Kacang hijau (Vigna radiata (L.)R.Wilczek) merupakan tanaman pangan yang juga digunakan sebagai bahan dalam kosmetik tradisional, namun efektivitasnya sebagai bahan kosmetik tradisional belum diteliti lebih lanjut. Penelitian ini bertujuan melakukan eksplorasi aktivitas penangkapan radikal bebas, UV protection dan antibakteri.
Kacang hijau diekstraksi dengan etanol 90% v/v, kemudian dipekatkan hingga membentuk ekstrak. Kromatografilapis tipis (KLT) dilakukan pada ekstrak kacang hijau menggunakan fase gerak kloroform : metanol (7:3v/v) dan fase diam silica gel 60 F254.
Selanjutnya ekstrak diuji secara kualitatif terkait aktivitas penangkapan radikal dengan menggunakan 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH), UV protection dengan metode inhibition of bleaching of β-carotene, dan antibakteri dengan bioautografi kontak.
Senyawa aktif hasil uji kualitatif diisolasi dengan kromatografi kolom, didapatkan 4 isolat. Ekstrak kacang hijau mengandung golongan senyawa meliputi flavonoid, fenolik, dan terpenoid, yang terbagi menjadi 4 isolat. Keempat isolat tersebut memiliki aktivitas penangkap radikal bebas dan UV protection, sedangkan aktivitas antibakteri hanya dimiliki oleh isolat 3 dan 4.
Kata kunci: Kacang hijau (Vigna radiata (L.)R.Wilczek), penangkap radikal bebas, UV
Mung beans (Vigna radiata (L.)R.Wilczek) is a edible plant which is widely used as an ingredient in traditional cosmetics, but its effectiveness as a traditional cosmetic ingredient has not been studied further. The aims of this study are to explore the free radical scavenging activity, UV protection, and antibacterial, of mung beans.
Mung beans extracted with ethanol 90% v/v, then concentrated to form the extract. Extracts of mung beans separated by preparative thin layer chromatography using a mobile phase of chloroform: methanol (7: 3 v/v) and the stationary phase silica gel 60 F254. Extracts tested qualitatively on radical scavenging activity using the 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl(DPPH), UV protection using inhibition of bleaching of β-carotene method, and antibacterial by contact bioautography method.
Active compound, which is obtained from qualitative test, isolated using column chromatography, and by this isolation, 4 isolates obtained. Mung beans extract contains a group of compounds such as flavonoids, phenolics, and terpenoids, which are divided into 4 isolates. All four isolates have free radicals scavengers activity and UV protection, while the antibacterial activity present on isolates 3 and 4.
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS, UV PROTECTION DAN ANTIBAKTERI EKSTRAK
KACANG HIJAU (Vigna radiata (L.) R. Wilczek)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Agustine Kurniawaty
NIM: 118114113
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
i
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS, UV PROTECTION DAN ANTIBAKTERI EKSTRAK
KACANG HIJAU (Vigna radiata (L.) R. Wilczek)
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Agustine Kurniawaty
NIM: 118114113
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
ii
Persetujuan Pembimbing
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF PENANGKAP RADIKAL BEBAS, UV PROTECTION DAN ANTIBAKTERI EKSTRAK
KACANG HIJAU (Vigna radiata (L.) R. Wilczek)
Skripsi yang diajukan oleh :
Agustine Kurniawaty
NIM: 118114113
telah disetujui oleh:
Pembimbing Utama
iii
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Saya tidak tahu mengenai kunci keberhasilan, tetapi kunci kegagalan
adalah mencoba menggembirakan hati semua orang “
Bill Cosby
Kupersembarkan skripsi ini untuk:
Tuhan Yesus Kristus, yang selalu melindungi dan membimbingku hingga saat ini
Kedua orang tuaku
Kedua Kakaku
v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
vi
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma:
Nama : Agustine Kurniawaty
Nomor Mahasiswa : 118114113
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya berjudul:
UJI AKTIVITAS ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA AKTIF
PENANGKAP RADIKAL BEBAS, UV PROTECTION DAN
ANTIBAKTERI EKSTRAK KACANG HIJAU (Vigna radiata (L.) R. Wilczek)
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pengkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama saya tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.
Dengan demikian peryataan ini saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 2 Agustus 2015
Yang menyatakan
vii PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan karena berkat rahmat dan karunia-Nya penulis
dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi Senyawa
Aktif Penangkap Radikal Bebas, UV protection, dan Antibakteri Ekstrak Kacang Hijau (Vigna radiata (L.) R. Wilczek)“ sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Dalam proses penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan dari semua pihak sehingga skripsi ini dapat terselesaikan dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terimakasih yang sebesar-besarnya kepada :
1. Dr.rer.nat. Yosi Bayu Murti, Apt.. sebagai Dosen Pembimbing yang telah memberikan bimbingan, pengarahan serta ilmu dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini.
2. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt. selaku Dosen Penguji atas pengarahan dan kesediaannya menguji skripsi ini.
3. Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc. selaku Dosen Penguji atas pengarahan dan kesediaannya menguji skripsi ini.
4. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. sebagai Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma.
viii
6. Surya Adhi Nugraha, Setio Agustin, Elyn Prameswari dan Skolastika Feranda Wardani, terimakasih atas perjalanan kerjasama yang telah kita lewati bersama ini.
7. Teman- teman angkatan 2011, atas kerjasama, doa, semangat, kritik dan sarannya.
8. Semua pihak yang telah memberikan bantuan dan dukungan yang tidak dapat disebut satu per satu.
Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini banyak kesalahan dan kekurangan mengingat keterbatasan kemampuan dan pengetahuan penulis, untuk itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari semua pihak. Akhir kata semoga penelitian dan penyusunan skripsi ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi.
Yogyakarta, Juni 2015
ix DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL...i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... ii
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... v
LEMBAR PERYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ... vi
PRAKATA ... vii
DAFTAR TABEL ... xiv
DAFTAR GAMBAR ... xvi
DAFTAR LAMPIRAN ... xviii
INTISARI ... xx
ABSTRACT ... xxi
BAB I PENGANTAR ... 1
A. Latar Belakang ... 1
1. Permasalahan ... 2
2. Keaslian penelitian ... 3
3. Manfaat ... 5
x
1. Tujuan umum ... 5
2. Tujuan khusus ... 5
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA... 6
A. Kacang Hijau (Vigna radiata( L.) R. Wilczek) ... 6
1. Klasifikasi tanaman ... 6
2. Deskripsi tanaman kacang hijau ... 7
3. Kandungan kimia kacang hijau ... 8
B. Antioksidan ... 8
1. Definisi antioksidan ... 8
2. Metode penangkapan radikal DPPH ... 10
C. UV protection ... 11
1. Definisi UV protection ... 11
2. Metode inhibition of bleaching of �-carotene ... 11
D. Antibakteri ... 12
1. Definisi antibakteri ... 12
2. Metode bioautografi ... 13
3. Metode difusi ... 14
E. Ekstraksi ... 15
F. Kromatografi ... 17
xi
2. Kromatografi kolom ... 19
G. Landasan Teori... 21
H. Hipotesis ... 21
BAB III METODE PENELITIAN... 22
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 22
