ANALISIS BAKTERI COLIFORM DALAMPRODUK ES BATU
KEMASAN DARI 5 USAHA MIKRO DENGAN METODE MOST
PROBABLE NUMBER (MPN) DI KECAMATAN DANUREJAN, YOGYAKARTA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh : Adityawarman NIM : 088114041
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
i
ANALISIS BAKTERI COLIFORM DALAMPRODUK ES BATU
KEMASAN DARI 5 USAHA MIKRO DENGAN METODE MOST
PROBABLE NUMBER (MPN) DI KECAMATAN DANUREJAN, YOGYAKARTA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Farmasi
Oleh : Adityawarman NIM : 088114041
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
ii
PERSETUJUAN PEMBIMBING
ANALISIS BAKTERI COLIFORM DALAMPRODUK ES BATU
KEMASAN DARI 5 USAHA MIKRO DENGAN METODE MOST
PROBABLE NUMBER (MPN) DI KECAMATAN DANUREJAN, YOGYAKARTA
Skripsi yang diajukan oleh : Adityawarman NIM : 088114041
telah disetujui oleh :
Pembimbing
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
Ku yakini dan ku lakukan…….
Semua kehidupan, dinamika kehidupan, dan seluruh isi alam semesta telah
Tuhan karuniakan kepadaku…
Setiap detak jantungku, setiap tarikan nafasku, dan setiap kilatan
pikiranku, semua adalah kehendaknya… Betapa besarnya KaruniaMu..
Maa
fkanlah hamba yang masih “buta”akan hal itu….
Skripsi ini pun adalah kehendak Nya….
Kesempurnaan hanya milik Dia..
“Janganlah berbuat jahat, Tambahlah kebajikan, Dan sucikanlah pikiran,
Ini adalah inti ajaran para Buddha” sadhu…sadhu…sadhu….
Semoga semua makhluk berbahagia……
Annumodana untuk :
Terimakasih Yang Maha Kuasa atas segalanya….
Terimakasih Bapak, Ibu dan keluargaku…..
vi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkah dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan sebaik-baiknya untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) pada Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Dalam proses penyusunan skripsi ini penulis telah banyak memperoleh berbagai bantuan berupa doa, bimbingan, materi, dorongan semangat, ujian, dan segala hal yang membawa pada terselesaikannya karya tulis ini.
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terimakasih kepada :
1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc.,Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
2. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si selaku Dosen Pembimbing atas kebijaksanaan, perhatian, dan kesabarannya dalam membimbing penyusunan skripsi ini.
3. Bapak Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. dan Ibu Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. selaku Dosen Penguji yang telah meluangkan waktu, kritik, saran dan pemikiran keilmuannya untuk menguji penulis dalam ujian skripsi.
vii
5. Ibu CM. Ratna Rini Nastiti, M.Pharm., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi sekaligus Ketua Tim Panitia Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
6. Ibu Septi Widyastuti, S.Si., M.Kes , Ibu Retno, Ibu Evina, Ibu Darwani, Ibu Siti, Bapak Jumakir, Bapak Andi, Bapak Sigit dan segenap anggota Balai Laborarorium Kesehatan Yogyakarta. yang telah membimbing penulis dalam penelitian laboratorium .
7. Teman-teman Bojoner’s dan FKK A 2008 (Christina Putranti R.W, Perthy Melati K, Primaboti N, Eureka Gracia L, Wiria Sende P, Kartika Sari S, dan Ellen Naomi N.S) yang senantiasa setia dalam mendampingi seluruh kegiatan penulisan skripsi ini.
8. Seluruh Civitas Akademika Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang selalu memberikan kondisi yang mendukung untuk pengerjaan skripsi ini.
9. Seluruh pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah mendukung penulisan skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan demi sempurnanya skripsi ini. Semoga skripsi ini bermanfaat dan memberi informasi bagi pembaca.
ix
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ……… i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ……….. ii
HALAMAN PENGESAHAN ……….. iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ………... iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ………... v
PRAKATA ………... vi
HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ... viii
DAFTAR ISI ……… ix
DAFTAR TABEL ……… xiii
DAFTAR GAMBAR ……… xiv
DAFTAR LAMPIRAN ……… xv
INTISARI ………. xvi
ABSTRACT ………... xvii
BAB I PENGANTAR ………... 1
A. Latar Belakang ………..………. 1
1. Permasalahan ……….…...… 4
2. Keaslian penelitian ……… 5
3. Manfaat penelitian ………...…. 5
B. Tujuan Penelitian ………..……….. 6
x
A. Es Batu dan Baku Mutu Air Minum ………..… 7
B. Bakteri Coliform ……… 10
C. Escherichia coli Sebagai Indikator Pencemaran Air ………. 11
D. Media Selektif dan Media Diferensial E.coli ……… 12
E. Uji Identifikasi E.coli ………. 14
F. Uji Angka Bakteri Coliform (E.coli) Menggunakan Metode Most Probable Number (MPN) ………... 18
G. Landasan Teori ………... 20
H. Hipotesis ……….... 22
BAB III METODE PENELITIAN ... 23
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ………. 23
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ……… 23
C. Bahan dan Alat Penelitian ……….. 26
D. Tata Cara Penelitian ………... 27
1. Pengumpulan sampel ……….. 27
2. Homogenisasi dan pengenceran sampel ……….…… 27
3. Pembuatan media ………... 28
4. Uji Bakteri Coliform (IKM/5.4.2/2009/BLK-Y) ………... 30
a. Uji pendugaan bakteri Coliform (Presumptive test) ……..….. 30
b. Uji penegasan bakteri Coliform (Confirmative test) …….….. 30
c. Uji konfirmasi Coliform fekal dan Escherichia coli ... 31
d. Uji identifikasi Eschericia coli ... 31
xi
BAB IV HASILDAN PEMBAHASAN ………. 33
A. Pengumpulan Sampel ……….……… 34
B. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel ………….…………...… 34
C. Uji Bakteri Coliform (IKM/5.4.2/2009/BLK-Y) ….………... 36
1. Uji pendugaan bakteri Coliform (Presumptive test) …….…….. 38
2. Uji penegasan bakteri Coliform (Confirmative test) …..………. 44
3. Uji konfirmasi Coliform fekal dan Escherichia coli ... 48
4. Uji identifikasi Eschericia coli ……….…….. 52
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ……….. 72
A. Kesimpulan ………...….. 72
B. Saran ………....….. 72
DAFTAR PUSTAKA ………. 73
LAMPIRAN ……… 77
xii
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel I. Parameter Mikrobiologi Bahan Baku Air Untuk
Keperluan Minum Berdasarkan PerMenKes RI No.
