan bahwa tidak terdapat kemiripan sekuen asam amino protein Cry14Ab-1 dan HPPD-4 dengan protein toksin dalam kedua basis data yang digunakan (Ranjan, 2018a; 2108b).
III.3.2 Toksisitas Akut Protein HPPD-4
Pengujian toksisitas akut terhadap protein HPPD-4 telah dilakukan dan telah dilaporkan. Protein HPPD-4 yang dihasilkan oleh tanaman kedelai PRG event GMB151 dalam jumlah sedikit, maka untuk keperluan pengujian toksisitas akut
digunakan protein HPPD-4 yang diproduksi pada bakteri E. coli. Kesetaraan protein HPPD-4 yang diekspresikan di dalam tanaman kedelai PRG event GMB151 dengan yang dihasilkan oleh bakteri E. coli diuji dengan menggunakan metode SDS-PAGE, Western blot, analisis sekuen N-terminal, analisis glikosilasi, analisis pemetaan peptida dengan UPLC-UV-Mass Spectrometry dan analisis aktivitas enzim. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein HPPD-4 yang dihasilkan oleh bakteri E. coli ekivalen dengan protein HPPD-4 yang dihasilkan oleh kedelai PRG event GMB151.
(Blanck 2016; Vandermarliere, 2018b). Studi toksisitas akut dilakukan mengikuti panduan pada US EPA OCSPP Guideline number 870.1100 yang diadopsi tahun 2002 dan OECD Test Guideline 420 yang diadopsi tahun 2001, dengan beberapa pengecualian.
Bahan yang diuji berupa protein HPPD-4 nomor batch 1338_HPPD-4, dengan kemurnian 98%. Bahan uji tersebut disuspensikan dalam larutan penyangga 50mM Tris-HCl, 136 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4 untuk mendapatkan konsentrasi akhir suspensi sebesar 50 mg/ml protein HPPD-4. Pengujian ini dilakukan terhadap mencit jantan (17,9 – 20,5 g) dan betina (14,3 -17,4 g) strain C57BL/6J dan berumur 8 minggu pada saat digunakan. Mencit diperoleh dari Charles River Laboratories, Saint Germain sur l’Arbresle, Perancis.
Semua mencit diaklimatisasi selama 9 hari sebelum digunakan dalam pengujian.
Mencit dibagi secara acak menjadi dua kelompok (kelompok kontrol dan kelompok perlakuan), yang masing-masing terdiri atas 10 ekor mencit jantan dan 10 ekor mencit betina. Mencit dipelihara secara individual di dalam kandang metabolisme terbuat dari baja tahan karat, yang ditempatkan dalam ruangan bersuhu 20-24oC dan kelembaban relatif 40-70 %, dengan pencahayaan selama 12 jam terang 12 jam gelap. Pakan certified rodent pelleted and irradiated diet A04C-10 dari Scientific Animals Food and Engineering (SAFE, Augy, Perancis), diberikan secara ad libitum.
Air minum, yang berasal dari air keran yang telah disaring dan dilunakkan kesadahannya, juga diberikan secara ad libitum.
Pengujian toksisitas akut protein PAT sebagai dosis tunggal dilakukan dengan cara cekokan (oral gavage) yang dilakukan pada hari pertama perlakuan, diikuti dengan periode observasi selama 14 hari. Pemberian bahan uji dilakukan dengan menggunakan sonde lambung. Desain percobaan yang digunakan adalah sebagai berikut: kelompok pertama diberi cekokan larutan penyangga 50mM Tris-HCl, 136 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,4 and 0,07 mM FeCl2 sebagai control; dan kelompok kedua diberi cekokan suspensi protein HPPD-4 dengan dosis 2000 mg/kg BB.
Pemberian suspensi protein HPPD-4 dilakukan dua kali (dosis 1000 mg/kg BB) dengan selang waktu 3 jam. Penambahan FeCl2 karena protein HPPD-4 mengandung 191 μg FeCl2/mg total protein. Volume suspensi protein HPPD-4 maupun larutan penyangga yang diberikan adalah 20 ml/kg BB.