B. Bahan dan Materi Penelitian ... 22
1. Bahan penelitian ... 22
2. Alat penelitian ... 23
C. Tata Cara Penelitian ... 23
1. Determinasi sampel ... 23
2. Pengumpulan dan penyiapan bahan ... 23
3. Ektraksi ... 25
4. Kromatografi lapis tipis ekstrak kacang hijau ... 26
5. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas ekstrak kacang hijau .. ... 27
6. Identifikasi senyawa pada ekstrak kacang hijau dengan reagen semprot. ... 28
7. Uji perbandingan profil kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak kacang hijau, ekstrak kulit kacang hijau, dan keping biji kacang hijau... 28
xii
9. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak kacang hijau ... 30
10. Triturasi ... 32
11. Kromatografi kolom ... 33
12. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas isolat senyawa ekstrak kacang hijau ... 35
13. Uji kualitatif aktivitas UV protection isolat senyawa ekstrak kacang hijau ... 36
14. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat senyawa ekstrak kacang hijau 36 15. Identifikasi senyawa dari isolat aktif ekstrak kacang hijau ... 38
16. Bagan alur penelitian ... 40
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 42
A. Hasil Determinasi Sampel... 42
B. Hasil Pengumpulan dan Penyiapan Bahan ... 43
C. Hasil Ekstraksi ... 44
1. Hasil ekstraksi kacang hijau ... 44
2. Hasil ekstraksi kulit dan keping biji kacang hijau ... 46
3. Hasil susut pengeringan ekstrak kacang hijau ... 47
4. Hasil pemerian ekstrak kacang hijau ... 47
D. Hasil Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak Kacang Hijau ... 48
xiii
F. Hasil Identifikasi Senyawa Pada Ekstrak Kacang Hijau dengan Reagen
Semprot ... 53
G. Hasil Uji Perbandingan Profil kromatografi Lapis Tipis (KLT) Ekstrak Kacang Hijau, Kulit Kacang Hijau dan Keping biji Kacang Hijau ... 56
H. Hasil Uji Kualitatif UV Protection Ekstrak Kacang Hijau ... 58
I. Hasil Uji Kualitatif Antibakteri Ekstrak Kacang Hijau ... 61
J. Hasil Triturasi ... 64
K. Hasil Kromatografi Kolom ... 67
L. Hasil Uji Kualitatif Penangkapan Radikal Bebas Isolat Senyawa Ekstrak Kacang Hijau ... 71
M. Hasil Uji Kualitatif UV Protection Isolat Senyawa Ekstrak Kacang Hijau ... 73
N. Hasil Uji Kualitatif Antibakteri Isolat Senyawa Ekstrak Kacang Hijau . 75 O. Hasil Identifikasi Senyawa Isolat Senyawa Aktif Ekstrak Kacang Hijau ... 77
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 84
A. Kesimpulan ... 84
B. Saran ... 84
DAFTAR PUSTAKA ... 85
LAMPIRAN ... 88
xiv
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Klasifikasi respon hambatan pertumbuhan bakteri ... 15
Tabel II. Hasil optimasi fase gerak kromatografi lapis tipis ekstrak kacang hijau ... 49
Tabel III. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal bebas ekstrak kacang hijau ... 52
Tabel IV. Hasil identifikasi senyawa dengan reagen pada ekstrak kacang hijau dengan fase gerak kloroform : metanol (7:3 v/v) ... 54
Tabel V. Hasil perbandingan kromatografi lapis tipis ekstrak kulit kacang hijau dan keping biji kacang hijau dengan fase gerak kloroform : metanol (7:3 v/v) ... 56
Tabel VI. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal bebas ekstrak kulit dan keping biji kacang hijau dengan fase gerak kloroform : metanol (7:3 v/v) ... 57
Tabel VII. Hasil uji kualitatif UV protection ekstrak kacang hijau dengan intensitas sinar UV = 14,12 Lux ... 60
Tabel VIII. Hasil uji kualitatif antibakteri secara bioautografi ekstrak kacang hijau ... 62
xv
Tabel X. Hasil KLT triturasi n-heksana... 65
Tabel XI. Hasil KLT triturasi kloroform : metanol (7:3 v/v) ... 65
Tabel XII. Hasil KLT ekstrak kacang hijau ... 66
Tabel XIII. Hasil optimasi fase gerak kromatografi kolom step gradien ... 69
Tabel XIV. Isolat hasil kromatografi kolom ... 70
Tabel XV. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal bebas isolat dan ekstrak kacang hijau ... 72
Tabel XVI. Hasil uji kualitatif aktivitas UV protection isolat dan ekstrak kacang hijau pada menit ke 15 dengan intensitas sinar UV = 13,775 Lux 74 Tabel XVII. Hasil uji kualitatif aktivitas antibakteri amoksisilin dan isolat ekstrak kacang hijau pada S. aureus ... 76
Tabel XVVIII. Hasil deteksi secara fisik dan identifikasi golongan senyawa menggunakan reagen semprot isolat ekstrak kacang hijau ... 82
xvi
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Reaksi 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil radical (DPPH) dengan
radical scavengers (Marston, 2011) ... 10
Gambar 2. Hasil optimasi fase gerak kromatografi lapis tipis ekstrak kacang hijau ... 48
Gambar 3. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal bebas ekstrak kacang hijau ... 51
Gambar 4. Hasil kromatografi lapis tipis dengan fase gerak klorofom : metanol (7:3 v/v) ... 53
Gambar 5. Hasil identifikasi senyawa dengan reagen pada ekstrak kacang hijau ... 54
Gambar 6. Contoh reaksi AlCl3 membentuk kompleks flouresensi dengan
flavonoid (Jork, Funk, Fischer, Wimmer, 1990) ... 55
Gambar 7. Hasil perbandingan profil kromatografi lapis tipis ekstrak kulit kacang hijau dan keping biji kacang hijau ... 56
Gambar 8. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal bebas ekstrak kulit dan keping biji kacang hijau ... 57
Gambar 9. Grafik optimasi intensitas sinar UV ... 59
xvii
Gambar 11. Hasil uji kualitatif antibakteri ekstrak kacang hijau secara
bioautografi ... 62
Gambar 12. Hasil KLT ekstrak dan hasil triturasi ... 65
Gambar 13. Hasil optimasi fase gerak kromatografi kolom gradien ... 68
Gambar 14. Hasil uji kualitatif penangkapan radikal bebas isolat ekstrak kacang hijau ... 73
Gambar 15. Hasil uji kualitatif UV protection isolat ekstrak kacang hijau pada menit ke 15 ... 75
Gambar 16. Hasil deteksi secara fisik isolat ... 78
Gambar 17. Hasil identifikasi senyawa isolat 1 dengan reagen ... 79
Gambar 18. Hasil identifikasi senyawa isolat 2 dengan reagen ... 80
Gambar 19. Hasil identifikasi senyawa isolat 3 dengan reagen ... 81
xviii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman kacang hijau (Vigna
radiata (L.) R. Wilczek)... 88
Lampiran 2. Gambar kacang hijau yang berasal dari PT. SUPER INDO, dengan batch number : 8-993408-010 ... 89
Lampiran 3. Perhitungan susut pengeringan simplisia kacang hijau ... 91
Lampiran 4. Perhitungan rendemen ekstrak ... 93
Lampiran 5. Perhitungan susut pengeringan ekstrak kacang hijau ... 94
Lampiran 6. Penimbangan ekstrak kacang hijau untuk kromatografi lapis tipis (KLT) ... 96
Lampiran 7. Gambar parameter warna yang digunakan dalam uji kualitatif UV protection ... 97
Lampiran 8. Hasil optimasi intensitas sinar UV ... 98
Lampiran 9. Surat sertifikat hasil uji bakteri ... 99
Lampiran 10. Gambar kontrol media, kontrol pertumbuhan dan kontrol positif uji kualitatif antibakteri ekstrak kacang hijau ... 101
Lampiran 11. Penimbangan ekstrak kacang hijau untuk triturasi ... 102
xix
Lampiran 13. Penimbangan ekstrak kacang hijau dan hasil triturasi untuk kromatografi lapis tipis (KLT) ... 104
Lampiran 14. Penimbangan sampel untuk kromatografi kolom gradien ... 105
Lampiran 15. Gambar kolom yang digunakan dalam kromatografi kolom gradien ekstrak kacang hijau ... 106
Lampiran 16. Hasil kromatografi kolom gradien dengan fase gerak kloroform .. ... 107
Lampiran 17. Penimbangan hasil pemekatan isolat hasil kromatografi kolom gradien ... 110
xx INTISARI
Kacang hijau (Vigna radiata (L.)R.Wilczek) merupakan tanaman pangan yang juga digunakan sebagai bahan dalam kosmetik tradisional, namun efektivitasnya sebagai bahan kosmetik tradisional belum diteliti lebih lanjut. Penelitian ini bertujuan melakukan eksplorasi aktivitas penangkapan radikal bebas, UV protection dan antibakteri.
