3
Lampiran. Laporan Hasil Pengkajian Keamanan Pangan Jagung PRG Event Bt11 x GA21
I. Pendahuluan
Jagung PRG event Bt11 x GA21 merupakan jagung produk rekayasa genetik dari PT. Syngenta Seed Indonesia yang dihasilkan dari persilangan konvensional 2 event jagung PRG, yaitu jagung PRG event Bt11dan jagung PRG event GA21 yang keduanya telah memperoleh persetujuan keamanan pangan di Indonesia pada tahun 2011. Persilangan konvensional dilakukan dengan menyerbuki bunga betina jagung PRG event Bt11 (sebagai tetua betina) yang sebelumnya telah dikastrasi dengan serbuk sari dari bunga jantan jagung PRG event GA21 (sebagai tetua jantan) untuk menghasilkan jagung PRG event Bt11 x GA21 generasi F1.
Jagung PRG event Bt11 x GA21 mengandung 3 (tiga) gen sisipan, yaitu gen cry1Ab yang memberikan sifat ketahanan terhadap serangga hama penggerek jagung Ostrinia furnacalis, gen pat yang memberikan sifat ketahanan terhadap herbisida berbahan aktif glufosinat, dan gen mepsps yang memberikan sifat ketahanan terhadap herbisida berbahan aktif glifosat.
Jagung PRG event Bt11 x GA21 telah memperoleh sertifikat aman pangan di 13 (tiga belas) negara, yaitu Korea Selatan (2006), Jepang (2007), Meksiko (2007), Filipina (2007, renewal 2012 dan 2018), Argentina (2009), Brazil (2009), Taiwan (2009, renewal 2014), Eropa (2010), Afrika Selatan (2011), Cina (2011, renewal 2014 dan 2017), Kolombia (2012), Paraguay (2015), dan Vietnam (2015).
Jagung PRG event Bt11 x GA21 juga telah memperoleh sertifikat aman pakan di 11 (sebelas) negara, yaitu Jepang (2007), Filipina (2007, renewal 2012 dan 2018), Korea Selatan (2008), Argentina (2009), Brazil (2009), Eropa (2010), Kolombia (2010), Afrika Selatan (2011), Cina (2011, renewal 2014 dan 2017), Paraguay (2015), dan Vietnam (2015). Sertifikat aman lingkungan untuk jagung PRG event Bt11 x GA21 telah diperoleh di 8 (delapan) negara, yaitu Kanada (2005), Jepang (2007), Argentina (2009), Brazil (2009), Filipina (2010, renewal 2015), Afrika Selatan (2010), Paraguay (2015), dan Vietnam (2015).
Pengkajian keamanan pangan jagung PRG event Bt11 x GA21 dilakukan berdasarkan Peraturan Badan Pengawas Obat dan Makanan Nomor 6 Tahun 2018 tentang Pengawasan Pangan Produk Rekayasa Genetik dan surat penugasan Ketua KKH PRG kepada Wakil Ketua Bidang Keamanan Pangan KKH PRG Nomor B-36/KKH-PRG/06/2019 tanggal 13 Juni 2019 perihal Penugasan Pengkajian Keamanan Pangan Produk Rekayasa Genetik (PRG) Komoditas Jagung PRG Stack Event Bt11 x GA21.
TTKH telah melakukan pengkajian keamanan pangan jagung PRG event Bt11 x GA21 berdasarkan informasi genetik dan informasi keamanan pangan yang
4
terdiri atas kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas sebagaimana diuraikan di bawah ini.
II. Informasi Genetik II.1. Elemen Genetik
Jagung PRG event Bt11 x GA21 merupakan jagung PRG stacked event hasil persilangan konvensional antara jagung PRG event Bt11 dengan jagung PRG event GA21. Jagung PRG event Bt11 x GA21 mengandung tiga gen sisipan, yaitu:
Gen cry1Ab, yang dikendalikan oleh promoter 35S cauliflower mosaic virus (CaMV) dan terminator nopaline synthase (NOS) serta ditambahkan sekuen intron 6 dari maize alcohol dehydrogenase 1 (IVS6-ADH1) untuk meningkatkan ekspresi protein Cry1Ab. Gen cry1Ab memproduksi protein Cry1Ab, yang bertanggung jawab dalam ketahanan terhadap serangga hama penggerek jagung Ostrinia furnacalis (Gardner et al., 1981; Mascarenhas et al., 1990; Perlak et al., 1991; Depicker et al., 1982).
Gen pat, yang dikendalikan oleh promoter 35S CaMV dan terminator NOS, serta ditambahkan sekuen IVS6-ADH1 untuk meningkatkan ekspresi protein PAT. Gen pat menyandi enzim phosphinothricin-acetyl-transferase (PAT/pat), yang bertanggung jawab dalam ketahanan terhadap herbisida berbahan aktif glufosinat (Gardner et al., 1981; Mascarenhas et al., 1990; Depicker et al., 1982; Strauch et al., 1988).
Gen mepsps, yang dikendalikan oleh promoter rice Actin 1 yang dikombinasikan dengan rice Actin intron dan sekuen Optimized Transit Peptide (OTP) serta terminator NOS. Gen mepsps menyandi protein mEPSPS, yang bertanggung jawab dalam ketahanan terhadap herbisida berbahan aktif glifosat (McElroy et al., 1990; Lebrun et al., 1996; Bevan et al., 1983).
II.2 Sumber Elemen Genetik
Sumber gen sisipan jagung PRG event Bt11 x GA21 adalah sebagai berikut: (1) gen cry1Ab berasal dari bakteri Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki strain HD-1, (2) gen pat berasal dari Streptomyces viridochromogenes, dan (3) gen mepsps berasal dari tanaman jagung (Zea mays L.).
Promoter 35S berasal dari cauliflower mosaic virus, terminator NOS berasal dari bakteri Agrobacterium tumefaciens, sekuen IVS6-ADH1 berasal dari tanaman jagung, intron actin berasal dari tanaman padi (Oryza sativa L.), dan sekuen OTP berasal dari bunga matahari (Helianthus annus) dan tanaman jagung (Gardner et al., 1981; Mascarenhas et al., 1990; Perlak et al., 1991; Depicker et al., 1982; McElroy et al., 1990; Lebrun et al., 1996; Bevan et al., 1983).