416/MenKes/Per/IX/1990 ……….…….…… 8 Tabel II. Sifat-sifat Bakteri Coliform dengan Uji Biokimia
(American Public Health Association, 2005) ………...… 18 Tabel III. Hasil Uji Pendugaan Coliform dengan Media Lactose
Triphtose Broth pada suhu 36o C±1oC waktu inkubasi 48
jam …... 39 Tabel IV. Hasil Uji Penegasan dan Angka MPN Bakteri Coliform
dengan Media BGLB waktu inkubasi 24 jam pada suhu
36o C±1oC ………... 45 Tabel V. Hasil Uji Konfirmasi dan Angka MPN Bakteri Coliform
Fekal dengan Media ECB waktu inkubasi 48 jam pada
suhu 44-45oC ……….. 49
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Uji pendugaan pada media LTB sampel I inkubasi
48 jam pada suhu 360 C±10C ……...……… 41 Gambar 2. Uji pendugaan pada media LTB sampel II inkubasi
48 jam pada suhu 360 C±10C ………... 41 Gambar 3. Uji pendugaan pada media LTB sampel III inkubasi
48 jam pada suhu 360 C±10C ………..…… 42 Gambar 4. Uji pendugaan pada media LTB sampel IV
inkubasi 48 jam pada suhu 360 C±10C ……… 42 Gambar 5. Uji pendugaan pada media LTB sampel V inkubasi
48 jam pada suhu 360 C±10C ………... 43 Gambar 6. Hasil uji konfirmasi bakteri Coliform sampel I
konsentrasi 10-1 dengan media BGLB inkubasi 24
jam pada suhu 360 C±10 C ………... 46 Gambar 7. Hasil uji konfirmasi Coliform fekal dengan media
ECB inkubasi 48 jam pada suhu 44-450C ………… 51 Gambar 8. Hasil penanaman sampel es batu I dan II pada
media Mac Conkey Agar inkubasi 48 jam pada
suhu 44-450C ………... 53
Gambar 9. Hasil pengujian H2S sampel es batu I pada uji
xiv
Gambar 10. Hasil pengujian H2S sampel es batu II pada uji
identifikasi E.coli ……… 58
Gambar 11. Reaksi pembentukan Indol oleh bakteri E.coli (Lay,
1994) ……… 60
Gambar 12. Hasil pengujian Indol pada uji identifikasi E.coli
pada sampel es batu I ……….. 60 Gambar 13. Hasil pengujian Indol pada uji identifikasi E.coli
pada sampel es batu II ………. 61 Gambar 14. Hasil pengujian motilitas sampel I pada uji
identifikasi E.coli ……… 62
Gambar 15. Hasil pengujian motilitas sampel II pada uji
identifikasi E.coli ……… 62
Gambar 16. Hasil uji fermentasi larutan gula-gula pada sampel
I, kontrol positif, dan kontrol negatif ……….. 64 Gambar 17. Hasil uji fermentasi larutan gula-gula pada sampel
II, kontrol positif, dan kontrol negatif ………. 65 Gambar 18. Reaksi pembentukan sitrat oleh bakteri E.coli
(Cohen, 2011) ……….. 66
Gambar 19. Hasil uji sitrat pada sampel I, kontrol positif, dan
kontrol negatif ………. 66
Gambar 20. Hasil uji sitrat pada sampel II, kontrol positif, dan
xv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Tabel Most Probable Number (MPN) Deret 3 Tabung (Standar Nasional Indonesia No.01-3839-1995) …………. 77 Lampiran 2. Baku Mutu Es Batu Berdasarkan Standar Nasional
Indonesia 01-3839-1995 ……….. 78 Lampiran 3. Hasil Uji Konfirmasi Coliform dengan media Brilliant
Green Lactose Bile Broth 2% Es Batu Sampel II dan III
Inkubasi 48 Jam Pada Suhu 36o±1oC ……… 81 Lampiran 4. Hasil Uji Most Probable Number dan Identifikasi
Eschericia coli pada Sampel Es Batu Kemasan di
Kecamatan Danurejan Yogyakarta ……….. 82 Lampiran 5. Surat ijin melakukan penelitian di Balai Laboratorium
xvi
INTISARI
Es batu merupakan air yang dibekukan dan sering digunakan dalam berbagai produk minuman. Banyaknya produsen es batu, contohnya di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta seringkali tidak diiringi dengan kesadaran terhadap kualitasnya, seperti tingginya kandungan bakteri Coliform dan Eschericia coli sebagai indikator polusi kotoran dalam produk tersebut. Coliform merupakan bakteri fakultatif yang memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 37oC yang menyebabkan infeksi saluran kemih, gastroenteritis, meningitis, dan peritonitis. Infeksi tersebut terjadi karena es batu berbahan dasar air yang terkontaminasi oleh feses dan pengolahan yang tidak tepat.
Menurut Standar Nasional Indonesia No.01-3839-1995, es batu harus memenuhi syarat-syarat air minum sesuai PerMenKes RI No. 416/MenKes/Per/IX/1990 yaitu syarat mutu secara mikrobiologi total Coliform tidak melebihi 0 bakteri/100ml dan Coliform fekal tidak melebihi 0 bakteri/100ml.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jumlah bakteri Coliform dan Coliform fekal, temasuk E.coli, pada es batu dari lima usaha mikro es batu di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta sebagai daerah penghasil es batu terbesar di Yogyakarta. Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif komparatif. Sampel uji berupa es batu yang dicairkan. Data penelitian dibandingkan dengan daftar Most Probable Number (Standar Nasional Indonesia, 1992) dan dihitung jumlah bakterinya. Pengujian dilakukan dengan menggunakan media selektif dan diferensial sebagai uji presumtif dan konfirmatif untuk bakteri Coliform dan E.coli yang diperkuat dengan uji Sulfur Indol Motility, uji fermentasi gula-gula dan uji sitrat sebagai tahap penegasan untuk memastikan adanya bakteri E. coli.
Hasil penelitian menunjukkan jumlah bakteri Coliform, Coliform fekal, dan E.coli pada sampel es batu I, II, dan III dari 5 sampel es batu di Kecamatan Danurejan Yogyakarta melebihi 0 bakteri/100ml sehingga secara mikrobiologis tidak memenuhi Standar Nasional Indonesia No.01-3839-1995 yang diacu dari PerMenKes RI No. 416/MenKes/Per/IX/1990.
xvii
ABSTRACT
Ice cube is a frozen water that used in many drinking product. Some producers in Danurejan, Yogyakarta don’t understand about the handling method to make it, such as contamination of Coliform and Eschericia coli bacteria. This bacteria used ice cube fecal indicator. Coliform is a facultative bacteria which can produce some acid and gas of lactose fermentation at 37oC during 48 hours incubation. It causes infection, gastroenteritis, meningitis, and peritonitis. In human it is caused by water material contamination of fecal materials and uncorrect handling methods.
According Standar Nasional Indonesia No.01-3839-1995, ice cube must be complied with microbiology standard quality of drinking water by PerMenKes RI No. 416/Men.Kes/Per/IX/1990 that 0 bacteria / 100 ml sampel of Coliform and fecal Coliform.
This research was purposed to count Coliform and fecal Coliform, including E.coli bacteria in five ice cube samples of micro producers in Danurejan, Yogyakarta which be the biggest producer’s region of ice cube in Yogyakarta. This were a descriptive comparative research. The samples were melted ice cubes. Research data should be compared to Most Probable Number table (Badan Standar Nasional, 1992) to count the bacteria. This test used selective and differential media for presumptive and confirmative test to know Coliform and fecal Coliform then supported by Sulfur Indol Motility (SIM), sugar fermentation and citrate test to confirm E.coli contamination.
The result showed that total Coliform, Coliform fecal, and E.coli bacteria on sampel I, II, III of 5 ice cube samples from Danurejan region Yogyakarta more than 0 bacteria/ 100ml so this samples didn’t comply with ice cube microbiological quality of Standar Nasional Indonesia No.01-3839-1995 on the basic of PerMenKes RI No. 416/Men.Kes/Per/IX/1990.
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Es batu adalah massa padat hasil pembekuan air minum yang merupakan bahan yang biasanya ditambahkan dalam minuman yang sering kita konsumsi setiap hari. Penggunaan es dalam minuman merupakan hal yang sangat umum ditemui. Beberapa jenis minuman penggunaan es tidak dapat digantikan dengan menyimpan minuman tersebut dalam lemari pendingin (Primasentra, 2010).
Proses pembuatan dan pendistribusian es batu yang tidak sehat, seperti halnya produsen yang menjual es batu berbahan air mentah tanpa dimasak atau tidak diolah dengan tepat menyebabkan terjadinya pertumbuhan bakteri yang dapat mengganggu kesehatan konsumen (Primasentra, 2010). Menurut Suriawiria (1995), air yang digunakan sebagai bahan es batu harus bebas dari mikrobia penyebab penyakit atau mikrobia patogen. Kehadiran bakteri Coliform sangat tidak diharapkan, baik dari segi estetika, sanitasi, maupun kesehatan.
Coliform merupakan bakteri heterogen dari famili Enterobacteriaceae
pertumbuhan bakteri Coliform sebesar 8x10 koloni/g dan pertumbuhan terus meningkat sampai hari ke-10 sebesar 2x108 koloni/g (Arrannilewa, Salawu, Sorungbe, dan Olasalawu, 2005).
Bakteri Coliform dapat dibedakan menjadi 2 tipe yaitu Coliform fekal, misalnya Escherichia coli, dan Coliform nonfekal, misalnya Enterobacter aerogenes. E. coli merupakan bakteri yang berasal dari kotoran hewan atau manusia, sedangkan E. aerogenes biasanya ditemukan pada hewan atau tanaman yang telah mati. Bakteri Coliform tersebut dapat menyebabkan gangguan kesehatan pada manusia (Fardiaz, 1993). Menurut Brooker (2008), beberapa kelompok bakteri Coliform bersifat patogen pada manusia, menyebabkan infeksi saluran kemih, gastroenteritis, meningitis, peritonitis, dan infeksi luka. Infeksi ini terjadi karena air yang terkontaminasi oleh feses dan produk lain yang berkaitan dengan produk berbahan air yang menjadi sumber kontaminasi feses.
fekal, total Coliform ; secara radioaktivitas meliputi aktivitas sinar alfa dan beta. Persyaratan mutu air minum secara mikrobiologis adalah total Coliform tidak melebihi 0 bakteri/100ml dan Coliform fekal tidak melebihi 0 bakteri/100ml. Jika jumlah bakteri Coliform dan Coliform fekal lebih dari standar yang ditetapkan, maka es batu tersebut tidak memiliki jaminan kualitas mikrobiologis dan keamanan untuk dikonsumsi yang dapat menimbulkan masalah kesehatan.