Kacang hijau diekstraksi dengan etanol 90% v/v, kemudian dipekatkan hingga membentuk ekstrak. Kromatografilapis tipis (KLT) dilakukan pada ekstrak kacang hijau menggunakan fase gerak kloroform : metanol (7:3v/v) dan fase diam
silica gel 60 F254. Selanjutnya ekstrak diuji secara kualitatif terkait aktivitas
penangkapan radikal dengan menggunakan 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl
(DPPH), UV protection dengan metode inhibition of bleaching of β-carotene, dan antibakteri dengan bioautografi kontak.
Senyawa aktif hasil uji kualitatif diisolasi dengan kromatografi kolom, didapatkan 4 isolat. Ekstrak kacang hijau mengandung golongan senyawa meliputi flavonoid, fenolik, dan terpenoid, yang terbagi menjadi 4 isolat. Keempat isolat tersebut memiliki aktivitas penangkap radikal bebas dan UV protection,
sedangkan aktivitas antibakteri hanya dimiliki oleh isolat 3 dan 4.
xxi ABSTRACT
Mung beans (Vigna radiata (L.)R.Wilczek) is a edible plant which is widely used as an ingredient in traditional cosmetics, but its effectiveness as a traditional cosmetic ingredient has not been studied further. The aims of this study are to explore the free radical scavenging activity, UV protection, and antibacterial, of mung beans.
Mung beans extracted with ethanol 90% v/v, then concentrated to form the extract. Extracts of mung beans separated by preparative thin layer chromatography using a mobile phase of chloroform: methanol (7: 3 v/v) and the stationary phase silica gel 60 F254. Extracts tested qualitatively on radical scavenging activity using the 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl(DPPH), UV protection using inhibition of bleaching of β-carotene method, and antibacterial by contact bioautography method.
Active compound, which is obtained from qualitative test, isolated using column chromatography, and by this isolation, 4 isolates obtained. Mung beans extract contains a group of compounds such as flavonoids, phenolics, and terpenoids, which are divided into 4 isolates. All four isolates have free radicals scavengers activity and UV protection, while the antibacterial activity present on isolates 3 and 4.
1 BAB I PENGANTAR
A. Latar Belakang
Kosmetik saat ini sudah menjadi kebutuhan pokok dalam kehidupan manusia sebagai penunjang penampilan. Ada berbagai bentuk kosmetik seperti kosmetik pembersih, pelembab, pelindung dan juga dekoratif. Semakin berkembangnya jaman, kosmetik yang bersifat memperbaiki atau menyembuhkan makin populer dipasaran (Tranggono, 2007).
Secara garis besar kosmetik sebagai pengobatan diformulasikan untuk mengatasi kelainan kulit sebagai kosmetik pengobatan untuk mengatasi penuaan kulit (penuaan kulit yang belum waktunya atau penuaan dini) dan kosmetik untuk pengobatan mengatasi kelainan kulit, terutama jerawat dan munculnya noda hitam (hiperpigmentasi) (Tranggono, 2007).
Munculnya slogan back to nature sekarang semakin marak melanda dunia kecantikan, ditandai dengan munculnya produk - produk kosmetik yang menggunakan bahan-bahan alami (tradisional). Produk kosmetik organik diklaim lebih aman bagi kulit maupun bagi lingkungan dan kelebihan lain dari produk kosmetik organik adalah bebas dari zat pewarna, parfum serta pengawet yang dapat menimbulkan alergi pada kulit (Utami, 2013).
agar memanfaatkan potensi alam yang sudah tersedia dalam dunia pengobatan dan kosmetik (Pamungkas, 2010).
Kacang hijau dengan nama latin V. radiata merupakan salah satu contoh tanaman yang digunakan sebagai bahan kosmetik tradisiomal, contohnya seperti masker dan lulur yang sudah tersebar dipasaran. Kacang hijau memiliki bioaktivitas berupa antioksidan, antibakteri, anti-inflamasi, antihipertensi, antitumor, dll (Tang, Dong, Ren, Li, He, 2014). Efek biologis tersebut tentunya mendukung kacang hijau untuk dimanfaatkan menjadi kosmetik. Maka dalam penelitian ini peneliti ingin membuktikan secara ilmiah efek khasiat dari kacang hijau sebagai kosmetik alam atau tradisional, aktivitas yang akan diteliti dalam peneliti ini adalah terkait aktivitas penangkapan radikal bebas sebagai aktivitas penangkal penuaan kulit, aktivitas UV protection sebagai aktivitas penangkal terjadinya hiperpigmentasi kulit, dan aktivitas antibakteri sebagai aktivitas penangkal munculnya jerawat. Menurut Tranggono (2007), ketiga aktivitas tersebut merupakan komponen aktivitas yang berperan penting dalam formulasi kosmetik pengobatan.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang di atas, dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut.
b. Golongan senyawa apa yang bertanggung jawab terhadap aktivitas penangkapan radikal bebas, UV protection dan antibakteri ekstrak kacang hijau ?
2. Keaslian penelitian
Sejauh pengamatan penulis, penelitian mengenai kacang hijau (V. radiata) pernah dilakukan oleh Tang, Dong, Ren, Li, He (2014) melakukan penelitian terkait tinjauan fitokimia, perubahan metabolit, dan penggunaan kacang hijau sebagai obat dan makanan. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kacang hijau memiliki fungsi antioksidan, antimikroba, anti-inflamasi, efek antidiabetes, antihipertensi, antitumor dan antiseptis. Metode analisis antioksidan yang digunakan metode DPPH dan untuk metode uji antimikroba digunakan metode difusi agar.
Penelitian lain tentang kacang hijau pernah dilakukan oleh Anwar, Latif, Przybylski, Sultana, Ashraf (2007) menentukan komposisi kimia dan aktivitas antioksidan dari berbagai benih kacang hijau. Menunjukkan bahwa kacang hijau adalah sumber asam lemak, mineral, dan tokoferol yang baik. Selain itu, peneliti melakukan penelitian terkait aktivitas antioksidan dan penentuan total phenolic contents (TPC), hasil penelitian aktivitas antioksidan menunjukkan bahwa kacang hijau memiliki aktivitas antioksidan.
digunakan adalah menggunakan metode difusi sumuran agar dengan menggunakan bakteri patogen pada makanan seperti Escherichia coli, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris and Streptococcus faecalis. Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah metanol, etil asetat, dan n-heksana. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol memiliki aktivitas antibakteri terhadap hampir semua patogen uji. Tes fitokimia secara kualitatif dan hasil kromatografi lapis tipis ekstrak metanol menunjukkan adanya kandungan glikosida, steroid, fenol, saponin, alkaloid dan flavonoid.
Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah penelitian ini menggunakan kacang hijau dari PT. SUPER INDO. Kemudian proses pembuatan simplisia kacang hijau dilakukan, pembuatan ekstrak etanolik kacang hijau dengan etanol 90% v/v, dilanjutkan dengan melakukan kromatografi lapis tipis (KLT) terhadap ekstrak kacang hijau dengan menggunakan fase gerak yang telah dioptimasi. Selanjutnya, hasil pemisahan kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak kacang hijau tersebut di uji secara kualitatif aktivitas penangkap radikal bebas, UV protection, dan antibakteri. Senyawa aktif hasil uji kualitatif kemudian diisiolasi dengan kromatografi kolom, kemudian isolat senyawa aktif tersebut diuji secara kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas dengan penyemprotan 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH), aktivitas UV protection
3. Manfaat
a. Manfaat teoritis : penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan tentang aktivitas penangkapan radikal bebas, UV protection, dan antibakteri ekstrak kacang hijau secara kualitatif.
b. Manfaat praktis : penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang aktivitas penangkapan radikal bebas, UV protection, dan antibakteri dari ekstrak kacang hijau secara kualitatif sehingga mampu menunjukkan kefektifannya sebagai kosmetik tradisional.
B. Tujuan
1. Tujuan umum
Melakukan uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas, UV
protection dan antibakteri ekstrak kacang hijau sebagai bukti keefektifannya sebagai kosmetik tradisional.
2. Tujuan khusus
a. Mengetahui aktivitas penangakapan radikal bebas, UV protection, dan antibakteri dari isolat senyawa aktif ekstrak kacang hijau secara kualitatif.