Pengamatan klinis dilakukan secara periodik selama 24 jam dan setiap hari selama pengujian berlangsung. Penimbangan berat badan dilakukan pada satu hari sebelum perlakuan dan kemudian setiap minggu. Penimbangan jumlah pakan yang dikonsumsi dilakukan setiap minggu. Pada akhir pengujian (hari ke-15), semua mencit dianestesi dengan isofluran, kemudian dieutanasi dan nekropsi. Nekropsi dilakukan untuk seluruh mencit yang meliputi pemeriksaan anatomi makroskopis
rongga perut dan toraks, organ dan jaringan tertentu. Pemeriksaan anatomi mikroskopis hanya dilakukan pada organ yang memberikan hasil yang berbeda dengan kelompok kontrol.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) tidak ada mencit yang mati selama pengujian berlangsung, (2) tidak ditemukan kelainan klinis pada mencit akibat pemberian bahan uji, (3) tidak terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol dalam hal berat badan dan jumlah pakan yang dikonsumsi dan (4) pemberian bahan uji tidak berpengaruh pada organ secara anatomi makroskopis.
Berdasarkan pengkajian toksisitas akut dapat disimpulkan bahwa tidak terdapat efek toksik sistemik pada mencit C57BL/6J jantan dan betina akibat pemberian protein HPPD-4 melalui jalur oral sampai dosis 2000 mg/kg BB.
III.3.1
Toksisitas Akut Protein Cry14Ab-1
Pengujian toksisitas akut telah dilakukan terhadap protein Cry14Ab-1 dan telah dilaporkan. Protein Cry14Ab-1 yang dihasilkan oleh tanaman kedelai PRG event GMB151 dalam jumlah sedikit, maka untuk keperluan pengujian toksisitas akut digunakan protein Cry14Ab-1 yang diproduksi pada bakteri Bacillus thuringiensis Kesetaraan protein Cry14Ab-1 yang diekspresikan di dalam tanaman kedelai PRG event GMB151 dengan yang dihasilkan oleh bakteri B. thuringiensis diuji dengan menggunakan metode SDS-PAGE, Western blot, analisis sekuen N-terminal, analisis glikosilasi, analisis pemetaan peptida dengan UPLC-UV-Mass Spectrometry dan analisis aktivitas enzim. Hasil analisis menunjukkan bahwa protein Cry14Ab-1 yang dihasilkan oleh bakteri B. thuringiensis ekivalen dengan protein Cry14Ab-1 yang dihasilkan oleh kedelai PRG event GMB151. (Muhamedi 2016; Vandermarliere, 2018a). Studi toksisitas akut dilakukan mengikuti panduan pada US EPA OCSPP Guideline number 870.1100 yang diadopsi tahun 2002 dan OECD Test Guideline 420 yang diadopsi tahun 2001, dengan beberapa pengecualian.
Bahan yang diuji berupa protein Cry14Ab-1 nomor batch 1506_Cry14Ab-1, dengan kemurnian 91%. Bahan uji tersebut disuspensikan dalam larutan penyangga 50 mM Na2CO3 pH 9,6 untuk mendapatkan konsentrasi akhir suspensi sebesar 58,4 mg/ml protein atau setara 53,14 mg/ml protein Cry14Ab-1. Pengujian ini dilakukan dengan menggunakan mencit jantan (22,9 – 25,5 g) dan betina (18,0 -19,4 g) strain C57BL/6J dan berumur 8 minggu saat digunakan. Mencit diperoleh dari Charles River Laboratories, Saint Germain sur l’Arbresle, Perancis.
Semua mencit diaklimatisasi selama 5 hari sebelum digunakan dalam pengujian.
Mencit dibagi secara acak menjadi dua kelompok (kelompok kontrol dan kelompok perlakuan), yang masing-masing terdiri atas 10 ekor mencit jantan dan 10 ekor mencit betina. Mencit dipelihara secara individual di dalam kandang metabolisme yang terbuat dari baja tahan karat, yang ditempatkan dalam ruangan bersuhu 20- 24oC dan kelembaban relatif 40-70 %, dengan pencahayaan selama 12 jam terang 12 jam gelap. Pakan certified rodent pelleted and irradiated diet A04C-10 dari Scientific Animals Food and Engineering (SAFE, Augy, Perancis), diberikan secara
ad libitum. Air minum, yang berasal dari air keran yang telah disaring dan dilunakkan kesadahannya, juga diberikan secara ad libitum.
Pengujian toksisitas akut protein Cry14Ab-1 sebagai dosis tunggal dilakukan dengan cara cekokan (oral gavage) yang dilakukan pada hari pertama perlakuan, diikuti dengan periode observasi selama 14 hari. Pemberian bahan uji dilakukan dengan menggunakan sonde lambung. Desain percobaan yang digunakan adalah sebagai
berikut: kelompok kontrol diberi cekokan larutan 50 mM Na2CO3, 0,46 mM β-mercaptoethanol ; pH 9,6; dan kelompok perlakuan diberi cekokan suspensi
protein Cry14Ab-1 dengan dosis 2000 mg/kg BB. Penambahan karena dalam bahan uji mengandung sejumlah β-mercaptoethanol. Pemberian suspensi protein Cry14Ab-1 dilakukan dua kali (dosis 1000 mg/kg BB) dengan selang waktu 3 jam.