II.3 Sistem Transformasi
Jagung PRG event Bt11 x GA21 merupakan hasil persilangan konvensional, maka tidak ada metode transformasi baru yang dilakukan untuk jagung PRG event Bt11 x GA21. Teknik transformasi mengacu pada event tunggal yang membentuk
5
stack tersebut, yaitu: Jagung PRG event Bt11 dirakit melalui metode sistem transformasi protoplas dengan menyisipkan plasmid pZO1502 ke dalam genom galur jagung. Eksplan yang digunakan dalam transformasi adalah jagung galur HE89 (Mettler et al, 2000). Sebelum dilakukan transformasi, plasmid pZO1502 dipotong dengan enzim restriksi NotI untuk menghilangkan gen bla (amp) dari fragmen yang membawa gen cry1Ab dan pat. Tanaman jagung transgenik kemudian ditumbuhkan dan disilangkan/ disilangbalikkan dengan galur unggul yang akan digunakan sebagai tetua dari hibrida komersial.
Jagung PRG event GA21 dirakit melalui teknik transformasi dengan penembakan partikel (microprojectile bombardment) pada kultur sel suspensi tanaman jagung (Spencer et al., 1997) menggunakan plasmid pDPG434. Eksplan yang digunakan dalam transformasi adalah embrio immature dari galur elite AT yang diturunkan dari galur B73. Sebelum proses transformasi, fragmen DNA restriksi NotI dipisahkan dari plasmid transformasi pDPG434 dan dimurnikan melalui gel agarose, sehingga tidak terdapat sekuen backbone pada fragmen DNA yang diintegrasikan.
II.4 Stabilitas Genetik
Hasil analisis Southern blot jagung PRG event Bt11 x GA21 menunjukkan adanya gen cry1Ab dan pat yang berasal dari jagung PRG event Bt11 dan gen mepsps yang berasal dari jagung GA21. Pola hibridisasi DNA mengkonfirmasi jumlah dan ukuran pita yang diprediksi dari masing masing event menunjukkan bahwa
integritas sisipan transgenik dipertahankan dalam jagung PRG event Bt11 x GA21.
Jagung PRG event Bt11 x GA21 akan selalu dihasilkan dari persilangan antara tetua homozigot Bt11 dan tetua homozigot GA21. Oleh karena itu, stabilitas antar generasi akan ditunjukkan dengan studi yang dilakukan pada jagung PRG event Bt11 dan jagung PRG event GA21. Stabilitas multigenerasi dari sifat yang diintroduksikan ditunjukkan dengan data Mendelian inheritance dan Southern Blot. Hasil analisis pada jagung PRG event Bt11 menunjukkan semua tanaman tahan terhadap penggerek batang atau toleran herbisida glufosinat, atau peka/ rentan terhadap keduanya. Rasio segregasi konsisten seperti yang diharapkan yaitu 1:1, 3:1, atau 1:0 untuk lokus tunggal dominan, tergantung pada generasi yang diteliti. Analisis fenotipik dari tiga generasi berturut-turut jagung PRG event GA21 (BC1F1, BC2F1, dan BC3F1) menunjukkan bahwa sifat toleran terhadap herbisida untuk semua generasi yang diuji mengikuti aturan pewarisan sifat Mendelian dan mengalami segregasi dalam rasio 1:1
Oleh karena itu, hasil analisis Southern Blot dari jagung PRG event Bt11 x GA21 yang dihasilkan dengan persilangan secara konvensional menunjukkan pewarisan keturunan sesuai dengan yang diprediksikan. Pola hibridisasi DNA pada setiap event tunggal tetap teramati pada jagung PRG event Bt11 x GA21 yang menunjukkan bahwa integritas dari sisipan transgenik tetap terpelihara pada hibridanya.
6
transformasi genetik sehingga sekuen backbone tersebut tidak diintegrasikan dan ditemukan pada jagung PRG event Bt11 x GA21.
Berdasarkan hasil kajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa:
1. Jagung PRG event Bt11 x GA21 mengandung tiga gen sisipan, yaitu gen cry1Ab, gen pat, dan gen mepsps, dengan jumlah kopi transgen masing-masing adalah satu kopi untuk gen cry1Ab dan gen pat, dan lima kopi untuk gen mepsps.
2. Gen cry1Ab, gen pat dan gen mepsps dalam jagung PRG event Bt11 x GA21 stabil pada setiap generasi dan diwariskan mengikuti hukum Mendel.
3. Jagung PRG event Bt11 x GA21 tidak mengandung fragmen backbone plasmid transformasi.
III. Informasi Keamanan Pangan III.1 Kesepadanan Substansial
Pengkajian kesepadanan substansial dari jagung PRG event Bt11 x GA21 dilakukan dengan menggunakan biji dan tanaman jagung PRG event Bt11 x GA21 dan jagung non-PRG konvensional sebagai kontrol. Jagung ditanam pada musim tanam tahun 2005 dalam rancangan randomized complete block dengan ulangan tiga kali untuk setiap genotip, di enam lokasi penanaman di Amerika Serikat, yaitu di Janesville, Wisconsin; Alleman, Iowa; Seward, Nebraska; dua lokasi di Bloomington dan Bondville, Illinois. Setelah dipanen, komposisi biji dan tanaman jagung (forage) dianalisis di Covance Laboratories, Inc., Madison, Wisconsin, Amerika Serikat, yang sudah menerapkan Good Laboratory Practices (GLP) (De Fontes, 2006).
Biji jagung dianalisis komposisinya termasuk kadar protein, lemak, abu, air, karbohidrat (dihitung by-difference), pati, serat (acid detergent fiber - ADF dan neutral detergent fiber - NDF, dan total dietary fiber - TDF), mineral (kalsium, kalium, tembaga, magnesium, mangan, natrium, besi, fosfor, seng dan selenium), profil asam amino (alanin, arginin, asam aspartat, sistin, asam glutamat, glisin, histidin, isoleusin, leusin, lisin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirosin, dan valin), profil asam lemak (palmitat, stearat, oleat, linoleat, dan linolenat), vitamin (β-karoten, tiamin, riboflavin, niasin, piridoksin, asam folat, dan α-tokoferol), metabolit sekunder (inositol, p-asam kumarat, dan asam ferulat), dan senyawa antigizi (asam fitat, rafinosa, furfural, dan inhibitor tripsin) (De Fontes, 2006).
