!,in/oensls Snail As Intermediate Host of Schistosomiasis in Central Sulawesi)

furnal Vektor Penyakit, Vol. VII No. 1, 2013 :'J,6 - 22

Optimasi Teknik Isolasi

DI\IA

dan

RAPD

_-

PCR

pada Keong

oncomelania

hup

ensis

lindo

ensls

sebagai

Hospes

perantara

.Schistos

omiasis

di

Sulawesi Tengah

(Optimization

Techniqwes

und

Isolation

DNA RAPD

-

PCR

Oncomelania

Hup_ensis

_!,in/oensls

Snail

As

Intermediate

Host

of

Schistosomiasis

in

Central

Sulawesi)

Gunawan*

Balai Litbang P2B2 Donggala, Badan Litbang Kesehatan, Kementerian Kesehatan, RI

INFO ARTIKEL

ABSTRACT/ABSTRAK

Keywords :

Schistosomiasis

DNA,

O.h.lindoinsis,

RAPD-PCR

ln Indonesia schistosomiasis is caused by Schistosoma japonicum with O.h.lindoensis snails as an intermediate host. For that we need to do research on the level of DNA polymorphism o.h.lindoensis snails. one method used is the technique of Random Amplified Polymerasechain Reaction (RAPD-?1R). Thereforeweneeda propermethod of

DNAextraction aswellasin determining the optimumreaction canditionsfor MpD-pcR. This study aimed to be obtained of o.h.lindoensis DNA _from in the highlands of central

sulawesi in Bada, Napu and Lindu and to optimize condition ofpcR-RApD. To be obtained o.h.lindaensis DNA using with protocols or operating procedures pureLink Genomic DNA

Mini Kits TM. The extraction of DNA yieled good qualitlt of DNA. while amplification of

DNA using PCR-MPD will become efficient and consistent if the amplification reactions are in ideal condition. In _{o.h.lindoensis, clear pcR-RApD patterns were obtained using} 70ng DNA template, 2 5 pmol primer and the number ofthermal cyclewas 40

x

Kata kunci :

Schistosomiasis,

DNA, O.h.lindoensis, RAPD-PCR

Di Indonesia schistosomiasis disebabkan oleh cacing Schistosoma japonicum dengan hospes perantara keong oncomelania hupensis lindoensis, untuk itu perlu dilakukan

penelitian tentang tingkat polimorfisme DNA keong Oncomelania hupensis lindoensis karena penelitian ini belum pernah dilakukan di Indonesia. salah satu metode yang digunakan adalah teknik Random Amplified polymerase chain Reaction (MpD-pcRJ-. oleh karena itu diperlukan metode yang tepat dalam ekstraksi DNA serta dalam menentukan kondisi optimum reaksi MPD-pCR.

Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan DNA o.h lindoensis yang berasal dari

daerah endemis schistosomiasrs di sulawesi rengah (Bada, Napu dan Lindu) serta

menentukan kondisi optimum untuk reaksi RApD-pcR untuk mendapatkan DNA digunakan metode ekstraksi DNA dari PureLink Genomic DNA Mini Kits IM. Ekstraksi DNA menghasilkan DNA dengan kualitas baik. sedangkan untuk amplifikasi DNA menggunakan teknik MPD-PCR diperoleh dengan kondisi komponen reaksi yang ideal. Pada sampel o.h.lindoensis, pola pita-pita DNA dengan teknik MpD-pcR yang jelas dapat diperoleh dengan menggunakan 10 ng DNA, 25 pmol MpD primer serta jumlah siklus termal 40x.

@ 2013 furnal Vektor Penyakit. All rights reseryed

Optimasi Teknik Isolasi DNA dan RAPD

-

PCR pada ... _[GunawanJ

PENDAHULUAN

Schistosomiasls di Indonesia pertama kali

ditemukan oleh Muller dan Tesch pada tahun

1935 yang

disebabkan

oleh

cacing

Schistosoma

japonicum

dengan

keong

perantara Oncomelania. Keong pertama kali

ditemukan di daerah persawahan Paku, danau Lindu pada tahun 1972 oleh Carney dkh. dan

diidentifikasi

sebagai A.h.lindoensrs'''. Keong

ini bersifat amfibious, dimana keong tersebut menyukai

tempat

yang

bece[

lembab dan beraif,, akan tetapi keong ini akan mati apabila terendam air'''''.