6 BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Kacang Hijau (Vigna radiata( L.) R. Wilczek)
1. Klasifikasi tanaman
Menurut United States Department of Agriculture (2014) klasifikasi tanaman kacang hijau, sebagai berikut.
Kingdom : Plantae
Subkingdom : Tracheobionta Superdivision : Spermatophyta Division : Magnoliophyta Class : Magnoliopsida Subclass : Rosidae Order : Fabales Familly : Fabaceae Genus : Vigna
Species : Vigna radiata (L.) R. Wilczek
Nama lain yang dimiliki kacang hijau adalah sebagai berikut. Inggris : mung bean, bean sprouts, green gram, golden gram
Perancis : haricot mungo (Munro dan Small, 1997).
2. Deskripsi tanaman kacang hijau
Kacang hijau merupakan tanaman pendek bercabang tegak. Bagian tubuh dari tanaman kacang hijau, yaitu akar, batang, daun, bunga, buah dan biji. Akar, berakar tunggang. Sistem perakarannya dibagi menjadi dua, yaitu percabangan banyak dan akar dengan sedikit cabang (Purwono, 2012).
Batang, bentuk akar bulat dan berbuku-buku. Berukuran kecil, berbulu, hijau kecoklatan atau kemerahan. Setiap buku batang menghasilkan satu tangkai daun, kecuali pada daun pertama berupa sepasang daun yang saling berhadapan dan masing-masing daun berupa daun tunggal. Ketinggian batang bisa mencapai 1 meter (Purwono, 2012).
Daun, berupa daun majemuk terdiri dari tiga anak daun setiap tangkai. Helaian daun berbentuk oval dengan ujung yang lancip dan berwarna hijau muda hingga hijau tua. Letak daun berseling. Tangkai daun lebih panjang dari daunnya sendiri (Purwono, 2012).
Buah, berbentuk polong. Panjang polong 5 - 16 cm, setiap polong berisi 10 - 15 biji. Polong berbentuk bulat silindris dengan ujung agak runcing atau tumpul. Polong yang masih muda berwarna hijau, setelah tua menjadi menghitam, polongnya memiliki bulu-bulu halus (Purwono, 2012).
Biji, berbentuk bulat, memiliki bobot 0,5 – 0,8 mg, kulitnya hijau berbiji putih (Purwono, 2012).
3. Kandungan kimia kacang hijau
Kandungan dari kacang hijau, yaitu protein, polyphenol, polypeptides, polysaccharides, enzym, peptides, phytosterol, amino acids, flavone, isoflavone,
flavonoids, isoflavonoids (Tang, Dong, Ren, Li, He, 2014).
Selain itu juga kacang hijau merupakan penyedia kandungan fatty acids,
minerals, dan tocopherols (Anwar, Latif, Przybylski, Sultana, Ashraf, 2007). Kacang hijau mengandung isoflavon, yang memiiki struktur kimia hampir sama dengan estrogen, isoflavon sering disebut fitoestrogen atau estrogen nabati
(Iswandari, 2006).
B. Antioksidan
1. Definisi antioksidan
senyawa antioksidan dapat mencegah pengaruh buruk yang disebabkan oleh radikal bebas (Percival, 1998).
Sistem antioksidan dibagi menjadi dua kelompok, yaitu kelompok enzimatik dan bukan enzimatik. Antioksidan enzimatik terdiri dari superoxide dismutase (SOD), catalase dan glutathione peroxidase. Antioksidan bukan enzimatik terdiri dari vitamin E, vitamin A, provitamin A (β-karoten), dan vitamin
C. Antioksidan enzimatik secara alamiah dihasilkan oleh tubuh sedangkan antioksidan bukan enzimatik diperoleh dari luar tubuh (Fouad, 2005).
Berdasarkan cara kerjanya, antioksidan dibagi menjadi antioksidan primer, antioksidan sekunder, dan antioksidan tersier. Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan primer, apabila dapat memberikan atom hidrogen secara cepat kepada senyawa radikal, kemudian radikal antioksidan yang terbentuk segera berubah menjadi senyawa yang lebih stabil (Winarsi, 2007). Antioksidan primer bekerja dengan cara mencegah pembentukan senyawa radikal bebas baru, atau mengubah radikal bebas yang telah terbentuk menjadi molekul yang kurang reaktif (Winarsi, 2007).
Antioksidan tersier bekerja dengan memperbaiki jaringan sel – sel yang sudah rusak akibat radikal bebas (Winarsi, 2007).
2. Metode penangkapan radikal DPPH
Radikal 2, 2- diphenyl-1- picrylhidrazyl (DPPH) memiliki absorpsi
maksimal pada 517nm, yang akan menurun dengan adanya reaksi dengan radikal
scavenger. Perubahan warna yang terjadi dapat diamati dengan menggunakan uji
KLT, pelat KLT hasil elusi yang telah kering akan disemprotkan dengan larutan 0,2%
b/v (DPPH) dalam metanol. Senyawa aktif (free-radical scavenging) nampak dengan
adanya bercak kuning hingga putih dengan latar ungu (Marston, 2011).
Senyawa yang beraksi sebagai penangkal radikal bebas akan mereduksi
DPPH yang dapat diamati dengan adanya perubahan warna DPPH dari meredam
menjadi kuning. Perubahan warna terjadi ketika elektron ganjil dari radikal DPPH
telah berpasangan dengan hidrogen dari senyawa penangkal radikal bebas yang akan
[image:34.595.101.514.245.669.2]membentuk DPPH-H tereduksi (Molyneux, 2004).
Gambar 1. Reaksi 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil radical (DPPH) dengan radical scavengers (Marston, 2011)
C. UV protection
1. Definisi UV protection
UV protection atau tabir surya berfungsi untuk melindungi kulit dari iritasi yang disebabkan oleh sinar ultraviolet, seperti kulit pucat, muncul kemerahan, terkelupas, muncul noda hitam. Dampak dari sinar ultraviolet tidak hanya didapat dari luar ruangan, aktivitas diluar ruangan pun mampu membuat dampak kulit terpapar sinar ultraviolet dari efek pencahayaan lampu, komputer, maupun alat-alat elektronik lainnya (Oktoviana, 2006).
2. Metode inhibition of bleaching of �-carotene
�-karoten merupakan anggota golongan tetraterpen (C40), senyawa ini
mudah menyerap sinar UV secara kuat. β −karoten merupakan antioksidan kuat dan lebih mudah teroksidasi daripada molekul biologis, seperti asam nukleat dan protein (Heinrich, Barnes, Gibbons, Williamson, 2005). Metode �-karoten adalah metode yang digunakan untuk memperkirakan kemampuan relatif dari ekstrak terhadap oksidasi dari asam linoleat yang akan mengoksidasi �-karoten dalam
emulsi. Akibat dari adanya oksidasi oleh asam linoleat ini maka �-karoten akan kehilangan warna karena putusnya ikatan rangkap sehingga terjadi perubahan warna (Miguel, 2010).
Terdapat beberapa macam jenis �-carotenebleaching test,yaitu :
a. Metode inhibition of bleaching of �-carotene
elusi yang telah kering. Perubahan warna pada pelat KLT tersebut dapat terjadi 12 jam pada suhu ruang atau diletakkan dibawah sinar UV 366 nm. Senyawa aktif ditunjukkan dengan bercak kuning hingga jingga pada latar putih (Marston, 2011).
b. Metode inhibition of bleaching of �-carotene induced by autooxidation of linoleic acid
Metode ini menggunakan reagen semprot campuran antara linoleic acid
dalam etanol dan �-karoten dalam kloroform, yang akan disemprotkan pada pelat KLT kering hasil elusi. Setelah dijemur di bawah sinar matahari, aktivitas antioksidan akan ditunjukkan dengan adanya bercak jingga pada latar putih (Marston, 2011).
D. Antibakteri
1. Definisi antibakteri
Antibakteri merupakan substansi yang menghambat atau membunuh bakteri atau mikroorganisme lain (organisme mikrospik termasuk bakteri, jamur, virus, protozoa, riketsia, dll). Secara teknik, istilah antibiotik mengacu pada suatu zat yang dihasilkan oleh mikroorganisme yang menghambat atau membunuh mikroorganisme yang lain (Kee, 1993).
kadar minimum yang diperlukan untuk menghambat pertumbuhan mikroba, dan kadar bunuh minimum (KBM) yaitu kadar minimum yang diperlukan untuk membunuh mikroba (Nugroho, 2012).