Berbagai standar, baku mutu dan undang-undang yang mengatur tentang kualitas air untuk konsumsi masyarakat ditujukan untuk melindungi masyarakat dari kemungkinan terinfeksi, terkontaminasi bakteri dan bahan-bahan berbahaya yang terkandung di dalam air. Hal ini disebabkan banyaknya bakteri dan kontaminasi lain yang dapat mengakibatkan infeksi serius pada manusia dan hewan, bahkan menyebabkan kematian. Salah satu usaha untuk mencegah kondisi tersebut adalah dengan melakukan uji mutu es batu secara mikrobiologis (Slamet, 1994).
Metode yang umum digunakan untuk menghitung bakteri total Coliform dan Coliform fekal dalam sampel air adalah dengan perhitungan Most Probable Number (MPN). Metode ini bertujuan untuk menghitung jumlah mikroba yang hidup saja dan dilakukan juga pengenceran berulang. Hasil uji MPN dapat digunakan untuk menentukan kemungkinan besar jumlah mikroba yang terdapat dalam suspensi sampel air dengan kepercayaan 95%.
dibandingkan dengan daftar Most Probable Number dan dihitung jumlah bakterinya. Jumlah bakteri yang diperoleh merupakan nilai pendekatan yang tidak menyatakan jumlah bakteri yang sebenarnya (Nuria, Rosyid, dan Sumantri 2009). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui total Coliform dan Coliform fekal yang terdapat di dalam es batu kemasan produksi industri mikro yang diproduksi di Kecamatan Danurejan. Penelitian ini dilakukan di Kecamatan Danurejan yang merupakan salah satu daerah binaan Dinas Perindustrian Perdagangan Koperasi dan Pertanian Kota Yogyakarta yang didominasi oleh usaha kecil dan mikro, termasuk produksi es batu. Produsen es batu skala usaha mikro perlu memperoleh edukasi tentang kualitas es batu yang sering digunakan untuk minuman terutama dari segi mikrobiologis untuk melindungi masyarakat dari resiko terinfeksi dan terkontaminasi oleh bakteri patogen, terutama bakteri Coliform.
1. Permasalahan
a. Berapa kandungan bakteri total Coliform dan Coliform fekal berdasarkan metode Most Probable Number (MPN) pada es batu kemasan dari lima usaha mikro es batu di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta?
2. Keaslian penelitian
Penelitian tentang cemaran bakteri Coliform pada es batu dari lima usaha mikro es batu kemasan di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta belum pernah dilakukan sebelumnya.
Beberapa penelitian yang mirip dengan penelitian ini, di antaranya : Analisa Kualitatif Bakteri Coliform pada Depo Air minum Isi Ulang di Kota Singaraja Bali (Widiyanti dan Ristiati, 2004), Total Coliform dan Identifikasi Jenis Bakteri Laktosa Fermenter Cepat pada Es Batu Balok yang dijual di jalan Wonodri Baru Semarang (Prastiwi, 2006), Analisa Kandungan Bakteri Coliform pada 5 Sumber Air yang Berada di Desa Jabung, Kecamatan
Gantiwarno, Klaten (Eliandra, 2008). Dari beberapa penelitian tersebut diperoleh hasil yang menunjukkan adanya kandungan bakteri Coliform dalam setiap sampelnya. Perbedaan penelitian tersebut dengan penelitian ini terletak pada lokasi sampling, dan jenis sampel yang digunakan.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis
b. Manfaat praktis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan pada masyarakat tentang keamanan dan kualitas es batu yang sehat dan layak dikonsumsi dari segi mikrobiologis berdasarkan persyaratan Standar Nasional Indonesia (SNI) 01-3839-1995 dan PerMenKes RI No. 416/MenKes/Per/IX/1990.
B. Tujuan Penelitian
1. Tujuan umum
Mengetahui kandungan bakteri total Coliform dan Coliform fekal berdasarkan metode Most Probable Number (MPN) pada es batu kemasan dari lima usaha mikro es batu di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta, sehingga diharapkan dapat digunakan konsumen sebagai jaminan kualitas dan keamanan produk es batu dari segi mikrobiologis.
2. Tujuan khusus
Mengetahui sesuai tidaknya kandungan bakteri total Coliform dan Coliform fekal pada es batu kemasan yang diproduksi oleh lima usaha mikro es
7
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Es Batu dan Baku Mutu Air Minum
Es adalah air yang membeku atau dibekukan untuk berbagai keperluan. Pembekuan ini terjadi bila air didinginkan di bawah 0oC (273.15 oK, 32oF) pada tekanan atmosfer standar. Es batu dapat terbentuk pada suhu yang lebih tinggi dengan tekanan yang lebih tinggi juga, dan air akan tetap sebagai cairan atau gas sampai -30 oC pada tekanan yang lebih rendah (DepKes RI, 1995).
Proses pembuatan es batu memerlukan tindakan higienis sanitasi yang merupakan bagian dari kesehatan lingkungan. Kualitas tindakan higienis sanitasi menjadi titik kritis keamanan produk tersebut dalam hal kesehatan, terutama segi mikrobiologis. Tindakan higienis sanitasi dapat digunakan sebagai jaminan keamanan dan kualitas produk es batu (DepKes RI, 2004).
Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam rangka menjaga kualitas es batu untuk dikonsumsi sebagai bahan tambahan dalam minuman dari pihak produsen hendaknya memperhatikan mutu air yang digunakan sebagai bahan baku pembuatan es, serta perlu mengadakan perbaikan terhadap penerapan sanitasi dan higienitas dalam penanganan es batu dari pihak distributor dan pedagang minuman. Distributor harus menggunakan kemasan yang sesuai untuk es batu dalam proses distribusinya, baik dari segi keamanan maupun dari segi ekonomis, serta mengirimkan es batu sesuai kebutuhan konsumen, misalnya hanya memberikan es batu balok untuk digunakan sebagai bahan pengawet ikan, buah, atau untuk mendinginkan produk minuman dalam kemasan sehingga es balok tidak tercampur dalam produk minuman, dan dari pihak konsumen harus memastikan asal es yang akan dikonsumsi. Sistem pengolahan, pendistribusian, dan penyimpanan es batu yang baik dan terjaga dapat menjadikan es tersebut aman dikonsumsi (DepKes RI, 2004).
Proses standar yang digunakan dalam pembuatan es batu untuk tambahan dalam minuman adalah dengan perebusan bahan baku air pada suhu 100oC dengan proses pengolahan, penyimpanan, dan distribusi secara higienis (DepKes RI, 1995). Berdasarkan hasil survey yang dilakukan peneliti kepada 15 produsen dengan metode wawancara pada bulan Januari tahun 2012, diperoleh informasi bahwa para produsen mikro es batu kemasan di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta tidak mengetahui proses standar pembuatan es batu sebagai tambahan dalam minuman. Para produsen tersebut tidak mengetahui faktor-faktor yang perlu diperhatikan dalam pembuatan es batu kemasan sebagai tambahan dalam minuman sesuai dengan Standar Nasional Indonesia (SNI) tentang kualitas es batu untuk tambahan dalam minuman. Para produsen tersebut hanya mengetahui bahwa pembuatan es batu untuk konsumsi dikategorikan baik jika bahan airnya sudah direbus hingga mendidih, sedangkan proses lainnya tidak diketahui.
B. Bakteri Coliform
Bakteri Coliform adalah mikroba aerob dan fakultatif anaerob yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang. Bakteri Coliform tidak membentuk spora dan dapat memfermentasi laktosa. Bakteri Coliform dapat membentuk asam pada suhu 35-37oC selama 48 jam (Chandra, 2007).
Kelompok bakteri Coliform memiliki beberapa karakter khusus, yaitu bakteri Coliform mampu menguraikan asam amino menjadi indol tetapi tidak menghasilkan residu sulfur, yang dideteksi melalui penambahan reagen Kovacs dan memiliki motilitas pada media atau habitat alaminya karena adanya flagel. Bakteri Coliform juga mampu menguraikan beberapa jenis gula dalam proses fermentasinya (glukosa, laktosa, manitol, maltosa, dan sukrosa) menjadi asam laktat, asam cuka, CO2 dan asam tertentu lainnya tergantung dari spesies bakterinya. Sumber karbon yang digunakan bakteri Coliform sebagai sumber energi adalah asetat. Karakteristik bakteri Coliform ini digunakan sebagai dasar pada tahap identifikasi bakteri Coliform, khususnya bakteri E.coli (Holt, Krieg, Sneath, Stanley, dan Williams, 2000).