Dewasa

ini

perkembangan ilmu

pengetahuan sangat pesat,

diantaranya

adalah perkembangan ilmu biologi molekuler. Polymerase Chain Reaction _[PCR), merupakan suatu teknik yang dikembangkan oleh Kathy

Mullis tahun

1985 yang

efektif

untuk

perbanyakan DNA secara in vitroa. Teknik

ini

memungkinkan dihasilkannya

berjuta-juta

copy

dari

suatu fragmen DNA

tertentu.

Beberapa marka molekuleryang berbasis PCR

salah

satunya

adalah

Random Amplified

Polymorphic _{DNA IRAPD)} yang dikembangkan pertama

kali

oleh Williams et al. _[1990) dan banyak dimanfaatkan

untuk

menguji tingkat

polimorfisme DNAs.

Teknik RAPD-PCR menggunakan

primer

acak

atau arbitrary primer

yang

berantai

pendek

dengan

oligonukleida

yang

panjangnya hanya IA-LZ basa yang digunakan

mengamplifikasi fragmen DNA secara acak tanpa harus mengetahui terlebih dulu urutan

nukleotida

atau

DNA

target

yang

spesifik. Perbedaan

urutan

DNA

di

antara

individu-individu pada

daerah pengikatan primer

oligonukleotida

menyebabkan terjadinya

perbedaan-perbedaan

_{[polimorfisme)}

pada

pola

larik

yang dihasilkan

dari

proses

amplifikasi'.

Dasar

analisis

RAPD adalah

menggunakan

mesin

PCR

yang

mampu

mengamplifikasi sekuen DNA secara in vitro.

Penggunaan penanda RAPD relatif sederhana dan _{mudah dalam hal preparasi. Teknik} RAPD

memberikan

hasil

yang

lebih

cepat

dibandingkan dengan

teknik

molekuler

lainnya. Teknik ini juga mampu menghasilkan

jumlah karakter

yang

relatif tidak

terbatas sehingga sangat membantu

untuk

keperluan

analisis

keanekaragaman

organisme

yang

tidak diketahui latar belakang genomnya*. Metode RAPD PCR banyak dimanfaatkan

untuk

menguji

tingkat

polimorfisme

DNA. Sedangkan penelitian tentang variasi genetik keong O.h.lindoensls sebagai keong perantara schistosomiasis

di

Indonesia

belum

pernah

dilakukan

dengan menggunakan

metode

RAPD-PCR.

Tujuan

dari tulisan

ini

adalah

untuk

menentukan

optimasi

teknik

isolasi DNA terlebih dahulu dan untuk mendapatkan

hasil amplifikasi

MPD-PCR yang

jelas

dan baik.

BAHAN DAN METODE

EkstraksiDNA

Sampel

O.h.lindoensls

dikoleksi

dari

Dataran

Tinggi

Bada, Napu

dan

Lindu

(Sulawesi TengahJ pada

bulan

April

2011. Sampel keongyang dipakai adalah keongyang

telah

terbebas

dari

serkaria.

Sebelum

dilakukan isolasi DNA keong telah dipelihara

dalam skala laboratorium selama 90 hari.

Ekstraksi

DNA

dilakukan

dengan

menggunakan prosedur

kerja

dari

PureLink"

Genomic DNA

Mini

Klfs

dari

invitrogen yang

dimodifikasiu. Caranya

yaitu

sampel keong

sebanyak

50-60

mg

ditimbang

kemudian

dipotong kecil-kecil, kemudian dimasukkan

ke

dalam

mikrotube 2

ml

dan ditambahkan

180

pl

PureLink'M Genomic Digestion

Buffir

dan

20

pl

Proteinase

K.

Sampel kemudian

diinkubasi selama 1-4 jam pada suhu 55eC.

Apabila sampel belum lisis sempurna maka di

inkubasi

semalam

pada suhu

55

eC.

Selanjutnya

larutan tersebut

disentrifuse

dengan kecepatan maksimum selama 3 menit

pada

suhu

ruangan. Kemudian larutan

ditambah 20 pl Rnase A dan campur dengan

divortex.

Ditambahkan

200

pl

PurelinkTM

Genomic

Lysis/Binding Buffer dan

campur dengan di vortex. Kemudian larutan ditambah 200 pl 96-100 %o ethanol dan campur dengan

divortex.