Tanaman jagung juga dianalisis komposisinya termasuk kadar protein, lemak, abu, air, karbohidrat (dihitung by-difference), mineral (kalsium dan fosfor), dan serat yang meliputi ADF dan NDF (De Fontes, 2006).
Hasil analisis komposisi biji jagung dan tanaman jagung menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata antara jagung PRG event Bt11 x GA21 dan jagung non-PRG, dan masuk ke dalam kisaran komposisi jagung komersial pada umumnya.
7
Dari hasil pengkajian kesepadanan substansial dapat disimpulkan bahwa jagung PRG event Bt11 x GA21 sepadan secara substansial dengan jagung non PRG. III.2 Alergenisitas
Pengkajian alergenisitas terhadap protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS yang diekspresikan pada jagung PRG event Bt11 x GA21 dilakukan melalui analisis bioinformatika, analisis konsentrasi protein, dan pengujian stabilitas protein yang meliputi stabilitas cerna dan stabilitas panas. Pengujian alergenisitas dilakukan di laboratorium yang telah menerapkan GLP.
III.2.1 Analisis Bioinformatika
Analisis kemiripan sekuen protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS dengan protein alergen dilakukan dengan menggunakan database protein alergen yang diperoleh dari Food Allergy Research and Resource Program (FARRP) AllergenOnline Database, versi 2014 dan 2016 dengan perangkat FASTA, serta pencarian kesamaan sekuen delapan atau lebih asam amino dengan sekuen protein dalam database (Bailey, 2016a; Bauman, 2014a dan 2016a).
Hasil analisis menunjukkan bahwa tidak ada kemiripan sekuen asam amino yang relevan secara biologis (35% atau lebih kesamaan sekuen asam amino di dalam fragmen yang mengandung 80 asam amino) antara protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS dengan sekuen asam amino protein alergen. Selain itu, tidak ada kesamaan sekuen delapan asam amino atau lebih pada protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS dengan protein alergen dalam database (Bailey, 2016a; Bauman, 2014a dan 2016a).
III.2.2 Analisis Konsentrasi Protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS
Konsentrasi protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS pada jaringan tanaman jagung PRG event Bt11 x GA21, konsentrasi protein Cry1Ab dan PAT pada jaringan jagung PRG event Bt11, serta konsentrasi protein mEPSPS pada jaringan jagung
PRG event GA21 ditentukan menggunakan metode enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) (McDonald, 2018).
Konsentrasi protein di dalam biji jagung PRG event Bt11 x GA21 ditemukan masing-masing sebesar 0,583 – 1,09 μg/g berat kering untuk protein Cry1Ab, di bawah Limit of Detection (LOD = 0,025 μg/g berat kering) untuk protein PAT, dan di bawah Limit of Quantification (LOQ = 4,0 μg/g berat kering) untuk protein mEPSPS.
Kandungan protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS dalam biji jagung PRG event Bt11 x GA21 jumlahnya sangat kecil, yaitu masing-masing sebesar 0,00068%, 0,00002%, dan 0,0033% dari jumlah protein total dalam biji jagung PRG event Bt11 x GA21 (De Fontes, 2006; McDonald, 2018).
Konsentrasi protein di dalam biji jagung PRG event Bt11 ditemukan masing-masing sebesar 0,750 – 0,902 μg/g berat kering untuk protein Cry1Ab, dan di
8
bawah LOD (LOD = 0,025 μg/g berat kering) untuk protein PAT (Privalle, 2000; 2003; McDonald, 2018). Konsentrasi protein mEPSPS di dalam biji jagung PRG event GA21 ditemukan sebesar 2,0 – 4,42 μg/g berat kering (Hill, 2006; McDonald, 2018).
Kandungan protein Cry1Ab dan PAT dalam biji jagung PRG event Bt11 jumlahnya sangat kecil, yaitu, masing-masing sebesar 0,00083% dan 0,00002% dari protein total (Bothona et al., 2006; McDonald, 2018). Kandungan protein mEPSPS dalam biji jagung PRG event GA21 jumlahnya juga sangat kecil, yaitu sebesar 0,0055% dari protein total (Launis dan Kramer, 2006; McDonald, 2018).
Beberapa studi lainnya juga menunjukkan, bahwa konsentrasi protein transgenik yang diproduksi oleh tanaman PRG stacked events setara dengan konsentrasi protein transgenik yang diekspresikan oleh tanaman PRG single event atau tanaman tetuanya (Gampala et al., 2017; De Cerqueira et al., 2019).
III.2.3 Analisis Stabilitas Protein
Protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS dihasilkan dalam jumlah yang sedikit oleh tanaman jagung PRG event Bt11 x GA21, sehingga untuk keperluan pengujian stabilitas protein digunakan protein yang diproduksi pada bakteri Escherichia coli. Tanaman jagung PRG event Bt11 x GA21 merupakan hasil pemuliaan tanaman melalui persilangan konvensional dari kedua tanaman tetua, jagung PRG event Bt11 dan tanaman jagung PRG event GA21, maka untuk pengujian kesetaraan, protein Cry1Ab dan PAT yang dihasilkan oleh bakteri E. coli dibandingkan dengan protein Cry1Ab dan PAT yang diekspresikan di dalam tanaman jagung PRG event Bt11, sedangkan protein mEPSPS yang dihasilkan oleh bakteri E. coli dibandingkan dengan protein mEPSPS yang diekspresikan di dalam tanaman jagung PRG event GA21. Kesetaraan protein diuji dengan menggunakan metode SDS-PAGE, Western blot, analisis immunoreaktivitas dengan ELISA, analisis sekuen N-terminal, analisis glikosilasi, aktivitas insektisidal atau aktivitas enzimatik, dan analisis pemetaan massa peptida dengan metode cyanogen bromide (CNBr).
Hasil analisis menunjukkan bahwa protein Cry1Ab dan PAT yang dihasilkan oleh bakteri E. coli ekivalen dengan protein Cry1Ab dan PAT yang dihasilkan oleh jagung PRG event Bt11 (Meeusen dan Mettler, 2000). Hasil analisis juga menunjukkan bahwa protein mEPSPS yang dihasilkan oleh bakteri E. coli ekivalen dengan protein mEPSPS yang dihasilkan oleh jagung PRG event GA21 (Graser, 2005a).