Volume suspensi protein Cry14Ab-1 maupun larutan penyangga yang diberikan adalah 19 ml/kg BB.
Pengamatan klinis dilakukan secara periodik selama 24 jam dan setiap hari selama pengujian berlangsung. Penimbangan berat badan dilakukan pada satu hari sebelum perlakuan dan kemudian setiap minggu. Penimbangan jumlah pakan yang dikonsumsi dilakukan setiap minggu. Pada akhir pengujian (hari ke-15), semua mencit dianestesi dengan isofluran, kemudian dieutanasi dan nekropsi. Nekropsi dilakukan untuk seluruh mencit yang meliputi pemeriksaan anatomi makroskopis rongga perut dan toraks, organ dan jaringan tertentu. Pemeriksaan anatomi mikroskopis hanya dilakukan pada organ yang memberikan hasil yang berbeda dengan kelompok kontrol.
Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) tidak ada mencit yang mati selama pengujian berlangsung, (2) tidak ditemukan kelainan klinis pada mencit akibat pemberian bahan uji, (3) tidak terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol dalam hal berat badan dan jumlah pakan yang dikonsumsi dan (4) pemberian bahan uji tidak berpengaruh pada organ secara anatomi makroskopis.
Berdasarkan pengkajian toksisitas akut dapat disimpulkan bahwa tidak terdapat efek toksik sistemik pada mencit C57BL/6J jantan dan betina akibat pemberian protein Cry14Ab-1 melalui jalur oral sampai dosis 2000 mg/kg BB.
IV. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengkajian tentang informasi genetik, kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas disimpulkan hal-hal sebagai berikut:
1. kedelai PRG event GMB151 mengandung satu kopi gen yang berisi gen cry14Ab-1.b dan hppdPf-4Pa yang terintegrasi pada lokus tunggal; tidak mengandung sekuen backbone dari plasmid transformasi pSZ8832; T-DNA dalam kedelai PRG event GMB151 stabil sampai lima generasi yaitu T2, T4, T5, T6, dan BC2F3 dan diwariskan mengikuti hukum Mendel;
2. kedelai PRG event GMB151 sepadan secara substansial dengan kedelai non PRG; tidak menunjukkan adanya potensi menimbulkan alergi; dan tidak termasuk ke dalam bahan yang bersifat toksik;
3. TTKH menilai bahwa kedelai PRG event GMB151 yang diajukan adalah aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pangan;
4. apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan pangan yang diperoleh hingga saat ini, maka status keamanan pangan kedelai PRG event GMB151 perlu dikaji ulang;
5. apabila setelah ditetapkan aman pangan, kemudian kedelai PRG event GMB151 terbukti menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan manusia maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan, serta menarik kedelai PRG event GMB151 dari peredaran;
6. kedelai PRG event GMB151 tidak boleh digunakan sebagai pakan sampai memperoleh sertifikat aman pakan; dan
7. kedelai PRG event GMB151 tidak boleh dibudidayakan sampai ditetapkan aman lingkungan.
V. Daftar Pustaka
Blanck. 2016. Final report amendment no 2 - HPPD-4 protein - Acute toxicity study by oral gavage in mice. Bayer CropScience LP
Cisneros. 2018. GMB151 soybean - Inheritance of the insert over generations. Bayer CropScience LP
Cornelissen dan Vandewiele, 1989. Nuclear transcriptional activity of the tobacco plasmid psbA promoter. Nucleic Acids Research.
De Leener, E. 2017. Characterization of the recombinant Cry14Ab-1 protein batch 1514_Cry14Ab-1. Study Report 15-RSKIS001-D. Bayer BioScience N.V. Innovation Center, Technologiepark 38, B-9052 Gent, Belgium. Report Completed on September 12, 2017.
Gottula, J; Gao, Y dan Gillikin, N. 2018. GMB151 Soybean – Comparative Assessment of the Agronomic Performance and Composition of Field Samples Grown in the USA during 2017 with non-GM soybean. Study Report No. 17-RSSB0044. BASF Corporation, 26 Davis Drive P.O. Box 13528 Research Triangle Park, NC 27709 USA. Report Completed on August 31, 2018.
Jeffries, A., N. Gillikin, dan M. Cheever, 2018. GMB151 Soybean: Processing of Grain and Analysis of Resultant Fractions, 2016. Report Number: 16-RSBS001. Bayer CropScience LP 2 T.W. Alexander Drive Research Triangle Park, NC 27709 USA.