Untuk

mencuci

DNA larutan

diambil kembali sebanyak

!

640 pl dan dipindahkan ke dalam PureLink" Spin Column. Setelah

itu

coloumn disentrifuse 10.000

rpm

selama 1

menit dan coloumn dibuang kemudian diganti dengan coloumn yangbaru. Larutan ditambah

furnal Vektor Penyakit, Vol. VII No. 1, 2013 :16 - 22

lagi dengan kecepatan 10.000

rpm

selama 1

menit dan coloumn dibuang kemudian diganti dengan coloumn yang baru. Larutan ditambah 500 pl Wash Buffer 2, kemudian disentrifuse

lagi

dengan kecepatan maksimum selama 3

menit dan coloumn dibuang kemudian diganti

dengan coloumn

yang

baru,

Larutan

ditambahkan

25-200

_1tl

PureLink"

Genomic Elution-

Buffer. Diinkubasi

selama

1

menit

dengan suhu

ruangan.

Setelah

itu

colournn

disentrifugasi

lagi

dengan

kecepatan

maksimum selama 1 menit. Sampel DNA hasil

isolasi

kemudian disimpan

pada suhu

4eC

untuk dilakukan penguj ian selanj utnyau.

Penentuan

Kuantifikasi

DNA

Kuantifikasi

DNA

dilakukan

dengan

menggunakan spektrofotometer.

Caranya

yaitu

spektrofotometer dihidupkan

dan sebelum digunakan dilakukan set reference dengan menggunakan 100 pl HPLC. Untuk set reference absorbansi,

ratio

dan konsentrasi

DNA

harus

bernilai

0,00

jika nilai

masing-masing parameter

lebih dari

0,00

set

reference diulang sampai sampel

HPLC tersebut bernilai 0,00

_[untuk

mempermudah

set

reference,

kuvet terlebih

dahulu

dibersihkan).

Kemudian

sampel

DNA sebanyak

2 pl

dan

98 pl

HPLC dimasukkan

kedalam

kuvet

lalu

dimasukkan

kedalam spektrofotometer. Nilai atau parameter yang

terbaca

oleh

spektrofotometer

adalah

konsentrasi DNA, rasio DNA, absorbansi dan

protein.

Pembacaan menggunakan panjang sinar 260 nm7.

RAPD-PCR

Analisis

RAPD-PCR

dilakukan

dengan menggunakan produk dari Ready-To-Go RA?D Analysis Kit GE Healthcare Limited, Amersham

Place

Little

Chalfont,

Buckinghamshire. Komponen

dari

kit ini

adalah

terdiri

dari Ready-To-Go RAPD

Analysis

Beads (buffea dATe dCTE dGTe dTTE BSA, AmpliTaq,, and Stoffel _fragmen),

kontrol

E. Coli

BLZ!

_[DE3J DNA"

kontrol

_{E. Coli [C1a)} DNA

dan

RApD

Primer

Set. Langkah pertama dihitung

kebutuhan bahan

kimia reaksi

yang

digunakan

pada reaksi

_{RAPD PCR. Jumlah}

bahan disesuaikan dengan jumlah sampel dan

primer

yang digunakan. Pada penelitian

ini

volume standar yang digunakan

untuk

satu reaksi adalah

25

ytl. Langkah selanjutnya

tB

buah mikrotube yang telah

berisi

AmpliTaq

TM

DNA

Polymerase

dan stoffel

fragmen disiapkan dan ditandai dengan nama

primer

serta

tanggal

dilakukan

PCR.

Larutan

DNA sebanyah

4

pl

dimasukkan

ke

dalam setiap

mikrotube tersebut, Urutan

sampel

yang

dimasukkan

pada

setiap sumur

diatur

berdasarkan

urutan

sampel. Setelah itu,

microtube divortex

agar

larutan

tercampur

lalu

disentrifugasi. Mikrotube

siap

dimasukkan kedalam termal cycler'.