Pembandingan kesetaraan protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS yang dihasilkan oleh tanaman jagung PRG event Bt11 x GA21 dengan protein Cry1Ab dan PAT yang diekspresikan di dalam tanaman jagung PRG event Bt11 serta protein mEPSPS yang dihasilkan oleh tanaman jagung PRG event GA21 dapat dilakukan, karena hasil pengkajian sebelumnya terhadap beberapa tanaman PRG yang
9
merupakan stacked events menunjukkan bahwa stabilitas genetik tanaman stacked events tidak berbeda dengan stabilitas genetik tanaman tetuanya (Weber et al., 2012; Kok et al., 2014), serta tidak terdapat perbedaan signifikan dalam komposisi senyawa maupun fenotip antara tanaman stacked events dengan tanaman tetuanya (Steiner et al., 2013; Kok et al., 2014; Kramer et al., 2016).
III.2.3.1 Analisis Stabilitas Cerna Protein
Analisis stabilitas cerna protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS dilakukan menggunakan simulasi cairan lambung (Simulated Gastric Fluid - SGF) dan simulasi cairan usus (Simulated Intestinal Fluid - SIF) dalam rentang waktu 60 menit pada suhu 37°C. Hasil hidrolisis protein dievaluasi dengan menggunakan SDS-PAGE dan Western blot.
Hasil evaluasi adalah sebagai berikut:
Protein Cry1Ab
Setelah inkubasi selama 2 menit dalam SGF dengan menggunakan pepsin pada pH 1,2 dan suhu 37°C, tidak terdeteksi adanya pita protein utuh Cry1Ab maupun fragmen-fragmennya (Privalle, 1994a). Setelah inkubasi selama 1 menit dalam SIF dengan menggunakan pankreatin pada pH 7,5, tidak terdeteksi adanya pita protein utuh Cry1Ab, namun terdeteksi adanya pita fragmen-fragmen protein Cry1Ab yang masing-masing berukuran 57 dan 33 kDa. Pita fragmen-fragmen tersebut tidak terdeteksi lagi setelah inkubasi selama 60 menit dalam SIF berdasarkan evaluasi dengan Western blot (Guo, 2015).
Protein mEPSPS
Setelah inkubasi selama 1 menit dalam SGF dengan menggunakan pepsin pada pH 1,2, tidak terdeteksi adanya pita protein utuh mEPSPS, namun masih terdeteksi adanya pita fragmen protein mEPSPS yang berukuran 6 kDa. Pita fragmen tersebut tidak terdeteksi lagi setelah inkubasi selama 5 menit dalam SGF (Graser, 2005b). Setelah inkubasi selama 1 menit dalam SIF dengan menggunakan pankreatin pada pH 7,5, tidak terdeteksi adanya pita protein utuh mEPSPS maupun fragmen-fragmennya berdasarkan evaluasi dengan Western blot (Graser dan Mims, 2006a).
Protein PAT
Setelah inkubasi selama 1 menit dalam SGF dengan menggunakan pepsin pada pH 1,2, tidak terdeteksi adanya pita protein utuh PAT maupun fragmen-fragmennya (Privalle, 1994b; Song dan Lentz, 2012). Demikian pula setelah inkubasi selama 5 menit dalam SIF dengan menggunakan pankreatin pada pH 7,5, tidak terdeteksi adanya pita protein utuh PAT maupun fragmen-fragmennya berdasarkan evaluasi dengan Western blot (Song dan Winslow, 2010).
10
III.2.3.2 Analisis Stabilitas Panas ProteinAnalisis efek pemanasan terhadap immunoreaktivitas protein PAT dan mEPSPS yang diproduksi oleh E. coli dilakukan dengan ELISA menggunakan antibodi yang masing-masing spesifik terhadap protein PAT dan mEPSPS (Mims, 2007; Lentz, 2013). Selain itu, juga dilakukan pengujian efek pemanasan terhadap aktivitas enzimatik dari protein mEPSPS (Kramer, 2005) dan PAT (Song, 2012), serta terhadap aktivitas insektisidal dari protein Cry1Ab (Graser dan Mims, 2006b).
Hasil pengujian stabilitas panas protein adalah sebagai berikut:
Protein PAT mengalami penurunan immunoreaktivitas sebesar 94,6% setelah pemanasan pada suhu 65°C selama 30 menit, dan kehilangan hampir seluruh immunoreaktivitasnya setelah pemanasan pada suhu 95°C selama 30 menit (Lentz, 2013). Aktivitas enzimatik dari protein PAT tidak terdeteksi setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu 65°C atau lebih (Song, 2012).
Protein mEPSPS kehilangan hampir seluruh immunoreaktivitasnya setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu 65°C atau lebih (Mims, 2007). Protein mEPSPS kehilangan aktifitas enzimatiknya setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu 65°C atau lebih (Kramer, 2005).
protein Cry1Ab kehilangan seluruh aktivitas insektisidalnya terhadap hama European corn borer (Ostrinia lubilalis) setelah pemanasan selama 30 menit pada suhu 65°C atau lebih (Graser dan Mims, 2006b).
Berdasarkan hasil pengkajian alergenisitas yang meliputi analisis bioinformatika, konsentrasi dan stabilitas protein, dapat disimpulkan bahwa protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS tidak berpotensi menimbulkan alergi.
III.3 Toksisitas
Pengujian toksisitas terhadap protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS yang diekspresikan pada jagung event Bt11 x GA21 dilakukan melalui analisis bioinformatika dan toksisitas akut yang dilakukan di laboratorium yang menerapkan GLP.
III.3.1 Analisis Bioinformatika
Analisis kemiripan sekuen protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS dengan sekuen protein toksin dilakukan dengan perangkat BLASTP menggunakan database sekuen protein yang terdapat dalam National Center for Biotechnology Information (NCBI) Entrez® Protein Database, serta Syngenta Toxin Database. Hasil analisis menunjukkan bahwa tidak terdapat kemiripan sekuen asam amino antara protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS dengan sekuen asam amino protein toksin dalam database yang digunakan (Bailey, 2016b; Bauman, 2014b dan 2016b).