Moreau, V. 2018. The influence of temperature on the functional activity of the HPPD-4 protein. Study Report 17-RSSB0084. Bayer BioScience N.V. Innovation Center, Technologiepark 38, B-9052 Gent, Belgium. Report Completed on May 8, 2018.
Muhamedi. 2016. Cry14Ab-1 protein - Acute toxicity study by oral gavage in mice - Report amended no 1 of final report.
Peeters K., 2018a. Description of vector pSZ8832. Bayer CropScience N.V.
Technologiepark 38, 9052 Ghent. Belgium.
Porée, F., V. Heinrichs, G. Lange, B. Laber, C. Peters, and L. Schouten. 2014. HPPD variants and methods of use. Patent application WO2014/043435A1 (20-MAR-2014), BAYER CROPSCIENCE LP (US), BAYER CROPSCIENCE AG (DE).
Ranjan, R. 2018a. Cry14Ab-1 protein: Amino acid sequence homology search with known allergens, known toxins, and known celiac disease associated peptides.
Alignments included. Study Report No. XFAS015. Bayer CropScience LP, 407 Davis Drive, Tech 3, Morrisville, North Carolina 27709 USA. Report Completed on July 19, 2018.
Ranjan, R. 2018b. HPPD-4 protein: Amino acid sequence homology search with known allergens and known toxins. Study Report No. 18-TXKIS002-2. BASF Corporation, 26
Davis Drive P.O. Box 13528 Research Triangle Park, NC 27709 USA. Report Completed on September 11, 2018.
Sathischandra, S. 2018. GMB151 Soybean - Expression of Cry14Ab-1 and HPPD-4 Proteins in Field Samples Grown in the USA during 2016. Study Report No. 16- RSVLS015-A. Bayer CropScience LP Seed & Trait Safety, 407 Davis Drive, Morrisville, NC 27560, USA. Report Completed on February 1, 2018.
Schilling, E. dan Windhager, L . 2018 .GEN170607_H Molecular characterization of GMB151 soybean by means of next-generation sequencing and junction sequence analysis
Schouppe, D. 2014. Characterization of the recombinant HPPD-4 protein batch 1338_HPPD-4. Study Report BBS13-049. Bayer BioScience N.V. Innovation Center, Technologiepark 38, B-9052 Gent, Belgium. Report Completed on July 11, 2014.
Serrano, H. 2015. The Effect of Temperature on Cry14Ab-1 as Assessed by SDS-PAGE and Western Blot. Study Report No. 15-RSKIT072. Bayer CropScience LP Seed & Trait Safety, 407 Davis Drive, Morrisville, NC 27560, USA. Report Completed on April 2, 2015.
Totis, M. 2014a. Cry14Ab-1 protein In vitro digestibility study in human simulated gastric fluid at pH 1.2. Study Report No. SA 12184. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski BP 153, 06903 Sophia Antipolis Cedex France. Report Completed on February 14, 2014.
Totis, M. 2014b. Cry14Ab-1 protein In vitro digestibility study in human simulated intestinal fluid. Study Report No. SA 12185. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski BP 153, 06903 Sophia Antipolis Cedex France. Report Completed on February 26, 2014.
Totis, M. 2014c. HPPD-4 protein In vitro digestibility study in human simulated gastric fluid at pH 1.2. Study Report No. SA 12187. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski BP 153, 06903 Sophia Antipolis Cedex France. Report Completed on February 4, 2014.
Totis, M. 2014d. HPPD-4 protein In vitro digestibility study in human simulated intestinal fluid. Study Report No. SA 12188. Bayer SAS Crop Science Division, 355 rue Dostoïevski BP 153, 06903 Sophia Antipolis Cedex France. Report Completed on February 13, 2014.
Vandermarliere, N. 2018a. Characterization of Cry14Ab-1 protein purified from GMB151 soybean and comparability with the bacterially-produced Cry14Ab-1 protein batch 1514_Cry14Ab-1. Study Report 17-RSVLT171-A. Bayer BioScience N.V. Innovation Center, Technologiepark 38, B-9052 Gent, Belgium. Report Completed on April 26, 2018.
Vandermarliere, N. 2018b. Characterization of HPPD-4 protein purified from GMB151 soybean and comparability with the bacterially-produced HPPD-4 protein batch
1338_HPPD-4. Study Report 17-RSVLN028-A. Bayer BioScience N.V. Innovation Center, Technologiepark 38, B-9052 Gent, Belgium. Report Completed on June 29, 2018.