Amplifikasi

DNA

dilakukan

dengan

menggunakan GeneAmp PCR system 9600

(Perkin Elmer). Reaksi PCR memerlukan tiga siklus. Program siklus termal adalah : aktivasi

awal

pada

95'C

selama

15

menit

diikuti

dengan

40

siklus yang

terdiri dari 1

menit

pada 94"C,

1 menit

pada

36'C

dan

2

menit

pada72'C. Selanjutnya

diikuti

dengan 1 siklus

pemanjangan

final

pada 72"C

selama

10 menit. Pada penelitian ini dilakukan optimasi

untuk mendapatkan pita-pita DNA yang jelas dengan konsentrasi DNA yang berbeda beda

yaitu 5 ng, 10 ng dan 25 ng. Sedangkan untuk

jumlah siklus termal nya juga

dilakukan

dengan modifikasi 3 5 x, 40 x, dan 45 x n.

HASIT

Untuk hasil

spektrofotometer

sampel

keong

dari tiga

lokasi dapat

dilihat

dalam Tabel 1.

Konsentrasi DNA keong O.h.lindoensis

ID

Absorbansi

Rasio

Konsentrasi Protein

A.3 0,022 1,95L

30,6

A4

0,010 4,076

29,3

A5

0,016 7,775

2a,4

Dari hasil

spektrofotometer didapatkan

konsentrasi DNA

untuk

sampel

keong

O,h,lindoensls

dari

dataran

tinggi

Napu

_[ffij

adalah 30,6 ng, dataran tinggi Bada (A4) 29,3 ng dan untuk dataran

tinggi

Lindu (A5) 28,4

ng.

Primer yang dipakai dalam penelitian

ini

adalah primer yang terdapat dalam

kit

RAPD

(dapat dilihat pada Tabel 2).

0,0 0,0 0,1

Optimasi Teknik Isolasi DNA dan RAPD

_-

PCR pada ... (Gunawan) RA RA RA RA RA _84

Tabel 2. Primer yang digunakan dan urutan basa primer

Nama

Primer

Urutan basa

[5'-3'l

Fengaruh perbedaan

konsentrasi

komponen dan perbedaan siklus termal pada PCR-RAPD O.h.lindoensfs dan kondisi optimal

untuk protokol

PCR-RAPD ditampilkan pada Gambar 1 sampai Gambar4.

Pada gambar 1 dapat

dilihat

bahwa pola

pola

RAPD

PCR

dengan

menggunakan konsentrasi DNA

5

ng

DNA,

25 pmol

RAPD

Primer serta jumlah siklus

termal 35

x memberikan gambaran band - band DNAyang teramplifikasi masih kurang j elas.

PD Primer 1 PD Primer 2 PD Primer 3 PD Primer 4 PD Primer 5 PD Primer 6

Is'-d [GGTGCGGGAAI -3',i [5',-d IGTTTCGCTCC] -3',J [s'-d IGTAGACCCGT] -3',) (5',-d [AAGAGCCCGT] -3',) [s'-d [AACGCGCAAC] -3',) [s'-dlcccGTCAGCAl 3',J 1400 600 500 400 300 200 100

Untuk kebutuhan bahan kimia reaksr yang

digunakan

pada reaksi

RAPD PCR jumlah bahan disesuaikan dengan jumlah sampel dan

primeryang _{digunakan [Tabel} 3).

Tabel 3. Komposisi untuk RAPD PCR

No

Nama Bahan 1 x Reaksi 25 pmol RAPD

Primer

5 pl 5-50 ng

DNA

6,6 pl Destilled Water

_IHrOJ

1-3,4 ptl

Total

Voh"rme

25 prl

Gambar l-. Pola -pola RAPD PCR menggunakan konsentrasi DNA S

,g

DNA,

25 pmol RAPD Primer serta jumiah _{siklus termal 35 x Primer 7,2, dan 3.}

C : Kontrol, M : Market

43

: 0.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Napu, 44 :

O.h.lindoensrs dari Dataran Tinggi Bada dan A5:O.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Lindu.

1,

)

Jurnal Vektor Penyakit, Vol. VII No. 1, 2013 :75 - 22

1400

600

500.