2. Metode bioautografi
Metode bioautografi dapat digunakan untuk pengujian aktivitas antibakteri dan antikapang sekaligus mendeteksi golongan senyawa. Bioautografi dibedakan menjadi bioautografi kontak, bioautografi agar overlay, dan bioautografi langsung. Bioautografi kontak dilakukan dengan menempelkan kromatogram pada media padat berisi bakteri uji. Senyawa dengan aktivitas antibakteri ditunjukkan dengan daerah jernih ( Kusumaningtyas, 2008).
Metode bioautografi merupakan suatu metode yang serupa dengan metode difusi agar. Pada kontak bioautografi, pelat KLT hasil elusi yang telah kering akan ditempatkan pada agar yang telah diinokulasikan bakteri selama beberapa menit atau jam untuk meperkenankan terjadinya proses difusi. Selanjutnya pelat KLT tersebut akan dilepaskan dan dilakukan proses inkubasi agar (Choma dan Grzelak, 2011).
digunakan untuk bioautografi. Area penghambatan kemudian dibandingkan dengan Rf dari bercak pelat KLT acuan (Chomnawang, Surassmo, Wongsariya, Bunyapraphatsara, 2009).
Bioautografi pada pelat kromatografi lapis tipis (KLT) dimaksudkan untuk mendeteksi aktivitas biologi dari sampel yang bermigrasi pada pelat KLT dengan menggunakan fase gerak yang cocok. Metode ini hanya membutuhkan jumlah sampel yang sedikit dan cocok untuk pengujian komponen tanaman dan dapat digunakan untuk mengarahkan target isolasi pada komponen tersebut (Marston, 2011).
3. Metode difusi
Metode difusi merupakan metode penentuan aktivitas didasarkan pada kemampuan difusi dari zat antimikroba dalam lempeng agar yang telah diinokulasikan dengan mikroba uji. Hasil pengamatan berupa ada atau tidaknya zona hambatan yang akan terbentuk disekeliling zat antimikroba pada waktu tertentu masa inkubasi (Brooks, Butel, Carrol, Morse, 2007).
daerah bening yang terbentuk disekeliling kertas cakram yang menunjukkan zona hambat pada pertumbuhan bakteri (Pelczar dan Chan, 1988).
[image:39.595.100.522.206.563.2]Menurut Greenwood cit. Mulyadi, Wuryanti, Ria (2013), respon hambatan pertumbuhan bakteri dapat diklasifikasikan sebagai berikut :
Tabel I. Klasifikasi respon hambatan pertumbuhan bakteri
Diameter zona bening Respon hambatan pertumbuhan
>20 mm Kuat
16-20 mm Sedang
10-15 mm Lemah
<10 mm Kurang efektif
E. Ekstraksi
Ekstraksi merupakan suatu peristiwa perpindahan massa zat aktif yang semula berada di dalam sel kemudian ditarik oleh cairan penyari. Pada umumnya ektraksi akan bertambah baik jika permukaan simplisia yang bersentuhan dengan penyari semakin luas (Harborne, 1987).
Dalam memilih penyari, ada beberapa faktor yang harus dipertimbangkan. Cairan penyari yang baik harus memiliki kriteria berikut ini.
(1) Murah dan mudah diperoleh, (2) stabil secara fisika dan kimia,
(3) tidak mudah menguap dan tidak mudah terbakar, (4) selektif,
(5) tidak mempengaruhi zat berkhasiat, dan
(6) diperbolehkan oleh peraturan yang berlaku (Depkes RI, 1986).
Metode penyarian yang digunakan tergantung dari wujud dan kandungan zat dari bahan yang disari. Cara penyarian dapat dibedakan menjadi: infundasi, maserasi, perkolasi, dan penyarian yang berkesinambungan (Depkes RI, 1986).
F. Kromatografi
1. Definisi kromatografi lapis tipis (KLT)
Kromatografi merupakan proses pemisahan yang mana analit-analit dalam sampel terdistribusi antara 2 fase, yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam berupa bahan padat ataupun porus dalam bentuk molekul kecil, atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan dalam dinding kolom. Dalam kromatografi cair, fase gerak yang digunakan selalu cair (Rohman, 2009).
Kromatografi lapis tipis (KLT) terdiri atas fase diam dan fase gerak. Fase diamnya berupa lapisan seragam (uniform) pada permukaan bidang datar yang didukung oleh lempeng kaca, pelat aluminium, atau pelat plastik. Penjerap yang paling sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa. (Rohman, 2009). Fase gerak kromatografi lapis tipis digunakan sebagai pelarut pengembang yang akan bergerak sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik (ascending), atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun (descending) (Gandjar dan Rohman, 2007). Mekanisme sorpsi-desorpsi yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi (Rohman, 2007).
Perlu adanya optimasi fase gerak dalam kromatografi lapis tipis. Sistem yang paling sederhana menggunakan 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini mudah diatur sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal.
1) Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang tinggi, karena KLT merupakan teknik yang sensitif
2) Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf solut terletak diantara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan
3) Pemisahan dengan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut sehingga menentukan nilai Rf
4) Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik menggunakan campuran pelarut sebagai fase gerak seperti campuran air dan methanol dengan perbandingan tertentu (Rohman, 2009).
Perlu adanya deteksi terhadap bercak hasil pemisahan KLT, karena pada umumnya bercak pemisahan KLT tidak berwarna. Deteksi secara kimia yang biasa digunakan dengan menggunakan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan sehingga bercak terlihat jelas. Deteksi secara fisika dapat dilakukan dengan menampakkan bercak dengan fluoresensi dibawah sinar ultraviolet, untuk senyawa yang dapat berfluoresensi akan membuat bercak terlihat lebih jelas.
Berikut ini adalah cara-cara kimiawi mendeteksi bercak hasil pemisahan KLT:
bercak yang gelap atau bercak yang berflouresensi terang pada dasar yang berflouresensi seragam
3) Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat lalu dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan nampak sebagai bercak hitam sampai kecoklatan
4) Memaparkan lempeng dengan uap iodium dalam chamber tertutup.
5) Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer (Rohman, 2009).
Kromatografi lapis tipis (KLT) bila dikombinasikan dengan metode deteksi biologis dan kimia, merupakan teknik yang efektif dan tidak mahal untuk pengujian ekstrak tanaman. Kombinasi KLT dengan metode deteksi biologi, dikenal sebagai KLT bioautografi (Marston, 2011).
KLT umumnya digunakan untuk menentukan komponen dalam campuran, identifikasi senyawa, memantau berjalannya reaksi, menentukan efektifitas pemurnian, menentukan kondisi yang sesuai dan memantau kromatografi kolom, melakukan screening untuk obat (Gandjar dan Rohman, 2007).
2. Kromatografi kolom
Dalam melakukan kromatografi kolom, kolom kaca vertikal diisi merata dengan adsorben dalam jumlah yang tepat. Selanjutnya, desorben dituangkan ke dalam kolom dan melewati adsorben. Masing-masing senyawa dijerap pada ketinggian yang berbeda tergantung pada afinitas adsorpsi tiap komponen. Pada tahap ini, bagian komponen yang telah diserap masih belum benar-benar terpisah. Namun, jika desorben sesuai dituangkan ke dalam kolom, komponen yang telah dijerap pada adsorben larut dalam desorben dan mulai bergerak ke bawah dalam kolom. Setiap komponen bergerak menuju bagian bawah kolom, tingkat migrasi tiap komponen berbeda, sesuai dengan afinitas adsorpsi setiap komponen. Komponen di lapisan bawah bergerak lebih cepat, dan pada akhirnya, masing-masing komponen akan dipisahkan secara jelas (Lazo, 1999).
Jika bahan yang dipisahkan merupakan campuran pigmen, akan ada zona berwarna di ketinggian yang berbeda pada kolom yang diisi dengan adsorben. Zona berwarna disebut kromatogram (Lazo, 1999).