Mikroba aerob yang termasuk gram negatif ini dapat menggunakan oksigen sebagai penerima elektron terminal. Bakteri ini mampu tumbuh dalam keadaan rendah oksigen (21% oksigen), kecuali bakteri mikrofilik. Beberapa di antaranya dapat menyediakan molekul nitrogen. Beberapa genus yang termasuk dalam kelompok bakteri ini adalah : Acetobacter, Aquaspirillum, Pseudomonas, Rhizobacter, Rhizobium, dan Rhizomonas, sedangkan pada mikroba fakultatif
µm. Bakteri Coliform umumnya berbentuk batang lurus, kecuali Vibrio yang berbentuk berliku-liku atau sel vibrioid, dapat ditemukan di lingkungan sekitar atau pada hewan atau tanaman sebagai inangnya. Kebanyakan dari spesies ini bersifat patogen pada manusia dan hewan. Kelompok ini terdiri dari empat famili, yaitu Enterobacteriaceae (contoh : Citrobacter, Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Shigella, dan Yersinia), Vibrionaceae (contoh :
Earomonas, Photobacterium, Plesiomonas, Vibrio), Pasteurellaceae (contoh:
Actinobacillus, Haemophilus, Pasteurella) dan famili lain (contoh :
Cardiobacterium, Chromobacterium, Einekella, Streptobacillus) (Bonang dan
Koeswardono, 1982).
Coliform fekal adalah anggota dari total Coliform yang mampu memfermentasikan laktosa pada suhu 44,5oC. Sekitar 97% dari total kandungan bakteri Coliform fekal terdiri atas Escherichia dan beberapa spesies Klebsiella. Bakteri Coliform fekal ini juga banyak ditemukan dalam fekal hewan, sehingga untuk mengetahui adanya pencemaran fekal hewan lebih sesuai digunakan bakteri Coliform fekal (Chandra, 2007).
C. Escherichia coli Sebagai Indikator Pencemaran Air
Escherichia coli adalah salah satu bakteri Coliform total yang ditemukan
memfermentasikan laktosa pada kisaran suhu normal tubuh, yaitu 35-37oC (Chandra, 2007).
Mikrobia yang paling umum digunakan sebagai petunjuk atau indikator adanya pencemaran feses dalam air adalah Escherichia coli, serta bakteri dari kelompok Coliform. Bakteri E.coli merupakan spesies dengan habitat dalam saluran pencernaan dan non saluran pencernaan, seperti tanah dan air. Bakteri dari jenis tersebut selalu terdapat di dalam kotoran manusia, sedangkan bakteri patogen penyebab penyakit tidak selalu ditemukan. Sumber air yang mengalami kontak dengan kotoran manusia atau hewan dipastikan sumber air tersebut telah tercemar oleh bakteri E.coli. Mikrobia dari kelompok Coliform secara keseluruhan tidak umum hidup atau terdapat di dalam air sehingga keberadaanya dapat dianggap sebagai petunjuk terjadinya cemaran kotoran dalam arti luas, baik dari kotoran hewan atau manusia (Purnawijayanti, 2001).
D. Media Selektif dan Diferensial E. coli
Media adalah bahan atau substrat yang digunakan untuk menumbuhkan dan mengembangkan mikroba, yang terdiri dari nutrisi atau zat-zat makanan. Media yang digunakan untuk pertumbuhan mikroba harus mengandung unsur-unsur yang diperlukan untuk pertumbuhan mikroba, yaitu sumber energi, sumber nitrogen, dan juga ion organik esensial dan kebutuhan yang khusus, seperti vitamin dan asam amino. Media harus mempunyai tekanan osmosa, tekanan permukaan, dan mempunyai pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba
Bakteri dapat dibiakkan dalam media bebas sel, yaitu media pertumbuhan bakteri yang bebas dari segala bentuk kontaminasi sel-sel hidup yang tidak diharapkan. Media dalam bentuk padat seringkali digunakan dibandingkan dengan bentuk cair. Pengujian untuk identifikasi bakteri patogen spesifik, di mana terdapat beberapa bakteri lain, maka substansi media yang digunakan menghambat pertumbuhan bakteri lain dan tidak mempengaruhi pertumbuhan bakteri patogen yang diinginkan (media selektif). Media selektif akan mendukung tumbuhnya jenis spesimen bakteri patogen yang dipilih sesuai dengan kecocokan, dan ketersediaan substansi-substansi pendukung kelangsungan hidup bakteri tersebut (Underwood, 1999).
Menurut Hadioetomo (1985), media diferensial adalah media yang membantu dalam perkiraan identifikasi organisme berdasarkan penampakan pertumbuhannya di media. Beberapa media pertumbuhan diferensial E. coli adalah sebagai berikut. Media Sulfur Indol Motility (adanya bakteri E.coli ditandai dengan tidak terbentuknya sulfur, terjadi pembentukan indol dan adanya motilitas bakteri), media Triphtose Broth (adanya bakteri E.coli ditandai dengan adanya pembentukan gas), media Mac Conkey Agar (adanya bakteri E.coli ditandai dengan penampakan morfologi koloni berbentuk kepingan sedikit cembung dengan ukuran sedang, berwarna merah bata, dan sebaran koloni smooth) dan media Simmons Citrate Agar (bakteri E.coli tidak menggunakan sitrat sebagai sumber karbon tetapi asetat) (Holt, Krieg, Sneath, Stanley, dan Williams, 2000).
E. Uji Identifikasi E.coli
Uji ini merupakan serangkaian uji identifikasi bakteri E.coli berdasarkan karakteristik khusus bakteri E.coli. Uji identifikasi dilakukan dengan menggunakan beberapa reagen dan media khusus, yaitu uji Sulfur Indol Motility (SIM), uji fermentasi gula-gula (glukosa, laktosa, manitol, maltosa, sukrosa) dan uji sitrat 2 %. Hasil uji identifikasi dibandingkan dengan karakteristik E.coli berdasarkan Holt., dkk (2000).
1. Uji Sulfur Indol Motility (SIM)
Indol dari hasil peruraian asam amino, dan pengamatan pergerakan pertumbuhan bakteri dalam media tabung. Media yang digunakan untuk tiga pengujian tersebut adalah satu media yang memiliki komposisi : Pancreatic Digest of Casein, Peptic Digest of Animal Tissue, Ferrous Ammonium Sulfate, Sodium Thiosulfate, dan
Nutrient Agar. Komposisi media SIM tersebut memungkinkan untuk dilakukan tiga pengujian sekaligus dalam satu media. Pada uji Indol perlu ditambahkan reagen Kovacs, sedangkan kandungan Ferrous Ammonium Sulfate dan Sodium Thiosulfate digunakan untuk uji H2S dan kandungan Nutrient Agar (NA) digunakan untuk uji motilitas (Finegold dan Baron, 1996).
Uji indol digunakan untuk mendeteksi ada tidaknya indol dari peruraian triptofan oleh bakteri Coliform. Reaksi positif ditandai dengan warna merah muda di permukaan media setelah penambahan reagen Kovacs. Uji indol dilakukan setelah pengamatan motilitas agar tidak mengganggu pengamatan motilitas pada media uji (Universitas Gadjah Mada, 1993).
Uji motilitas merupakan metode yang digunakan untuk mengidentifikasi E.coli terhadap bakteri lainnya berdasarkan penyebaran koloni karena adanya
kemampuan motilitas bakteri E.coli dalam media Sulfur Indol Motility (SIM). Adanya kandungan NA semisolid dalam media SIM memungkinkan bakteri yang memiliki flagel melakukan pergerakan dalam media tersebut. Uji tersebut berkaitan dengan karakteristik E.coli yang memiliki flagel pada seluruh badan bakteri (peritrich), sebagai alat untuk bergerak di dalam habitatnya. Jika dalam media terdapat pertumbuhan bakteri yang menyebar, maka dinyatakan bahwa bakteri yang diidentifikasi tersebut tergolong sebagai Enterobacteriaceae, termasuk E.coli (Holt, dkk. 2000).
2. Uji fermentasi larutan gula-gula (glukosa, laktosa, manitol, maltosa, dan
sukrosa)
karbohidrat. Hasil dari fermentasi ini berbeda-beda bergantung pada jenis bakterinya, misalnya asam laktat, asam cuka, CO2 dan asam tertentu lainnya. Uji fermentasi karbohidrat, yang akan dilihat adalah pembentukan asam yang akan terlihat dari perubahan warna medium menjadi kuning dan pembentukan gas yang terlihat dari adanya gas dalam tabung Durham (Nugraheni, 2010).
Tujuan dari uji ini adalah untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan gula-gula spesifik yang mencerminkan sifat bakteri tersebut sehingga dapat digunakan sebagai salah satu cara identifikasi bakteri (Nugraheni, 2010). Menurut Holt, dkk. (2000), bakteri E.coli mampu memfermentasikan gula-gula spesifik yaitu glukosa, laktosa, maltosa, manitol, dan Sukrosa. Karakteristik kemampuan E.coli memfermentasikan gula-gula spesifik tersebut digunakan sebagai dasar dalam uji identifikasi E.coli.