III.3.2 Toksisitas Akut Protein Cry1Ab
Jumlah protein Cry1Ab yang dihasilkan oleh tanaman jagung PRG event Bt11 sangat sedikit, sehingga untuk keperluan pengujian toksisitas akut digunakan protein Cry1Ab yang diproduksi pada bakteri E. coli. Hasil analisis ekivalensi
11
menunjukkan kesamaan protein Cry1Ab yang diproduksi pada tanaman jagung PRG event Bt11 dengan protein Cry1Ab yang diproduksi di E. coli (Meeusen and Mettler, 2000).
Bahan yang diuji adalah protein Cry1Ab-09-0113 yang mengandung Cry1Ab-09 sebesar 78.3%. Cry1Ab-09 adalah protein insektisidal Cry1Ab yang tidak utuh. Dalam pengujian ini digunakan mencit jantan dan betina strain Crl:CD-1(ICR) yang berumur 9 minggu pada awal pengujian, dengan berat badan antara 30,8 – 33,6 g (mencit jantan) dan 22,9 – 27,4 g (mencit betina), yang berasal dari Charles River Laboratories, Raleigh, NC (Morris, 2014).
Mencit diaklimatisasi selama 9 hari, dan dipelihara secara individual di dalam kandang yang ditempatkan dalam ruangan dengan suhu 22 ± 3°C, kelembaban nisbi 50 ± 20%, dan pencahayaan selama 12 jam terang 12 jam gelap. Ransum bersertifikat Rodent LabDiet® 5002 (PMI Nutrition International, LLC) dan air minum diberikan secara ad libitum (Morris, 2014).
Sebanyak 10 ekor mencit jantan dan 10 ekor mencit betina dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu (1) kelompok kontrol yang dicekok dengan carboxymethylcellulose (CMC) 0.5% b/v; dan (2) kelompok perlakuan yang dicekok larutan protein Cry1Ab-09 dengan dosis 2000 mg/kg BB dalam 0.5% CMC. Setiap kelompok terdiri dari 5 ekor mencit jantan dan 5 ekor mencit betina. Pemberian bahan uji atau kontrol hanya dilakukan sekali pada awal pengujian dan pengamatan berlangsung selama 14 hari (Morris, 2014).
Pemeriksaan fisik secara detil dilakukan pada masa aklimatisasi, pada hari pencekokan, hari ke-7, dan ke-14 (saat pembedahan/ nekropsi). Pemeriksaan klinis dilakukan pada awal pengujian dan setiap hari selama pengujian berlangsung. Penimbangan berat badan dilakukan pada: (1) sebelum perlakuan (pada masa aklimatisasi), (2) hari ke-0 sebelum pencekokan bahan uji; dan (3) 2 kali seminggu pada masa pengamatan. Pada hari terakhir pengujian, semua mencit dimatikan menggunakan CO2, dan selanjutnya dilakukan pembedahan (nekropsi) lengkap. Pemeriksaan mikroskopis dilakukan pada organ tertentu (Morris, 2014).
Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) tidak terdapat mencit yang mati selama pengujian berlangsung, (2) tidak ditemukan adanya kelainan klinis akibat pemberian bahan uji, (3) tidak terdapat perbedaan nyata pada berat badan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol, (4) tidak terdapat perbedaan jumlah pakan yang dikonsumsi, dan (5) tidak ada perubahan histologis yang diakibatkan oleh pemberian bahan uji (Morris, 2014).
Berdasarkan pengujian tersebut disimpulkan bahwa tidak terdapat efek toksik pada mencit akibat pemberian protein Cry1Ab-09 hingga 2000 mg/kg BB.
12
Jumlah protein PAT yang dihasilkan oleh tanaman jagung PRG event Bt11 x GA21 dalam jumlah sedikit, sehingga untuk pengujian toksisitas akut digunakan protein PAT yang diproduksi pada bakteri E. coli. Hasil analisis ekivalensi menunjukkan kesamaan protein PAT yang diproduksi pada tanaman jagung PRG event Bt11 dengan protein PAT yang diproduksi di E. coli (Meeusen dan Mettler, 2000).
Bahan yang diuji adalah protein PAT, dengan kemurnian sebesar 85,9 %, yang dilarutkan dalam CMC 0.1% b/v, dengan dosis 2000 mg/kg berat badan. Dalam pengujian ini digunakan mencit jantan dan betina strain Crl:CD1(ICR) yang berumur sekitar 52 hari, dengan berat badan rata-rata 27,4 g (mencit jantan) dan 25,2 g (mencit betina), yang berasal dari Charles River Laboratories Inc., Portage, Michigan (Hosako, 2013).
Mencit diaklimatisasi selama 18 hari, dan ditempatkan dalam kandang stainless steel secara individual untuk mencit jantan dan 2 - 3 ekor per kandang untuk mencit betina. Kandang ditempatkan dalam ruangan dengan suhu 22 + 3oC, kelembaban nisbi 50 +20%, dan pencahayaan selama 12 jam terang dan 12 jam gelap. Ransum bersertifikat Rodent LabDiet #5002 (PMI Nutrition International, LLC) yang berupa meal dan air minum diberikan secara ad libitum (Hosako, 2013).
Sebanyak 20 ekor mencit jantan dan betina dibagi menjadi dua kelompok, yaitu (1) kelompok kontrol yang dicekok pelarut CMC 0.1% b/v; dan (2) kelompok perlakuan yang dicekok larutan protein PAT dengan dosis 2000 mg/kg BB. Setiap kelompok terdiri dari 5 ekor mencit jantan dan 5 ekor mencit betina. Pemberian bahan uji dilakukan sebanyak dua kali dengan jarak waktu 2 jam, dan pengamatan berlangsung selama 14 hari (Hosako, 2013).
Penimbangan berat badan dilakukan selama periode aklimatisasi, dan pada hari ke-1, 4, 7 dan 15. Pertambahan berat badan dihitung relatif terhadap berat badan pada hari ke-1. Pemeriksaan dalam kandang untuk mendeteksi adanya abnormalitas klinis dan memonitor kesehatan hewan secara umum dilakukan minimal sehari sekali, biasanya pada pagi hari. Selain itu, pengamatan juga dilakukan untuk menentukan morbiditas, mortalitas dan ketersediaan ransum dan air, minimal dua kali sehari. Pengamatan klinis secara detail dilakukan terhadap mencit sebelum dilakukan pencekokan pertama, dan selanjutnya dilakukan satu kali setiap hari sampai akhir pengujian (Hosako, 2013).