400

300

200

100

RAPD Primer serta jumlah siklus termal40 x dengan Primer 4, 5, dan 6. C : Kontrol, M : Marker; A3:0.h.lindoensls dari Dataran Tinggi Napu, A4: O.h.Iindoensis

dari Dataran Tinggi Bada dan A5: O.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Lindu. Sedangkan pada gambar

2

dapat

dilihat

40xmemberikan gambaran band

-band

DNA

bahwa

pola pola

RAPD PCR

dengan

yang

teramplifikasi

masih kurang

jelas

dan menggunakan konsentrasi DNA 5 ng DNA"

25

terlihatbandbandDNAmasihbertumpuk.

pmol RAPD Primer serta jumlah siklus termal

1400

Gambar 3. Pola pola RAPD PCR menggunakan konsentrasi DNA 10 ng DNA, 25 pmol RAPD Primer serta jumlah siklus termal 35 x Primer

\,2,

dan 3. c : Kontrol, M : Marker, A3: O.h.lindoensis _{dari Dataran Tinggi Napu, A4:} O.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Bada

dan A5 : O.h.lindoensrs dari Dataran Tinggi Lindu.

600

500

400

300

200

100

Optimasi Teknik Isolasi DNA dan RAPD

-

PCR pada ..,....,.... (GunawanJ

Pada gambar 3 dapat dilihat bahwa pola

pola

RAPD

PCR

dengan

menggunakan

konsentrasi DNA 10 ng DNA, 25 pmol RAPD

Primer serta jumlah siklus termal

35

x

rneml:erikan gambaran band - band DNAyang

teramplifikasi masih kurang jelas

dan

band -band DNA belum optimum teramplifikasi.

600 500 400 300

Gambar 4. Pola pola RAPD PCR menggunakan konsentrasi DNA 10 ng DNA, 25 pmol RAPD Primer serta jumlah siklus termai 40 x Prirner 4, 5 dan 6. C : Kontrol, M : Marker;

A3 : A.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Napu, 44 : O.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Bada dan A5 : O.h.lindoensis dari Dataran Tinggi Lindu.

Untuk gambar 4 dapat dilihat bahwa pola

pola

RAPD

PCR

dengan

menggunakan

konsentrasi DNA 10 ng DNA, 25 pmol RAPD

Primer serta jumlah siklus termal

40

x memberikan gambaran band _- band DNAyang teramplifikasi terlihat j _elas.

PEMBAHASAN

Dalam penelitian

ini

sampel keong O. h.

lindoensis

yang digunakan berasal dari tiga

daerah endemis schistosomiasls

di

Sulawesi Tengah yaitu dari Dataran Tinggi Napu, Bada dan _{Lindu [Sulawesi} Tengah).

Pada penelitian

ini

didapatkan pola pita-pita hasil RAPD yang sangat dipengaruhi oleh

komponen

PCR

meliputi

konsentrasi

DNA

cetakan,

primer serta

dipengaruhi

oleh jumlah siklus termal. Tingkat sensitifitas hasil PCR-RAPD

bervariasi terhadap

perubahan yang diakibatkan perbedaan konsentrasi tiap

komponen.

Untuk isolasi

DNA

Keong

O.h.lindoensis

dilakukan

sesuai

dengan

protokol atau

prosedur

kerja

PurelinkTM

Genomic DNA

Mini

Kits. Sampel DNA hasil

isolasi

kemudian

disimpan pada suhu

4eC

untuk dilakukan pengujian selanjutnya. Pada penelitian

ini

konsentrasi DNA yang dipakai adalah 5 ng dan 10 ng. Pada konsentrasi DNA rendah _{[5 ng]} terdapat band DNA yang tidak

teramplifikasi, Hal

ini

kemungkinan

disebabkan kualitas DNA yang kurang baik.

DNA

yang

pemurniannya

_tidak

sempurna

kemungkinan

masih

mengandung

poiisakarida,

senyawa

fenolik

atau

kontaminan

lainnya.

Sedangkan

pada konsentrasi DNA

10

ng terdapat

band

DNA

yang teramplifikasi dapat

terlihat

jelas. Beberapa penelitian lain konsentrasi DNA 10

ng

menunjukkan

hasil

pola-pola DNA yang

dihasilkan

relaiif

konstan. Contohnya pada

penelitian yang diiakukan

oleh

Vernon Jennifer G.,

dkk

_[1995)

dengan konsentrasi DNA 10 ng menunjukkan pola pola DNA yang jelas pada Biamphalaria Glabrata (Pulmonata

: Basommatophora).

furnal Vektor PenyakiL Vol. VII No. 1, 2013 :1.6 - 22

mempengaruhi

produk

RAPD adalah siklus

termal yang

digunakan

pada proses

PCR.

|umlah siklus

dapat

mengubah

band

DNA

produk RAPD. Pada penelitian

ini

reaksi PCR

dilakukan

tiga

siklus.