3. Uji sitrat 2%
(1996), kandungan sitrat dalam media yang digunakan adalah 2% yang merupakan jumlah optimal dalam satu kali pengujian.
Hasil dari pengujian biokimia untuk identifikasi bakteri E.coli dicocokkan dengan tabel berdasarkan American Public Health Association (2005), adalah sebagai berikut.
Tabel II. Sifat-sifat biokimia bakteri Coliform dengan uji biokimia (American Public Health Association, 2005)
F. Uji Angka Bakteri Coliform (E.coli) Menggunakan Metode Most Probable Number (MPN)
Metode pengujian yang digunakan adalah metode Most Probable Number (MPN) atau Jumlah Perkiraan Terbatas (JPT). Metode ini merupakan metode standar World Health Organization (1996) dalam identifikasi Coliform di air, susu, dan makanan tertentu. Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumptive test), uji konfirmasi (confirmative test) dan uji kelengkapan (completed test) jika diperlukan. Pada uji tahap pertama, keberadaan Coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah, atau dugaan. Uji ini
mendeteksi sifat fermentatif Coliform dalam sampel. Beberapa jenis bakteri selain Glu (glukosa), Lac (Laktosa), Man (Manitol), Mal (Maltosa), Suc (Sucrosa), H2S (sulfur).
+ gas : membentuk gas pada tabung Durham - gas : tidak membentuk gas pada tabung Durham +/- : dapat bereaksi positif atau negatif
Coliform, juga memiliki sifat fermentatif, maka diperlukan uji konfirmasi untuk
menguji kembali kebenaran adanya Coliform dengan bantuan medium selektif diferensial. Uji kelengkapan bertujuan meyakinkan hasil tes uji konfirmasi dengan mendeteksi sifat fermentatif dan pengamatan mikroskop terhadap ciri-ciri Coliform yaitu: berbentuk batang, gram negatif, dan tidak berspora (World Health
Organization, 1996).
Hasil dari uji angka bakteri Coliform dengan metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit
pembentuk-koloni (colony-forming unit) dalam sampel. Pada umumnya nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang
digunakan umumnya per 100 ml atau per g, pada penelitian ini digunakan satuan per 100 ml karena sampel yang digunakan berupa cairan. Jika terdapat nilai MPN 10 dalam sebuah sampel air, artinya dalam sampel air tersebut diperkirakan setidaknya mengandung 10 Coliform pada setiap 100 mL atau setiap gramnya. Makin kecil nilai MPN, maka air tersebut makin tinggi kualitasnya, dan makin layak untuk dikonsumsi. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95% sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Institut Teknologi Bandung, 2011).
menggunakan tabel MPN menjadi data jumlah bakteri uji (Hadyana dan Qodratilah, 2002).
Uji MPN tersebut dilakukan dalam empat tahap, yaitu uji pendugaan (presumptive test), uji konfirmatif (confirmative test) pada medium selektif, uji pelengkap dengan medium Lactose Broth (LB), serta uji identifikasi dengan melakukan pengujian Sulfur Indol Motility (SIM), uji sitrat 2%, dan uji fermentasi larutan gula-gula untuk dapat menyimpulkan keberadaan E. coli dalam sampel air atau makanan (Dwiari, 2008). Perhitungan jumlah bakteri untuk tiap 100 ml sampel berdasarkan jumlah tabung positif dari 3 seri pengenceran dan faktor pengencerannya dicocokkan dengan tabel Most Probable Number (MPN) Standar Nasional Indonesia (Badan Standar Nasional, 1992).
G. Landasan Teori
Es batu merupakan salah satu bahan pangan yang berasal dari pembekuan air yang ditujukan sebagai bahan tambahan dalam minuman yang semakin lama tingkat konsumsinya semakin meningkat. Peningkatan kebutuhan es batu tersebut diiringi dengan banyaknya produsen pembuat es batu namun tidak didukung dengan pengetahuan mengenai persyaratan baku mutu dan prosedur pembuatan es batu yang baik, terutama dari segi mikrobiologis.
gastroenteritis, meningitis, dan peritonitis. Infeksi tersebut terjadi karena es batu berbahan dasar air yang terkontaminasi oleh feses dan sistem pengolahan yang tidak tepat.
Salah satu cara untuk mengetahui kandungan bakteri Coliform dan E. coli pada sampel es batu adalah menggunakan uji pendugaan dan penegasan dengan media-media selektif di antaranya Lactosa Broth, media Brilliant Green Lactose Bile Broth, dan E. coli Broth dilanjutkan dengan uji konfirmasi melalui pengujian
Sulfur Indol Motility, uji sitrat 2% dan uji fermentasi larutan gula-gula untuk
identifikasi ada tidaknya bakteri E.coli. Jumlah bakteri Coliform dan E.coli dari tiap tiga tabung pengenceran dikonversi menggunakan tabel Most Probable Number (MPN) untuk mendapatkan prediksi jumlah bakteri dalam 100 ml sampel
(BPOM Republik Indonesia, 2008).
Sampel es batu diambil dari lima produsen es batu skala mikro di Kecamatan Danurejan yang merupakan pusat produsen es batu di Yogyakarta. Hasil survey peneliti pada bulan Januari 2012, menunjukkan bahwa sebagian besar produsen tersebut tidak mengetahui persyaratan baku mutu dan prosedur pembuatan es batu yang baik, terutama dari segi mikrobiologis. Walaupun tidak diperoleh laporan tentang adanya kasus penyakit akibat mengkonsumsi es batu di daerah tersebut, namun sebagai langkah preventif perlu dilakukan pembuktian sesuai tidaknya kualitas es batu di daerah secara mikrobiologi mengingat kawasan tersebut merupakan pusat produsen yang memproduksi es batu di Yogyakarta.
Indonesia No. 01-3839-1995 bahwa es batu harus memenuhi syarat-syarat air minum sesuai PerMenKes RI No.416/MenKes/Per/IX/1990, yaitu syarat mutu secara mikrobiologis : total Coliform tidak melebihi 0 bakteri/100ml dan Coliform fekal tidak melebihi 0 bakteri/100ml. Analisa ini secara jangka panjang ditujukan untuk menjamin kualitas es batu kemasan untuk bahan minuman sehingga aman dikonsumsi oleh masyarakat.
H. Hipotesis
23
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian non eksperimental dengan analisis deskriptif-komparatif, karena tidak memberikan perlakuan terhadap subjek uji. Data yang diperoleh berupa prediksi jumlah bakteri Coliform ,Coliform fekal dan Escherichia coli dalam 100 ml sampel yang dibandingkan dengan Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 yang didasarkan dari PerMenKes RI No. 416/MenKes/Per/IX/1990. Sampel uji berupa sampel es batu yang dicairkan dari lima usaha mikro di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta. Penelitian laboratorium dilaksanakan di Balai Laboratorium Kesehatan Yogyakarta.
B.Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas : produk es batu kemasan dari lima usaha mikro di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta.
b. Variabel tergantung : jumlah bakteri Coliform, jumlah Coliform fekal, dan identitas E.coli.
c. Variabel pengacau :
suhu dan waktu inkubasi (media LB, BGLB, dan LTB 35-37oC selama 48 jam, media ECB 44oC selama 48 jam), asal sampel es batu (Kecamatan Danurejan).
2) Tak terkendali : kualitas media yang digunakan, akurasi peralatan dalam pengaturan suhu, akurasi peralatan dalam pengambilan volume sampel.
2. Definisi Operasional
a. Es batu kemasan adalah air yang dibekukan dalam suatu wadah berupa plastik dengan ukuran 1 kg. Pembekuan dilakukan pada suhu 0 oC (273,15 oK, 32 oF) sebagai salah satu bahan konsumsi minuman. Es batu kemasan yang digunakan diperoleh dari lima usaha mikro di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta.
mengalami kontak dengan feses baik secara langsung atau tidak langsung.
d. Escherichia coli adalah salah satu bakteri Coliform fekal dengan kemampuan memfermentasikan laktosa suhu 44,5oC yang dimungkinkan terdapat dalam es batu. E.coli merupakan bakteri gram negatif dengan bentuk seperti kapsul berukuran 1,1 – 1,5 x 2,0 – 6,0 µm. E.coli menunjukkan hasil positif pada uji Indol, hasil negatif pada uji H2S, hasil negatif pada uji sitrat, hasil positif pada uji fermentasi gula-gula dan hasil positif atau negatif pada uji motilitas.
e. MPN (Most Probable Number) adalah metode penentuan jumlah bakteri Coliform dan Coliform fekal yang mungkin ada di dalam sampel es batu yang diambil dari lima usaha mikro di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta.
f. Kualitas mikrobiologis es batu adalah kelayakan es batu dari segi mikrobiologis dengan ketentuan kandungan total Coliform sebesar 0 bakteri/100ml dan Coliform fekal sebesar 0 bakteri/100ml berdasarkan Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 dan PerMenKes RI No. 416/MenKes/Per/IX/1990.
tersebut hanya dapat ditumbuhi bakteri Coliform total, Coliform fekal, dan E. coli saja.
h. Media diferensial adalah media yang dibuat untuk membedakan masing-masing bakteri yaitu bakteri Coliform total, Coliform fekal, dan E. coli terhadap bakteri lain. Pembedaan dilakukan dengan pengamatan perubahan media biakan atau penampilan koloni pada media Mac Conkey Agar.