Pada akhir pengujian, mencit yang masih hidup dianestesi dengan inhalasi CO2, kemudian dimatikan dan dilakukan pembedahan (nekropsi) lengkap serta pemeriksaan makroskopis dan mikroskopis. Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) selama pengujian berlangsung tidak terdapat mencit yang mati; (2) semua mencit menunjukkan adanya kenaikan berat badan; dan (3) tidak ditemukan adanya kelainan klinis dan patologis pada mencit akibat pemberian bahan uji (Hosako, 2013).
13
Berdasarkan pengujian tersebut disimpulkan bahwa tidak terdapat efek toksik pada mencit akibat pemberian protein PAT hingga 2000 mg/kg BB.
III.3.4 Toksisitas Akut Protein mEPSPS
Jumlah protein mEPSPS yang dihasilkan oleh tanaman jagung PRG event Bt11 x GA21 dalam jumlah sedikit, sehingga untuk pengujian toksisitas akut digunakan protein mEPSPS yang diproduksi pada bakteri E. coli. Hasil analisis ekivalensi menunjukkan kesamaan protein mEPSPS yang diproduksi pada tanaman jagung PRG event GA21 dengan protein mEPSPS yang diproduksi di E. coli (Graser, 2005a).
Bahan yang diuji adalah protein GA21-0104 (bahan aktif protein mEPSPS) dengan kemurnian 83 %. Dalam pengujian ini digunakan mencit jantan dan betina strain Alpk:APfCD-1 yang berumur 8 - 12 minggu pada awal pengujian, dengan berat badan antara 43,6 - 43,9 g (mencit jantan) dan 33,4 - 33,6 g (mencit betina), yang berasal dari Rodent Breeding Unit, Alderley Park, Macclesfield, Cheshire, UK (Barnes, 2005).
Mencit diaklimatisasi selama 5 hari, dan ditempatkan dalam kandang stainless steel yang berisi 5 ekor mencit setiap kandang. Setelah itu mencit ditempatkan dalam kandang stainless steel secara individual. Kandang ditempatkan dalam ruangan dengan suhu 22 + 3oC, kelembaban nisbi 30 - 70%, dan pencahayaan selama 12 jam terang 12 jam gelap. Ransum berupa CTl powdered (Special Diet Services Limited, Witham, Essex, UK) dan air minum diberikan secara ad libitum (Barnes, 2005).
Sebanyak 20 ekor mencit jantan dan betina dibagi menjadi dua kelompok, yaitu (1) kelompok kontrol yang dicekok pelarut air bebas ion dengan dosis 2,0 ml/kg BB; dan (2) kelompok perlakuan yang dicekok dengan larutan protein mEPSPS dalam air bebas ion dengan dosis 2000 mg/kg BB. Setiap kelompok terdiri dari 5 ekor mencit jantan dan 5 ekor mencit betina. Sebelum pemberian cekokan, semua mencit dipuasakan selama 3 jam (ransum ditiadakan kecuali air). Setelah itu dilakukan pengamatan selama 14 hari (Barnes, 2005).
Penimbangan berat badan dilakukan selama periode aklimatisasi, pada hari ke-1 sebelum pemberian cekokan, dan setiap hari sampai akhir pengujian. Penambahan berat badan dihitung relatif terhadap berat badan pada hari ke-1. Pemeriksaan untuk mendeteksi adanya abnormalitas klinis dan memonitor kesehatan mencit secara umum dilakukan minimal sehari sekali, biasanya pada pagi hari. Selain itu, pengamatan juga dilakukan untuk menentukan morbiditas, mortalitas, dan ketersediaan ransum dan air minum, minimal dua kali sehari. Pengamatan klinis secara detail dilakukan terhadap mencit sebelum dilakukan pencekokan, dan selanjutnya dilakukan satu kali setiap hari sampai akhir pengujian (Barnes, 2005).
14
Pada akhir pengujian, mencit yang masih hidup dianestesi dengan inhalasi uap halotan, kemudian dimatikan dengan cara exsanguination. Selanjutnya dilakukan pembedahan (nekropsi) lengkap serta pemeriksaan makroskopis dan mikroskopis. Hasil pengujian menunjukkan bahwa: (1) tidak ditemukan adanya kelainan klinis pada mencit akibat pemberian bahan uji; (2) tidak terdapat perbedaan nyata pada berat badan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol; (3) tidak terdapat perbedaan jumlah pakan yang dikonsumsi, dan (4) tidak ditemukan adanya kelainan makroskopis dan mikroskopis akibat pemberian bahan uji (Barnes, 2005).
Berdasarkan pengujian tersebut disimpulkan bahwa tidak terdapat efek toksik pada mencit akibat pemberian protein mEPSPS hingga 2000 mg/kg BB.
Berdasarkan hasil pengkajian toksisitas dapat disimpulkan bahwa protein Cry1Ab, PAT, dan mEPSPS dari jagung PRG event Bt11 x GA21 tidak bersifat toksik.
IV. Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengkajian tentang informasi genetik, kesepadanan substansial, alergenisitas, dan toksisitas disimpulkan hal-hal sebagai berikut:
1. Jagung PRG event Bt11 x GA21 mengandung satu kopi sisipan gen cry1Ab dan gen pat dan lima kopi gen mepsps, yang stabil pada setiap generasi, diwariskan mengikuti hukum Mendel, dan tidak mengandung sekuen backbone plasmid transformasi.
2. Jagung PRG event Bt11 x GA21 sepadan secara substansial dengan jagung non PRG; tidak berpotensi menimbulkan alergi; dan termasuk ke dalam bahan yang tidak toksik.
3. TTKH menilai bahwa jagung PRG event Bt11 x GA21 yang diajukan adalah aman untuk dikonsumsi sebagai bahan pangan.
4. Apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan pangan yang diperoleh hingga saat ini, maka status keamanan pangan jagung PRG event Bt11 x GA21 perlu dikaji ulang.
5. Apabila setelah ditetapkan aman pangan, kemudian jagung PRG event Bt11 x GA21 tersebut terbukti menimbulkan dampak negatif terhadap kesehatan manusia maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan, serta menarik jagung PRG event Bt11 x GA21 dari peredaran.