Tanpa melepas adsorben dari kolom, desorben dituangkan berturut-turut dari atas. Masing-masing zona yang dielusi dengan desorben akan larut ke dalamnya dan menetes ke bawah kolom satu per satu. Cairan kemudian dapat dikumpulkan dari bagian bawah kolom saat mereka menetes keluar (Lazo, 1999).
dipisahkan. Pelarut harus mempunyai kemurnian yang tinggi. Keberadaan pengganggu seperti air, alkohol, atau asam pada pelarut yang kurang polar akan mengganggu aktivitas adsorben (Braithwaite and Smith, 1995).
G. Landasan Teori
Kacang hijau dengan nama latin Vigna radiata (L.) R.Wilczek merupakan tanaman pendek bercabang tegak tersusun atas akar, batang, daun, bunga, buah dan biji.
Berdasarkan penelitian Anwar, Latif, Przybylski, Sultana, Ashraf (2007), kacang hijau merupakan sumber asam lemak, mineral, dan tokoferol. Penelitian yang dilakukan oleh Tang, Dong, Ren, Li, He (2014), menunjukkan bahwa kacang hijau memiliki beberapa metabolit sekunder, yaitu polyphenol, polypeptides, polysaccharides, enzym, phytosterol. Metabolit sekunder tersebut berdampak pada bioaktivitas kacang hijau, yaitu aktivitas antioksidan, antibakteri, anti-inflamasi, antidiabetes, antihipertensi, antitumor dan antiseptis.
H. Hipotesis Hipotesis dalam penelitian ini, yaitu :
22 BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksploratif .
B. Bahan dan Materi Penelitian
1. Bahan penelitian
a. Bahan utama berupa kacang hijau (Vigna radiata (L.) R. Wilczek) yang berasal dari PT. SUPER INDO, dengan batch number: 8-993408-010226. b. Bahan kimia yang digunakan meliputi DPPH pro analitik dan β-karoten pro analitik yang diperoleh dari Sigma Chem. Co., USA. Etanol, n-heksana, kloroform, metanol, asam sulfat, barium klorida, NaCl pro analitik yang diperoleh dari Merck, Germany. Akuades yang diperoleh dari Brataco Chemica. Reagen Dragendorff, AlCl3, FeCl3, sitroborat, vanilin sulfat
diperoleh dari Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Universitas Sanata Dharma. Silika gel 60 F254 for thin layer chromatography dan silika gel 60
(0,040-0,063 mm) for column chromatography dari Merck, Germany. Bakteri
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli yang berasal dari. Laboratorium Balai Kesehatan Yogyakarta. Amoksisilin diperoleh dari PT. Indofarma. Media agar yang digunakan trypticasein soy broth (TSB) dari Agarindo
2. Alat penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini berupa micro haematocrit tubes, light meter (Lutron), lampu UV 254 nm, lampu UV 366 nm, sentrifuge,
vortex (junke & kunkel), mikropipet 10-1000 μL; 1-10 mL (Socorex), neraca analitik (Scaltec SBC 22, BP 160P), vacuum rotary evaporator (Buchi), blender, kertas saring, tabung reaksi bertutup dan alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki), frezzer, Autoclave (YX-400Z), oven (WTB binder).
C. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi sampel
Determinasi biji kacang hijau dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta. Determinasi sampel ini memastikan bahwa sampel yang digunakan untuk penelitian benar-benar kacang hijau (Vigna radiata (L.) R. Wilczek).
2. Pengumpulan dan penyiapan bahan a. Pengumpulan bahan
Kacang hijau yang digunakan diperoleh dari PT. SUPER INDO. Bagian yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji kacang hijau.
b. Sortasi basah
bagian dari tanaman lain (tangkai, daun, bunga dan biji inang), bahan yang rusak dan lain-lain.
c. Pencucian
Biji kacang hijau dicuci dengan cara menggunakan air mengalir sambil dibersihkan kotoran yang melekat pada biji kacang hijau. Pencucian ini dilakukan sebanyak 3 kali.
d. Pengeringan
Biji kacang hijau yang masih basah dikeringanginkan dengan cara pengeringan adalah bahan dihamparkan di atas tampah secara merata dan ditutup dengan kain hitam yang diberi sedikit ruang sirkulasi udara dibawah sinar matahari. Akhir pengeringan ditandai dengan warna kacang hijau menjadi lebih gelap dari sebelum dijemur.
e. Sortasi kering
Biji kacang hijau yang sudah kering dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti tanah, kerikil, bahan yang rusak dan lain-lain.
f. Penyerbukan
Biji kacang hijau dibuat menjadi serbuk dengan menggunakan blender. g. Pengepakan dan penyimpanan
h. Susut pengeringan simplisia kacang hijau
Bobot tetap dilakukan terhadap cawan petri yang akan digunakan, oven disiapkan dengan suhu 105°C, selama 60 menit. Setelah didapatkan bobot tetap petri, ditimbang 1 g serbuk simplisia kacang hijau dan direplikasi 3 kali. Cawan berisi serbuk simplisia kacang hijau tersebut kemudian dipanaskan dalam oven dengan suhu 105°C hingga diperoleh bobot tetap.
i. Penyiapan simplisia kulit dan keping biji kacang hijau
Kacang hijau yang digunakan diperoleh dari PT. SUPER INDO. Tahap penyiapan simplisia dilakukan sama dengan tahap pembuatan simplisia pada biji kacang hijau, yang dibedakan adalah adanya tahap pemisahan antara kulit kacang dengan keping biji kacang hijau. Kemudian kulit dan keping biji kacang hijau tersebut dilakukan pengeringan, sortasi basah, penyerbukan, penyimpanan dan pengepakan seperti tahap pembuatan simplisia kacang hijau.
3. Ektraksi
a. Ekstraksi kacang hijau
Biji kacang hijau yang telah menjadi serbuk ditimbang sebanyak 1,0 kg dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi, ditambah pelarut pertama, yaitu etanol 90% v/v sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama satu hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan dengan menguapkan dengan rotary evaporator, diuapkan hingga menjadi ekstrak kental.
b. Ektraksi kulit dan keping biji kacang hijau
Simplisia kulit dan keping biji kacang hijau yang telah diserbuk ditimbang masing-masing 100 g dan dimasukkan ke dalam bejana maserasi, ditambah yaitu etanol 90% v/v sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen. Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama satu hari. Filtrat diperoleh melalui penyaringan dengan menguapkan dengan rotary evaporator, diuapkan hingga menjadi ekstrak kental.
c. Susut pengeringan ekstrak kacang hijau
Tiga cawan petri disiapkan, ditimbang dan dipanaskan dahulu hingga bobot tetap pada oven dengan suhu 105°C. Silika yang telah dihaluskan disiapkan, kemudian dipanaskan dahulu dalam oven. Saat 3 cawan petri mencapai bobot tetap, ekstrak ditimbang ± 0,5 g (replikasi 3 kali) dan masing-masing cawan berisi ekstrak tersebut ditambahkan ± 0,5 g silika. Ketiga cawan petri tersebut kemudian dimasukkan dalam oven bersuhu 50°C, hingga bobot tetap (selisih kadar air 0,25% b/b). Saat kadar air ekstrak lebih dari 10% b/b, ekstrak dimasukkan dalam desikator dengan menggunakan batu gamping. d. Pemerian ekstrak kacang hijau
Ekstrak kacang hijau diamati warna, bau, bentuk dan rasa.
4. Kromatografi lapis tipis ekstrak kacang hijau a. Preparasi sampel
b. Optimasi fase gerak
Sampel ekstrak kacang hijau ditotolkan pada pelat KLT dengan jarak elusi 5 cm (Wolf, 2012) dengan menggunakan pipa kapiler (3 spot penotolan untuk 3 fase gerak), kemudian dielusi dengan 3 jenis fase gerak, yang dipilih sesuai dengan acuan Wagner dan Bladt (1996), sebagai berikut.:
1) Fase gerak nonpolar = n-heksana : etil asetat (2:3 v/v) 2) Fase gerak semipolar = kloroform : metanol (7:3 v/v)
3) Fase gerak polar = etil asetat : asam formiat : asam asetat glasial : air (100:11:11:20 v/v)
c. Deteksi secara fisik
Pelat KLT hasil elusi dikeringkan pada suhu ruang, kemudian pelat KLT tersebut dideteksi menggunakan lampu UV 254 nm, hasil elusi dari ketiga fase gerak tersebut kemudian dibandingkan dan dihitung nilai Rf hasil elusi.
5. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas ekstrak kacang hijau
a. Preparasi pereaksi semprot DPPH
Pereaksi DPPH dibuat 0,2% b/v dalam pelarut metanol, disimpan dalam wadah gelap dan tertutup (Marston, 2011).
6. Identifikasi senyawa pada ekstrak kacang hijau dengan reagen semprot
a. Preparasi sampel
Lima mg ekstrak kacang hijau, dilarutkan dalam masing-masing dalam etanol p.a 1 mL, kemudian dielusi dengan fase gerak optimum.
b. Identifikasi senyawa dengan reagen semprot
Pelat KLT hasil elusi disiapkan untuk diidentifikasi senyawa dengan menggunakan beberapa reagen semprot diantaranya yaitu, reagen Dragendorff, AlCl3, FeCl3, sitroborat, vanilin sulfat, kemudian diamati dan
dihitung nilai Rf dari bercak yang terbentuk.
7. Uji perbandingan profil kromatografi lapis tipis (KLT) ekstrak kacang hijau, ekstrak kulit kacang hijau, dan keping biji kacang hijau
a. Preparasi sampel
Lima mg ekstrak kacang hijau, kulit kacang hijau dan 5 mg ekstrak keping biji kacang hijau dilarutkan dalam masing-masing dalam etanol p.a 1 mL.
b. Kromatografi lapis tipis ekstrak kulit dan keping biji kacang hijau
8. Uji kualitatif aktivitas UV protection ekstrak kacang hijau a. Preparasi pereaksi � −karoten
Pereaksi � −karoten dibuat 0,05% b/v dalam pelarut kloroform, disimpan dalam wadah gelap dan tertutup (Marston, 2011).
b. Optimasi intensitas cahaya flouresensi
Pelat KLT kosong (tanpa elusi) disiapkan, kemudian pelat tersebut dicelupkan dalam pereaksi � −karoten dan warnanya diukur dengan parameter warna. Pelat tersebut kemudian disinari dengan menggunakan lampu UV dalam kotak flouresensi, perubahan warna yang terjadi diukur dengan parameter warna pada tiap menit ke 1, 3, 6, 9, dan 15. Posisi dari lampu UV diatur dalam posisi tinggi (100 cm), sedang (50 cm), rendah (35 cm) dan dihitung intensitas cahaya dengan alat light meter. Tiap posisi lampu dilakukan uji dengan replikasi 5 kali. Perubahan warna yang terjadi dihitung rata-rata dan SD.
c. Uji kualitatif UV protection (� −karoten bleaching test)
Pelat KLT hasil elusi yang telah kering dicelupkan dalam pereaksi
� −karoten, sebelum dimasukan dalam kotak flouresensi warna pelat KLT
9. Uji kualitatif aktivitas antibakteri ekstrak kacang hijau a. Pembuatan media TSB cair
Tiga g media TSB (30g/L) dilarutkan dalam 100 mL aquadest, diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen, kemudian media tersebut diautoclave.
b. Pembuatan media agar
Tiga g media TSB (30g/L) ditambahkan 1,2% agar dilarutkan dalam 100 mL aquadest, diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen, kemudian media tersebut diautoclave.
c. Pembuatan larutan Mc-Farland 0,5 (1,6 x 108 CFU)
Larutan Barium klorida 1,175% (b/v) 0,05 mL ditambahkan dengan 9,95 mL larutan 1% (b/v) asam sulfat (Schwalbe, Moore, Goodwin, 2007).
d. Pembuatan saline water 0,9% b/v
NaCl 0,9 g ditimbang dan dilarutan dalam 100 mL aquadest. e. Preparasi bakteri uji
Bakteri uji yang digunakan adalah E.coli atau S.aureus. Kultur bakteri induk dari media miring diambil 1 ose dan dikulturkan pada media TSB cair, diinkubasi selama 18 jam.
f. Pembuatan larutan induk bakteri
larutan standar Mc Farland 0,5 (konsentrasi mikroba 1,6 x 108 CFU/mL) dengan penambahan bakteri uji.
g. Penyimpanan kultur bakteri
Sisa kultur bakteri yang belum digunakan untuk diuji, 0,5 mL diambil dan dimasukkan dalam microtube. Gliserol 5% v/v ditambahkan dari 0,5 mL kultur bakteri yaitu 25 x 10-3 mL pada masing-masing microtube, dihomogenkan, diinkubasi selama 1 jam dalam inkubator bersuhu 37°C. disimpan dalam frezzer.
h. Pembuatan kontrol kontaminasi media
Media agar sebanyak 15 mL diambil, dituang ke dalam petri steril secara
pour plate, dibiarkan memadat, diinkubasi selama 18 jam dan dibandingkan dengan perlakuan.
i. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji
Media agar TSB sebanyak 15 mL diambil dalam tabung, dibiarkan memadat. 100 µL bakteri diinokulasikan secara spreading. Inkubasi selama 18 jam dan dibandingkan dengan perlakuan.
j. Pembuatan kontrol positif
d. KLT ekstrak kacang hijau
Pelat KLT dan 5 mg/mL ekstrak kacang hijau dalam etanol disiapkan untuk ditotolkan sebanyak 75;100;150 µg dengan menggunakan mikropipet, dielusi dengan fase gerak kloroform:metanol (7:3 v/v), pelat tersebut kemudian dikeringkan pada suhu ruang (dibuat 2 kali replikasi sebagai acuan dan sebagai pelat uji bioautografi).
e. Bioautografi
Pelat KLT hasil elusi yang telah kering, metode kontak dilakukan dengan media agar yang telah diinokulasikan bakteri 100 µL secara spreading, metode kontak dilakukan selama 40 menit, kemudian pelat KLT tersebut diangkat Inkubasi selama 18 jam, hasil positif ditandai dengan adanya zona hambat pada media tersebut.
10. Triturasi
a. Preparasi sampel triturasi
Ekstrak kacang hijau ditimbang 5 g, dicampurkan dan dihomogenkan dengan 5 g sea sand yang telah dibersihkan, ditambahkan sedikit metanol, dan didiamkan selama satu malam.
b. Triturasi dengan pelarut n-heksana
Hasil campuran sea sand dengan ekstrak kacang hijau kemudian ditambahkan n-heksana 5 mL, divorteks, disentrifugasi, pelarut kemudian diambil dan disaring. Penambahan n-heksana pada solut (campuran sea sand
dipekatkan sebagai hasil triturasi n-heksana. Campuran sea sand dan ekstrak kemudian dikeringkan dari n-heksana pada suhu ruang selama 1 jam.
c. Triturasi dengan pelarut kloroform : metanol (7:3 v/v)
Campuran sea sand dan ekstrak yang telah kering kemudian ditambahkan 5 mL kloroform : metanol (7:3 v/v), divorteks, disentrifugasi, pelarutkemudian diambil dan disaring. Penambahan n-heksana pada solut (campuran sea sand
dan ekstrak), divorteks, disentrifugasi, bagian pelarut diambil dan disaring, diulangi 2-5 kali hingga pelarut menjadi bening. Pelarut tersebut kemudian dipekatkan sebagai hasil triturasi kloroform : metanol (7:3 v/v). Campuran sea sand dan ekstrak kemudian disimpan.
d. Uji Kromatografi lapis tipis (KLT) hasil triturasi
Ekstrak, hasil triturasi n-heksana, dan hasil triturasi kloroform: metanol (7:3 v/v) disiapkan dalam kadar 5mg/mL dalam etanol. Kemudian ditotolkan dalam pelat KLT masing-masing, dengan jarak elusi 5 cm dengan fase gerak kloroform : metanol (7:3 v/v). Profil KLT dari ketiga kromatogram tersebut diamati dan dideteksi dengan lampu UV 254 nm, 366 nm dan dilakukan pengarangan dengan reagen semprot asam sulfat 5% v/v.