C. Bahan dan Alat Penelitian
1. Bahan penelitian
Sampel yang diuji adalah produk es batu kemasan dari lima usaha mikro di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta yang diambil secara acak pada bulan Januari 2012. Bahan untuk uji MPN adalah Lauryl Triphtose Broth, Brilliant Green Lactose Bile Broth 2%, E. coli (EC) Broth, dan NaCl fisiologis
0,85%. Untuk uji identifikasi E.coli adalah media Mac Conkey Agar, media Sulfur Indol Motility (SIM), larutan gula-gula (glukosa, laktosa, manitol,
maltosa, sukrosa), dan media sitrat 2%. Kontrol positif adalah biakan murni E.coli ATCC 25922 dan kontrol negatif adalah biakan murni Staphylococcus
aureus ATCC 25923 serta kontrol media pengujian.
2. Alat penelitian
tabung reaksi dilengkapi tabung Durham, pipet ukur, pengaduk kaca, beker gelas, objek gelas, gelas arloji, gelas ukur, Erlenmeyer, dan labu ukur.
D. Tata Cara Penelitian
1. Pengumpulan sampel
Penelitian dilakukan dengan mengambil lima sampel es batu dari lima produsen es batu skala mikro secara acak di Kecamatan Danurejan, Yogyakarta yang dianggap mewakili seluruh daerah produksi es batu di Kecamatan Danurejan. Dari setiap produsen tersebut diambil masing-masing satu kemasan es batu dalam plastik 1 kg sebagai sampel. Sampel diambil langsung dari produsen sebanyak satu kali tanpa replikasi pengambilan sampel. Replikasi sampel dilakukan dengan metode pengenceran sebanyak tiga kali pada saat pengujian di laboratorium.
Pengambilan sampel dilakukan dengan memilih lima objek uji dari lima produsen es batu secara acak. Sampel disimpan dengan wadah plastik yang sudah disterilkan dengan alkohol 70% . Sampel yang diperoleh harus segera diuji agar tidak terkontaminasi pada saat penyimpanan.
2. Homogenisasi dan pengenceran sampel
dengan pH fisiologis saluran pencernaan yang merupakan habitat alami E.coli. Campuran tersebut dihomogenkan dan didiamkan selama 15 menit dalam wadah yang sudah disterilkan pada suhu kamar dalam kondisi aseptis. Perlakuan tersebut dilakukan pada seluruh sampel sehingga diperoleh lima stok sampel. Setiap stok sampel tersebut diencerkan dan direplikasi sebanyak tiga kali hingga diperoleh konsentrasi sampel sebesar 10-1, 10-2, dan 10-3. Setiap konsentrasi sampel diambil 1 ml dan diencerkan dengan 9 ml NaCl 0,85% (DepKes RI, 1992).
3. Pembuatan media
a. Lauryl Triphtose Broth (LTB)
Sebanyak 35,6 g serbuk Lauryl Triphtose Broth dilarutkan dalam 1 liter aquadest ke dalam labu ukur dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi tabung Durham sebanyak masing-masing 10 ml.Kemudian disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit. Didinginkan segera sampai suhu 25o C.
b. Brilliant Green Lactose Bile Broth 2% (BGLB 2%)
c. Escherichia coli (EC) Broth
Sebanyak 37 g EC Broth dimasukkan dalam 1 liter aquadest, dilarutkan tanpa pemanasan, dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 10 ml yang telah dilengkapi tabung Durham. Setelah itu disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit dengan didinginkan segera sampai suhu 25 oC.
d. Mac Conkey Agar (MCA)
Sebanyak 3,6 g Mac Conkey Agar dimasukkan dalam 100 ml aquadest, dan dilarutkan dengan pemanasan. Dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 10 ml. Disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit. Setelah suhunya mencapai kira-kira 60-70o C, dipindahkan bahan dari tabung reaksi ke cawan petri.
e. Nutrient Agar (NA) miring
Sebanyak 1,4 g NA dimasukkan dalam 50 ml aquadest, lalu dilarutkan dengan pemanasan. Dimasukkan dalam tabung reaksi dan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit dan didinginkan segera dengan posisi tabung reaksi yang dimiringkan. f. NaCl fisiologis 0,85%
g. Simmons Citrate Agar
Sebanyak 2,3 g Simmons Citrate Agar dalam 100 ml aquadest, lalu dlarutkan dengan pemanasan. Dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121o C selama 15 menit dan kemudian didinginkan.
4. Uji bakteri coliform (IKM/5.4.2/2009/BLK-Y)
a. Uji Pendugaan Bakteri Coliform (Presumptive test)
Dipipet 1 ml pengenceran sampel 10-1, 10-2, 10-3 ke dalam masing-masing 3 tabung sebagai replikasi yang berisi 9 ml Lauryl Triphtose Broth yang di dalamnya terdapat tabung Durham terbalik.
Semua tabung tersebut disimpan dalam inkubator pada suhu 36oC±1oC selama 24 dan 48 jam. Setelah 24 jam dicatat jumlah tabung yang membentuk gas pada masing-masing pengenceran dan disimpan kembali tabung yang tidak menghasilkan gas dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 36oC±1oC, kemudian dicatat kembali tabung yang menghasilkan gas. Adanya gas pada tabung Durham mengindikasikan adanya bakteri Coliform.
b. Uji Penegasan Bakteri Coliform (Confirmative test)
membentuk gas dicatat dan dibandingkan dengan tabel MPN (Badan Standarisasi Nasional Indonesia, 1995) (lampiran 1).
c. Uji Konfirmasi Coliform fekal dan Escherichia coli
Biakan dari tabung yang menunjukkan uji penegasan positif dipindahkan 1 sengkelit ke dalam tabung reaksi berisi 10 ml EC Broth yang telah dilengkapi dengan tabung Durham terbalik. Seluruh tabung diinkubasi pada suhu 44-45oC selama 24-48 jam. Dilakukan pengamatan terhadap pembentukan gas. Dari biakan EC Broth yang positif, masing-masing diinokulasikan pada petri berisi media Mac Conkey Agar (MCA), diamati morfologi koloni spesifik yang tumbuh. Menurut Holt et al. (2000), koloni spesifik E.coli pada media MCA memiliki karakteristik ukuran koloni sedang, warna merah bata atau merah tua, sebaran koloni yang tipis seperti awan (smooth), dan berbentuk kepingan sedikit cembung.
d. Uji Identifikasi Escherichia coli
Dipilih koloni spesifik yang tumbuh pada media Mac Conkey Agar, diinokulasikan pada media NA miring. Dilanjutkan uji biokimia
E. Analisis Hasil
Data yang diperoleh berupa hasil reaksi pembentukan gas pada uji pendugaan dan uji konfirmasi pada tabung Durham terbalik. Timbulnya gas menunjukkan adanya cemaran Coliform dan Coliform fekal. Kombinasi jumlah tabung positif gas dicocokkan dengan tabel MPN deret 3 tabung (Badan Standarisasi Nasional Indonesia, 1995) (lampiran 1). Kombinasi tersebut menunjukkan indeks MPN yang menyatakan jumlah bakteri Coliform dan Coliform fekal dalam 100 ml sampel.
Data yang diperoleh dari uji biokimia berupa reaksi-reaksi terhadap reagen dan media pertumbuhan E.coli. Hasil reaksi biokimia dicocokkan dengan tabel reaksi uji biokimia E.coli berdasarkan APHA (2005) untuk mengetahui hasil uji biokimia (Tabel II).
33
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Es batu merupakan salah satu komoditas bahan pangan yang sudah sangat umum digunakan dalam kehidupan sehari-hari terutama sebagai bahan tambahan dalam berbagai jenis minuman. Tingginya tingkat produksi dan konsumsi es batu oleh masyarakat harus diikuti dengan terjaminnya kualitas es batu dari segi kesehatan untuk menjamin keamanan konsumen. Jaminan kualitas es batu yang paling pokok adalah jaminan secara mikrobiologis.