6. Jagung PRG event Bt11 x GA21 tidak boleh digunakan sebagai pakan sampai memperoleh sertifikat aman pakan.
7. Jagung PRG event Bt11 x GA21 tidak boleh dibudidayakan sampai ditetapkan aman lingkungan.
V. Daftar Acuan
Bailey, K. 2016a. Cry1Ab: Assessment of Amino Acid Sequence Similarity to Known or Putative Allergens. Syngenta Report No. SSB-115-16. Syngenta Seeds, LLC., 3054
15
East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on April 26, 2016.
Bailey, K. 2016b. Cry1Ab: Assessment of Amino Acid Sequence Similarity to Known or Putative Toxins. Syngenta Report No. SSB-116-16 A2. Syngenta Seeds, LLC., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on September 21, 2016.
Bauman, P.A. 2014a. mEPSPS: Assessment of Amino Acid Sequence Similarity to Known or Putative Allergens. Syngenta Report No. SSB-116-14. Syngenta Seeds, LLC., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on April 8, 2014.
Bauman, P.A. 2014b. mEPSPS: Assessment of Amino Acid Sequence Similarity to Known or Putative Toxins. Syngenta Report No. SSB-100-14. Syngenta Seeds, LLC., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on April 4, 2014.
Bauman, P.A. 2016a. PAT (pat): Assessment of Amino Acid Sequence Similarity to Known or Putative Allergens. Syngenta Report No. SSB-106-16. Syngenta Seeds, LLC., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on May 25, 2016.
Bauman, P.A. 2016b. PAT (pat): Assessment of Amino Acid Sequence Similarity to Known or Putative Toxins. Syngenta Report No. SSB-108-16 A1. Syngenta Seeds, LLC., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on August 2, 2016.
Barnes E, 2005. GA21-0104: Single Dose Oral Toxicity Study in the Mouse. Sponsor: Syngenta Seeds, Inc. 3054 East Cornwallis Road, Research Triangle Park, NC, 27709, USA. Sponsor Reference: T022631-04 CTL Test Substance Reference Number: Y13288/001 CTL.Study Number: AM7513. Document Number: CTL/ AM7513/ REG/ REPT
Bevan M., Barnes W.M. dan Chilton M.D. 1983. Structure and transcription of the nopaline synthase gene region of T-DNA. Nucl. Acids Res. 11:369-385
Bothona, C., Gomes, M., Duarte, J. dan Holt, k. 2006. Composition Analysis of the Grain and Forage of Bt11 Corn Expressing the Cry1A(b) and PAT Proteins. Syngenta Report No. LEX-102-06. Syngenta Seeds Ltda. Regulatory Affairs & New Traits, São Paulo –SP 2007. Report Completed on November 30, 2006.
De Cerqueira, D.T., Fast, B.J., Silveira, A.C. dan Herman, R.A. 2019. Transgene-product expression levels in genetically engineered breeding stacks are equivalent to those of the single events, GM Crops & Food 10: 35–43.
16
De Fontes, J. 2006. Compositional Analysis of Grain and Forage from a Bt11 x GA21 Maize Hybrid Grown During 2005 in the USA. Study Number BTGA-05-101, Report No. SSB-173-06. Syngenta Biotechnology, Inc., Regulatory Science, Post Office Box 12257 3054 East Cornwallis Road, Research Triangle Park, North Carolina, USA 27709-2257
Depicker A., Stachel S., Dhaese P., Zambryski P. dan Goodman H.M. 1982. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Journal of Molecular Applied Genetics, 1:561-573
Gampala, S.S., Fast, B.J., Richey, K.A., Gao, Z., Hill, R.C., Wulfkuhle, B.E., Shan, G., Bradfisch, G.A. dan Herman, R.A. 2017. Single-event transgene product levels predict levels in genetically modified breeding stacks. J. Agric. Food Chem. 65:7885–7892.
Gardner R.C., Howarth A.J., Hahn P., Brown-Luedi M., Sheperd R.J., dan Messing J. 1981. The complete nucleotide sequence of an infectious clone of cauliflower mosaic virus by M13mp7 shotgun sequencing. Nucl. Acids Res. 9:2871-2888
Graser, G. 2005a. Characterization of the Double Mutated Maize 5-Enolpyruvyl-shikimate 3-Phosphate Synthase (mEPSPS) Enzyme Produced in Event GA21-Derived Maize (Corn) and Comparison with mEPSPS Expressed in Recombinant Escherichia coli. Syngenta Report No. SSB-008-05. Syngenta Biotechnology, Inc. 3054 East Cornwallis Road PO Box 12257 Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on November 29, 2005.
Graser, G. 2005b. In vitro Digestibility of Double-Mutated Maize 5-Enol Pyruvylshikimate-3-Phosphate Synthase (mEPSPS) Test Substances GA21-0104 and IAPGA21-0105 Under Simulated Mammalian Gastric Conditions. Syngenta Report No. SSB-007-05 A1. Syngenta Biotechnology, Inc., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on November 29, 2005.
Graser, G., dan Mims, G. 2006a. In vitro Digestibility of 5-Enol Pyruvylshikimate-3-Phosphate Synthase (mEPSPS) Test Substance GA21-0104 under Simulated Mammalian Intestinal Conditions. Syngenta Report No. SSB-046-06. Syngenta Biotechnology, Inc., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on October 24, 2006.
Graser, G. dan Mims, G. 2006b. Effect of Temperature on the Stability of Full-Length Cry1Ab Protein. Syngenta Report No. SSB-035-06. Syngenta Biotechnology, Inc., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on November 10, 2006.
Guo, D. 2015. In vitro Digestibility of Cry1Ab-09 Protein under Simulated Mammalian Intestinal Conditions. Syngenta Report No. PASC-REP-0543 A1. Syngenta Seeds,
17
Inc., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on October 24, 2006.
Hill, K. 2006. Quantification of mEPSPS (Double Mutated Maize 5-Enol Pyruvylshikimate-3-Phosphate Synthase) in Maize Tissues and Whole Plants Derived from Transformation Event GA21. Syngenta Report No. SSB-017-05 A1. Syngenta Biotechnology, Inc., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on March 8, 2006.
Hosako, H. 2013. PAT: Acute Oral (Gavage) Toxicity Study in Mice with a 14-Day Observation Period. Company Report. Performing laboratory: WIL Research, 1407 George Road, Ashland, OH 44805-8946, USA. Laboratory project ID: Report number: WIL-639181, Study number: WIL-639181, Task number: TK0117267. Sponsor: Syngenta Crop Protection, LLC, 410 Swing Road, Post Office Box 18300, Greensboro, NC 27419-8300, USA.