Sedangkan

pada

penelitian

ini

untuk jumlah siklus termal nya juga dilakukan dengan modifikasi 35 x, 40 x,

dan

45 x.

Hal

ini

dilakukan dengan tujuan untuk mencari optimasi jumlah siklus termal

yang dapat

memberikan gambaran

band

produk

RAPD PCR

dengan

jelas.

Pada

penelitian

ini

jumlah

_{siklus termalnya} yang

terpilih

adalah 40 x hal

ini

dilakukan karena tergantung pada primer yang digunakan dan

dipilih

sebagai

jumlah

siklus

optimal

untuk

meminimalkan amplifikasi produk RAPD yang

tidak

spesifik. Dengan menggunakan kondisi PCR 10 ng DNA,25 pmol prime4 serta jumlah

siklus termal

40

x

diperoleh

amplifikasi

fragmen DNA yang optimum dan konsisten.

Menurut penelitian yang dilakukan oleh Osama _{dan Vernon Jennifer G}

untuk

proses RAPD PCR jumlah siklus termal yang optimal

adalah 45 x, hal ini dapat diperoleh amplifikasi

DNA yang

jelas dan

_{konsisten. Jadi} jumlah

siklus termal dalam reaksi RAPD PCR sangat mempengaruhi hasil produk RAPD PCR.

KESIMPULIIN

Pada sampel O.h.lindoensis

kondisi

optimum

untuk

RAPD

PCR adalah

menggunakan konsentrasi DNA

10

trg, konsentrasi primer 25 pmol dan jumlah siklus

termal

40x. Kondisi

ini

menghasilkan band dengan intensitas yang

baik

serta pola-pola band RAPD yang konsisten.

SARAN

Perlu

modifikasi

jumlah siklus

termal

agar waktu dapat dipersingkat

dan

konsentrasi DNA agar gambaran band DNA

terlihatjelas.

UCAPAN TERIMAKASIH

Penulis

berterimakasih kepada

Kepala

Balai Litbang

PZBZ Donggala Bapak _fastal,

SKM, M.Si,

kepada

Kepala Dinas Kesehatan

Kabupaten Poso

dan

kepada Kepala Dinas Kesehatan Kabupaten Sigi serta kepada ibu

Dewi Kartikawati

Paramita, S.Si, M.Si, Ph.D

dari

Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

atas saran-saran dalam ekstraksi DNA dan

RAPD-PCR,

DAFTARPUSTAKA

1.

Sudomo, M. Penyakit Pqrasitik yang Kurang Diperhatikan. Orasi Pengukuhan Profesor

Riset Bidang Entomologi dan Moluska. Badan Litbang Kesehatan. f akarta

2.

Sudomo, M.2000.Sclrrstosomiasis control in Indonesia. Majalah Parasitologi Indonesia 13(1-2):1-10.

3.

)an

A.

Rozendaal.1997. Vector Cantrol :

Methods

_for

use

by

individuals

and communities.

World

Health Organization. Geneva, pp33B _- 356.

4.

Barlet, _J, M, S and Stirling D.1993. Methods in

Molecular Biology, vol. 226

|

PCR Protocols,

Second Editian. Humana Press Inc., Totowa, Nf.

5.

Campbell, N.A. 1996. Biology, Fourth Edition, NewYork: Benjamin Cummings, pp 600 - 601

h t t p: / / s c i e n c

e northern.ed u _{/biology / genbio/images/trema}

toda.html _[4 November 2 004]

6.

Anonim. 2007. User Manual

:

PureLink'* Genomic DNA

Mini

Kits

_for

Purification Of

Genomic DNA. Invitrogen, pp 8-9.

7.

Mostafa,

O.M.S.,

and

Shadia

M.

El-Daf

rawy.201.7.

Susp

ectibilty

of

Biomphalariaspp. To

infection

with

Schistosoma mansoni

in

sympatric

qnd allopatric combinations with observqtions on

the

generic

variability

_{between snails. l.}

Veterinary Parasitology.l 80. pp 226-231.

8.

Vernon, I G., _Jones Catherine S. and Noble R.

Leslie.1995. Random Amplified Polymorphic

DNA

(RAPD)

Markers Reveal

Cross-Fertilisation

In

Biomphalaria

Glabrata (Pulmonata: Basommatophora). _{l. Moll.} Stud.