Berdasarkan hasil survey peneliti pada bulan Januari 2012 pada produsen es batu skala mikro di Kecamatan Danurejan Yogyakarta, ditemukan fakta bahwa Kecamatan Danurejan adalah daerah produksi es batu skala mikro terbesar di Yogyakarta. Jumlah produsen skala mikro di daerah tersebut mencapai 49 produsen yang tersebar secara merata di Kecamatan Danurejan.
juga harus memperhatikan faktor-faktor lain. Faktor-faktor tersebut adalah higienitas dalam proses pembuatan, penyimpanan, dan pendistribusian es batu.
A. Pengumpulan Sampel
Menurut Gay dan Diehl (1992), analisis pada penelitian deskriptif dapat menggunakan jumlah sampel sebanyak 10% dari total populasi. Oleh karena itu, peneliti menggunakan 5 sampel dari 49 total populasi produk es batu di Kecamatan Danurejan. Sampel tersebut dipilih dengan metode acak tanpa mempertimbangkan proses pembuatan, distribusi, dan penyimpananya agar diperoleh sampel yang benar-benar dapat menjadi representatif dari populasi.
B. Homogenisasi dan Pengenceran Sampel
Homogenisasi sampel dilakukan untuk menjamin bahwa bakteri Coliform yang terdapat dalam sampel es batu dapat terdistribusi secara merata dalam setiap pengambilan cuplikan sampel. Hal ini perlu dilakukan karena sampel telah mengalami proses pembekuan yang dapat melemahkan kehidupan bakteri dan akibat proses pemadatan saat pembekuan menyebabkan kemampuan hidup bakteri menjadi berkurang.
direplikasi sebanyak tiga kali sebagai pembanding antar hasil dari setiap konsentrasi sampel untuk memperoleh hasil yang valid.
Metode pengenceran dilakukan dengan prinsip deret pengenceran tiga tabung. Metode ini digunakan karena merupakan metode baku dalam pengujian bakteri Coliform, Coliform fekal, dan Escherichia coli. Metode pengenceran deret tiga tabung lebih mudah dilakukan dan telah memenuhi standar prosedur pengujian bakteri Coliform dalam sampel es batu berdasarkan Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 untuk pengujian mikrobiologis sampel es batu.
Larutan pengencer yang digunakan adalah NaCl 0,85% (NaCl fisiologis) yang memiliki pH = 7 yang sesuai dengan pH saluran pencernaan manusia, diharapkan dengan kondisi yang sesuai dengan habitat alami tersebut bakteri E.coli dapat tumbuh dengan baik. Menurut Macfaddin (1990), larutan NaCl
0,85% merupakan larutan fisiologis yang dapat menggiatkan kembali daya hidup bakteri E.coli setelah mengalami berbagai proses pengolahan pembuatan bahan pangan, termasuk akibat proses pembekuan air sebagai bahan baku pada pembuatan es batu.
terdapat partikel-partikel pengotor yang dapat diamati secara langsung tanpa bantuan alat.
C. Uji Bakteri Coliform (IKM/5.4.2/2009/BLK-Y)
Analisa bakteriologi air adalah suatu pengujian untuk mengetahui kandungan bakteri dan identifikasi jenis bakteri dalam suatu sampel air, baik berupa air minum, air sumur, dan sampel lain yang mengandung air. Analisa ini bertujuan untuk menggambarkan kualitas es batu dari segi mikrobiologis. Hasil analisa ini digunakan sebagai parameter kesesuaian kualitas es batu dengan baku mutu yang ditetapkan dalam Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 yang berguna untuk menjamin kelayakan es batu tersebut sebagai bahan pangan untuk dikonsumsi masyarakat (DepKes RI, 1995).
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah Most Probable Number (MPN) sesuai dengan standar prosedur IKM/5.4.2/2009/BLK-Y Balai
Laboratorium Kesehatan Yogyakarta. Bakteri yang diteliti pada penelitian ini adalah golongan bakteri Coliform termasuk Coliform fekal, dan Escherichia coli. Metode ini digunakan karena merupakan metode baku dalam uji cemaran bakteri Coliform, Coliform fekal, dan E.coli dalam berbagai macam sampel termasuk es
batu. Selain itu, metode ini dapat menunjukkan perkiraan atau prediksi jumlah bakteri dalam setiap 100 ml sampel es batu dengan cepat (BPOM RI, 2008).
bakteri Coliform dengan media LTB (Lauryl Triphtose Broth) dan BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth 2%), untuk uji Coliform fekal digunakan media ECB (Escherichia coli Broth) dan untuk uji identifikasi E.coli dilakukan dengan uji Sulfur Indol Motility (SIM), uji fermentasi gula-gula (glukosa, laktosa, manitol, maltosa, sukrosa), dan uji sitrat 2% (Soemarmo, 2000).
Media yang digunakan tersebut termasuk media differensial yaitu media yang digunakan untuk membantu dalam perkiraan identifikasi organisme berdasarkan pertumbuhannya di media. Media differensial mengandung indikator yang dapat memberikan reaksi positif jika terdapat mikroba yang sesuai dengan karakteristik indikator. Karakteristik indikator tersebut dapat meliputi hasil metabolisme atau karakteristik organisme (Hadioetomo, 1985).
Cara menghitung jumlah bakteri dengan metode MPN didasarkan pada kombinasi tiga konsentrasi sampel deret tiga tabung yang memberikan reaksi positif. Reaksi positif ditandai dengan adanya pembentukan gas pada tabung Durham yang diletakkan di dalam tabung reaksi berisi media yang sesuai. Sebagai contoh, uji Coliform sampel I pada konsentrasi 10-1 diperoleh hasil 2 tabung positif , 10-1 diperoleh hasil negatif, dan 10-3 diperoleh hasil negatif (2-0-0). Dari kombinasi tersebut dicatat dan dicocokkan dengan tabel MPN berdasarkan Badan Standarisasi Nasional Indonesia (1995) dan ditemukan nilai MPN 10 berarti dalam setiap 100 ml sampel es batu I diperkirakan terdapat 10 bakteri Coliform (lampiran 1).
Indol Motility (SIM), uji fermentasi larutan gula-gula (glukosa, laktosa, manitol,
maltosa, sukrosa) dan uji sitrat 2%.
Uji identifikasi E.coli sebagai bakteri indikator perlu dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya kontaminasi feses pada es batu. Menurut Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia (2008), tidak semua golongan bakteri Coliform memiliki hábitat alamiah di dalam saluran pencernaan. Hanya bakteri E.coli yang memiliki habitat alamiah dalam saluran pencernaan manusia dan hewan. Metode MPN hanya dapat digunakan untuk pengujian Coliform total dan Coliform fekal tetapi tidak dapat digunakan untuk identifikasi E.coli.
1. Uji pendugaan bakteri coliform (Presumptive test)
Uji ini merupakan langkah awal penelitian yang bertujuan untuk mengetahui adanya dugaan keberadaan bakteri Coliform dalam sampel es batu. Media yang digunakan adalah Lauryl Triphtose Broth (LTB), yaitu media cair yang mengandung laktosa yang merupakan salah satu bahan yang dapat diuraikan oleh bakteri Coliform. Laktosa yang telah terurai dapat diamati dengan terbentuknya gas pada tabung Durham yang diletakkan di dalam tabung reaksi. Uji pendugaan ini belum dapat digunakan sebagai acuan pasti ada tidaknya bakteri Coliform karena media LTB yang digunakan bukan merupakan media selektif untuk pertumbuhan Coliform saja tetapi cenderung sebagai media pengkayaan bakteri golongan Enterobacteriaceae (Universitas Gadjah Mada, 1993).
Pada penelitian yang dilakukan diperoleh hasil bahwa sampel I, II dan III pada tiga konsentrasi pengenceran membentuk gas, sedangkan sampel IV dan V tidak membentuk gas (Tabel III).
Dari tabel III dapat dinyatakan bahwa sampel I, II, dan III mengandung bakteri Coliform sedangkan sampel IV dan V tidak mengandung bakteri Coliform. Keberagaman jumlah tabung yang positif dari sampel I, II, dan III menunjukkan bahwa jumlah bakteri Coliform dalam setiap sampel tidak sama dan semakin banyak tabung yang positif pada konsentrasi yang lebih kecil menunjukkan kandungan jumlah bakteri Coliform yang lebih besar. Urutan jumlah tabung positif paling banyak adalah sampel II yang menghasilkan 3 tabung positif pada konsentrasi 10-1 dan 2 tabung positif pada konsentrasi 10-2, diikuti sampel I yang menghasilkan 3 tabung positif pada konsentrasi 10-1 dan 1 tabung positif pada konsentrasi 10-2, dan sampel III hanya menghasilkan 1 tabung positif pada konsentrasi 10-1. Jadi dari ke tiga tabung yang menunjukkan hasil positif sampel II menunjukkan jumlah bakteri Coliform yang paling banyak diikuti oleh sampel I dan sampel III.