Kok, E., Pedersen, J., Onori, R., Sowa, S., Schauzu, M., De Schrijver, A. dan Teeri, T. 2014. Plants with stacked genetically modified events: to assess or not to assess? Trends Biotechnol. 32, 70–73.
Kramer, C. 2005. Effect of Temperature on the Stability Double Mutated Maize 5-Enolpyruvylshikimate-3-Phosphate Synthase (mEPSPS) Enzyme. Syngenta Report No. SSB-016-05. Syngenta Biotechnology, Inc. 3054 East Cornwallis Road PO Box 12257 Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on June 06, 2005.
Kramer, C., Brune, P., McDonald, J., Nesbitt, M., Sauve, A. dan Storck-Weyhermueller, S. 2016. Evolution of risk assessment strategies for food and feed uses of stacked GM events. Plant Biotechnol. J. 14,1899–1913
Launis, K. dan Kramer, C. 2006. Compositional Analysis of Grain and Forage Derived from Event GA21 Hybrid Maize and a Nontransgenic, Near-isogenic Hybrid Maize, Grown During 2005 in the USA. Syngenta Report No. SSB-132-06. Syngenta Biotechnology, Inc. 3054 East Cornwallis Road PO Box 12257 Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on July 18, 2006.
Lebrun M., Leroux B., dan Sailland A. 1996. Chimeric gene for the transformation of planta. U.S. patent number 5,510,471
Lentz, E., 2013. Effect of Temperature on the Immunoreactivity of Phosphinothricin Acetyltransferase (PAT). Syngenta Report No. TK0062552. Syngenta Seeds, Inc. 3054 East Cornwallis Road PO Box 12257 Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on July 29, 2013.
Mascarenhas D., Mettler I.J., Pierce D.A. dan Lowe H.W. 1990. Intron-mediated enhancement of heterologous gene expression in maize. Plant Mol. Biol. 15:913-920
18
McDonald, J. 2018. Quantification of Transgenic Protein Concentrations in Bt11 × GA21, Event Bt11, and Event GA21 Maize Tissues Grown in India in 2016. Syngenta Report No. SSB-144-16. Syngenta Crop Protection, LLC. 9 Davis Drive, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257 USA. Report Completed on March 21, 2018.
McElroy D., Zhang W., Cao J., dan Wu R. 1990. Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. Plant Cell, 2:163-171
Meeusen, R. dan Mettler, I. 2000. Equivalence of Plant and Microbially Produced Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1 Protein. Lab Project Number: 1/NK5EQ. Novartis Seeds/Nothrup King Co. Research; University of Wisconsin-Biotechnology Center; and Kendrick Laboratory; Washington University School of Medicine-Protein and Nucleic Acid Chemistry Laboratory. Report Completed on August 22, 1994, Revised on July 3, 1998 dan October 23, 2000
Mims, G. 2007. Effect of Temperature on the Immunoreactivity of the Double-Mutated Maize 5-Enol Pyruvylshikimate-3-Phosphate Synthase (mEPSPS) Enzyme. Syngenta Report No. SSB-021-07. Syngenta Biotechnology, Inc., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on July 27, 2007.
Morris, TD. 2014. An Acute Oral Gavage Toxicity Study of Cry1Ab-09-0113 in CD-1 Mice with a 14-Day Recovery Period. Report No. WIL-6392. WIL Research, 1407 George Road, Ashland, OH 44805-8946 USA. Study Completion on September 30, 2014.
Perlak F.J., Fuchs R.L., Dean D.A., McPherson S.L. dan Fischhoff D. 1991. Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328
Privalle, L. 1994a. In Vitro Digestibility of CryIA(b) Protein from BT Maize (Corn) and Bacillus thuringiensis Subspecies Kurstaki under Simulated Mammalian Gastric Conditions. CIBA-Geigy Report No. CAB-007-94. Agricultural Biotechnology Research Unit CIBA-Geigy Corporation., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on July 22, 2000. Privalle, L. 1994b. In Vitro Digestibility and Inactivation of their BAR Marker Gene Product Phosphinothricin Acetyltransferasi (PAT) Under Simulated Mammalian Gastric Conditions. CIBA-Geigy Report No. CAB-008-94. Agricultural Biotechnology Research Unit CIBA-Geigy Corporation., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on October 13, 2000.
19
Privalle, L. 2000. Quantification of Cry1A(b) and PAT Proteins in AtributeTM Insect Protected Sweet Corn Kernels. Novartis Report No. NSV-001-00. Novartis Seeds, Inc., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on October 13, 2000.
Song, S. 2012. Effect of Temperature on the Enzymatic Activity of Phosphinothricin Acetyltransferase (PAT) Protein. Syngenta Report No. TK0062553. Syngenta Seeds, Inc. 3054 East Cornwallis Road PO Box 12257 Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on September 24, 2012.
Song, S., dan Lentz, E. 2012. In vitro Digestibility of Phosphinothricin Acetyltransferase (PAT) Protein Under Simulated Mammalian Gastric Conditions. Syngenta Report No. TK0062551. Syngenta Seeds, Inc., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on June 13, 2012. Song, S., dan Winslow, S. 2010. In vitro Digestibility of Phosphinothricin Acetyltransferase (PAT) Protein under Simulated Mammalian Intestinal Conditions. Syngenta Report No. SSB-046-06. Syngenta Biotechnology, Inc., 3054 East Cornwallis Road, Post Office Box 12257, Research Triangle Park, NC 27709-2257, USA. Report Completed on October 13, 2010.
Strauch, E., Wohlleben, W., dan Piihler, A. 1988. Cloning of the phosphinothricin-N-acetyl-transferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tfi 494 and its expression in Streptomyces lividans and Escherichia coli. Gene 63, 65-74
Steiner, H.-Y., Halpin, C., Jez, J.M., Kough, J., Parrott, W., Underhill, L., Weber, N. et al. 2013. Editor’s Choice: evaluating the potential for adverse interactions within genetically engineered breeding stacks. Plant Physiol. 161, 1587–1594.
Weber, N., Halpin, C., Hannah, L.C., Jez, J.M., Kough, J. dan Parrott, W. 2012. Editor’s choice: crop genome plasticity and its relevance to food and feed safety of genetically engineered breeding stacks. Plant Physiol. 160, 1842–1853.