Gambar 1. Hasil uji pendugaan pada media LTB sampel I inkubasi 48 jam pada suhu 36o C±1oC
Keterangan :
Hasil positif : terbentuk gas pada tabung Durham Hasil negatif : tidak terbentuk gas pada tabung Durham A : Sampel I konsentrasi 10-1 (3 tabung membentuk gas) B : Sampel I konsentrasi 10-2 (1 tabung membentuk gas) C : Sampel I konsentrasi 10-3 (tidak membentuk gas) M: Kontrol media (tidak membentuk gas)
Gambar 2. Hasil uji pendugaan pada media LTB sampel II inkubasi 48 jam pada suhu 36o C±1oC
Keterangan :
Hasil positif : terbentuk gas pada tabung Durham Hasil negatif : tidak terbentuk gas pada tabung Durham A : Sampel II konsentrasi 10-1 (3 tabung membentuk gas) B : Sampel II konsentrasi 10-2 (2 tabung membentuk gas) C : Sampel II konsentrasi 10-3 (tidak membentuk gas) M: Kontrol media (tidak membentuk gas)
A B C
A B C
M
Gambar 3. Hasil uji pendugaan pada media LTB sampel III inkubasi 48 jam pada suhu 36o C±1oC
Keterangan :
Hasil positif : terbentuk gas pada tabung Durham Hasil negatif : tidak terbentuk gas pada tabung Durham A : Sampel III konsentrasi 10-1 (1 tabung membentuk gas) B : Sampel III konsentrasi 10-2 (tidak membentuk gas) C : Sampel III konsentrasi 10-3 (tidak membentuk gas) M: Kontrol media (tidak membentuk gas)
Gambar 4. Uji pendugaan pada media LTB sampel IV inkubasi 48 jam pada suhu 36o C±1oC
Keterangan :
Hasil negatif : tidak terbentuk gas pada tabung Durham A : Sampel IV konsentrasi 10-1 (tidak membentuk gas) B : Sampel IV konsentrasi 10-2 (tidak membentuk gas) C : Sampel IV konsentrasi 10-3 (tidak membentuk gas) M: Kontrol media (tidak membentuk gas)
A B C
A B C
M
Gambar 5. Uji pendugaan pada media LTB sampel V inkubasi 48 jam pada suhu 36o C±1oC
Keterangan :
Hasil negatif : tidak terbentuk gas pada tabung Durham A : Sampel V konsentrasi 10-1 (tidak membentuk gas) B : Sampel V konsentrasi 10-2 (tidak membentuk gas) C : Sampel V konsentrasi 10-3 (tidak membentuk gas) M : Kontrol media (tidak membentuk gas)
Bakteri golongan Coliform terdiri dari bakteri jenis aerob, yaitu bakteri yang membutuhkan oksigen untuk proses metabolisme dan fakultatif anaerob yaitu bakteri yang proses metabolismenya dapat berlangsung dengan adanya oksigen maupun tanpa oksigen. Pembentukan gas pada tabung Durham oleh bakteri Coliform terjadi karena adanya peruraian dari laktosa yang merupakan polimer polisakarida rantai panjang yang perlu diuraikan dahulu sebelum masuk ke dalam sel bakteri. Laktosa dipecah menjadi galaktosa dan glukosa dengan bantuan enzim β-galaktosidase yang kemudian ditranspor masuk ke dalam sel melalui proses transpor aktif. Pada mikroba aerob glukosa akan diproses melalui jalur glikolisis yang menghasilkan asam piruvat. Asam piruvat yang dihasilkan diproses kembali melalui Siklus Krebs yang menghasilkan asam-asam campuran
dan residu berupa gas CO2, sedangkan pada bakteri fakultatif anaerob, glukosa akan dimetabolisme menghasilkan asam-asam campuran dan gas O2. Asam-asam yang terbentuk dari proses metabolisme bakteri aerob dan fakultatif anaerob umumnya berupa asam suksinat dan fumarat (Atlas, 1997).
Hasil sampel positif dilanjutkan dengan uji konfirmasi untuk memastikan keberadaan bakteri Coliform dalam sampel es batu. Media yang digunakan adalah media BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth 2%). Uji penegasan dilakukan pada seluruh sampel baik yang memberikan reaksi positif atau negative.
2. Uji penegasan bakteri coliform (Confirmative test)
Uji konfirmasi ini bertujuan untuk menguatkan dugaan adanya bakteri Coliform dalam sampel es batu. Uji ini merupakan tahap penyeleksian
pertumbuhan bakteri Coliform terhadap bakteri lain dengan menggunakan media selektif bakteri Coliform yaitu BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth 2%). Media ini merupakan media cair berwarna hijau yang mengandung laktosa empedu berwarna hijau dan hanya bakteri yang dapat menfermentasikan laktosa yang dapat bertahan hidup pada media ini yaitu bakteri Coliform (Universitas Gadjah Mada, 1993).
Tabel IV. Hasil uji penegasan dan angka MPN bakteri Coliform dengan media
Kontrol positif membentuk gas pada tabung Durham Kontrol negatif tidak membentuk gas pada tabung Durham Kontrol media tidak membentuk gas pada tabung Durham Keterangan :
Kontrol positif : biakan murni E.coliATCC 25922
sehingga bakteri Coliform tidak dapat tumbuh. Tabung Durham dalam tabung reaksi yang terdapat gas mengindikasikan adanya bakteri Coliform, sedangkan pada tabung yang tidak terdapat gas dinyatakan tidak mengandung bakteri Coliform (Gambar 6).
Gambar 6. Hasil uji konfirmasi bakteri Coliform sampel I konsentrasi 10-1 dengan media BGLB inkubasi 24 jam pada suhu 36o C±1oC
Keterangan gambar :
+ : Kontrol positif membentuk gas (biakan murni bakteri E.coli ATCC 25922) - : Kontrol negatif tidak membentuk gas (biakan murni bakteri
Staphyllococcus aureus ATCC 25923) A : Sampel I konsentrasi 10-1 (membentuk gas) B : Sampel I konsentrasi 10-2 (membentuk gas) C : Sampel I konsentrasi 10-3 (membentuk gas) M : Kontrol media (tidak membentuk gas)
Berdasarkan metode dari (IKM/5.4.2/2009/BLK-Y) untuk menjamin bahwa gas yang terbentuk dihasilkan oleh bakteri Coliform, maka digunakan kontrol positif berupa biakan murni E. coli dan kontrol negatif dari biakan murni Staphyllococcus aureus ATCC 25923 serta kontrol media untuk mengetahui ada
tidaknya kontaminasi pada media yang menyebabkan hasil pengujian menjadi bias. E.coli ATCC 25922 digunakan sebagai kontrol positif karena merupakan
bakteri gram negatif golongan Coliform yang mampu memfermentasikan laktosa dan menghasilkan asam-asam tertentu dan gas. S.aureus digunakan sebagai kontrol negatif karena bakteri ini termasuk bakteri gram positif yang dapat digunakan sebagai pembanding dalam uji identifikasi (Universitas Gadjah Mada, 1993).
Urutan jumlah bakteri Coliform pada media BGLB ini berkorelasi dengan jumlah tabung positif pada uji pendugaan dengan media LTB. Hasil yang berkorelasi tersebut dapat digunakan untuk menyatakan bahwa metode yang dilakukan berhasil sebagai uji penegasan adanya cemaran bakteri Coliform pada sampel es batu I, II, dan III (lampiran 3).
Berdasarkan hasil perhitungan angka bakteri Coliform dengan metode MPN (Tabel IV) diperoleh hasil sampel I terdapat 4.300 Coliform /100ml, sampel
II terdapat 9.300 Coliform /100ml, dan sampel III terdapat 400 Coliform /100ml, sedangkan sampel IV dan V tidak mengandung bakteri Coliform. Jumlah bakteri Coliform pada sampel es batu I, II, dan III tersebut dinyatakan tidak memenuhi
syarat kualitas mikrobiologi es batu sesuai Standar Nasional Indonesia 01-3839-1995 dan PerMenKes RI No. 416/MenKes/Per/IX/1990 yang menyatakan baku mutu es batu total Coliform tidak melebihi 0 bakteri/100ml, sedangkan sampel IV dan V secara mikrobiologis memenuhi syarat kualitas es batu berdasarkan baku mutu tersebut.
Laktosa pada media BGLB hanya dapat difermentasikan oleh bakteri Coliform menjadi asam suksinat dan dan fumarat diikuti pembentukan O2 oleh