11. Kromatografi kolom
a. Preparasi sampel untuk uji kromatografi lapis tipis
b. Uji kromatogri lapis tipis (KLT) untuk optimasi fase gerak kolom
Hasil preparasi sampel ditotolkan pada pelat KLT, sejumlah 4 totol. Disiapkan 4 fase gerak yaitu: n-heksana : kloroform (50:50 v/v), n-heksana : kloroform (25:75 v/v), kloroform, dan kloroform : metanol (98:2 v/v), kemudian pelat KLT tersebut dielusi dengan fase gerak tersebut dan diamati. c. Preparasi sampel untuk kolom kromatografi
Hasil triturasi n-heksana sebanyak 300 mg ditimbang dan dicampurkan dengan silika gel 60 untuk kolom kromatografi dengan perbandingan 1:1. d. Preparasi kolom kromatografi
Kapas yang akan digunakan dibilas dahulu dengan n-heksana. Kolom kromatografi disiapkan dengan susunan dari bawah yaitu, kapas, silika gel 60 untuk kolom kromatografi sekitar 3 cm, sampel yang telah dicampur dengan silika gel 60 untuk kolom kromatografi sekitar 0,5 cm, silika gel 60 untuk kolom kromatografi 1 cm, dan ditutup dengan kapas.
e. Kromatografi kolom gradien
f. Kromatografi lapis tipis (KLT) untuk konfirmasi hasil kromatografi kolom gradien
Setiap 2 mL hasil kolom kromatografi dikumpulkan, KLT dilakukan dan diamati profil KLT nya. Profil KLT hasil kolom kromatografi yang sama disatukan, kemudian dipekatkan dan dihitung rendemen hasil.
g. Penyimpanan isolat
Isolat hasil pemekatan dilarutkan mengguanakan pelarut yang sesuai dengan konsentrasi 1 mg/100 µL, kemudian dipekatkan dan disimpan dalam
freezer.
12. Uji kualitatif aktivitas penangkapan radikal bebas isolat senyawa ekstrak kacang hijau
a. Preparasi sampel
Isolat ekstrak kacang hijau disiapkan dengan konsentrasi masing-masing 1mg/mL dengan menggunakan pelarut yang sesuai.
b. Kromatografi lapis tipis (KLT) isolat senyawa ekstrak kacang hijau Sampel isolat di totolkan pada pelat kromatografi lapis tipis (KLT) masing-masing isolat 10; 20; 30 µL, sehingga diperoleh mass loading, yaitu 10; 20; 30 µg pada pelat KLT tersebut, dielusi dengan jarak elusi 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol (7:3 v/v) dan dikeringkan pada suhu ruang.
c. Uji kualitatif penangkapan radikal bebas
warna pada pelat KLT dari ungu menjadi kuning-putih diamati dan diukur waktu perubahan warnanya.
13. Uji kualitatif aktivitas UV protection isolat senyawa ekstrak kacang hijau
a. Preparasi sampel
Isolat ekstrak kacang hijau disiapkan dengan konsentrasi masing-masing 1mg/mL dengan menggunakan pelarut yang sesuai.
b. Kromatografi lapis tipis (KLT) isolat senyawa ekstrak kacang hijau Sampel isolat di totolkan pada pelat kromatografi lapis tipis (KLT) masing-masing isolat 10; 20; 30 µL, sehingga diperoleh mass loading yaitu 10; 20; 30 µg pada pelat KLT tersebut, dielusi dengan jarak 5 cm menggunakan fase gerak kloroform : metanol (7:3 v/v) dan dikeringkan pada suhu ruang. c. Uji kualitatif UV protection
Pelat KLT hasil elusi yang telah kering dicelupkan dalam pereaksi
� −karoten 0,05% b/v dalam kloroform, sebelum dimasukan dalam kotak
flouresensi warna pelat KLT tersebut diukur dengan menggunakan parameter warna. Pelat KLT tersebut kemudian disinari sinar UV dalam kotak flouresensi hasil optimasi dan dihitung intensitas sinar dengan alat light meter, diamati tiap menit ke 1, 3, 6, 9, dan 15.
14. Uji kualitatif aktivitas antibakteri isolat senyawa ekstrak kacang hijau
a. Preparasi sampel
b. Pembuatan media agar
Media TSB sebanyak 3 g ditambahkan 1,2% b/v agar dilarutkan dalam 100 mL aquadest, diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen, kemudian media tersebut diautoclave.
c. Pembuatan saline water 0,9% b/v
NaCl sebanyak 0,9 g ditimbang dan dilarutan dalam 100 mL aquadest. d. Pembuatan larutan induk bakteri
Bakteri uji yang digunakan adalah S. aureus, disiapkan deret larutan standard Mc Farland. Tabung diisi dengan saline water 10 mL dan setarakan kekeruhannya dengan larutan standar Mc Farland 0,5 (konsentrasi mikroba 1,6. 108 CFU/mL).
e. Pembuatan kontrol kontaminasi media
Media agar sebanyak 15 mL diambil, dituang ke dalam petri steril secara
pour plate, dibiarkan memadat, diinkubasi selama 18 jam dan dibandingkan dengan perlakuan.
f. Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji
Media agar TSB sebanyak 15 mL diambil dalam tabung, dibiarkan memadat. 100 mikroliter bakteri diinokulasikan secara spreading. Inkubasi selama 18 jam dan dibandingkan dengan perlakuan.
g. Pembuatan kontrol positif
5;7,5;10 µg masing-masing ditotolkan dalam paper disc dalam media agar yang telah diinokulasikan bakteri tersebut. Inkubasi selama 18 jam dan dibandingkan dengan perlakuan.
h. Uji kualitatif antibakteri
Isolat dengan konsentrasi 1 mg/mL disiapkan. Paper disc tersebut diisikan isolat senyawa dengan mass loading 50;100;200 µg kemudian dikeringkan pada petri steril, setelah kering diletakkan dalam media berkoloni
S. aureus. Selama 18 jam diinkubasi, hasil positif ditandai dengan adanya zona hambat pada media tersebut.
15. Identifikasi senyawa dari isolat aktif ekstrak kacang hijau a. Kromatografi lapis tipis (KLT) isolat ekstrak kacang hijau
Isolat ekstrak kacang hijau dalam konsentrasi masing-masing 1 mg/mL disiapkan. Tiap isolat ditotolkan 10 µL pada pelat KLT, dielusi dengan jarak elusi 5 cm, menggunakan fase gerak kloroform : metanol (7:3 v/v) dan dikeringkan dalam suhu ruang.
b. Deteksi secara fisik
Pelat KLT hasil elusi dikeringkan pada suhu ruang, kemudian pelat KLT tersebut dideteksi menggunakan lampu UV 254 nm dan 366 nm, hasil elusi kemudian dibandingkan dan dihitung nilai Rf hasil elusi.
c. Indentifikasi senyawa dengan reagen semprot
aluminium chloride (AlCl3), ferric chloride (FeCl3), vanilin sulfat, kemudian
16. Bagan alur penelitian
a. Bagan alur penelitian ekstrak kacang hijau Kacang hijau
Simplisia kacang hijau
Ekstrak kacang hijau
Hasil triturasi n-heksana Uji aktivitas penangkapan
radikal bebas, UV protection
dan antibakteri secara kualitatif
Hasil triturasi Kloroform : metanol (7:3) Isolat
Bercak KLT ekstrak kacang hijau yang aktif
Isolat aktif Uji aktivitas penangkapan radikal
bebas, UV protection dan antibakteri secara kualitatif
Proses pembuatan simplisia Ekstraksi : - Maserasi - Penyaringan - Penguapan - Pemekatan
Kromatografi kolom , dengan step gradien
b. Bagan alur penelitian ekstrak kulit dan keping biji kacang hijau
Kacang hijau
Kulit biji kacang hijau
Keping biji kacang hijau
Simplisia kulit biji kacang hijau
Simplisia keping biji kacang hijau
Ekstrak kulit biji kacang hijau
Ekstrak keping biji kacang hijau
Bagian kacang hijau yang bertanggung jawab terhadap aktivitas penangkapan radikal bebas kacang hijau
Pengupasan kacang hijau
Proses pembuatan simplisia
Ekstraksi
-Kromatografi lapis tipis
42 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil Determinasi Sampel
Determinasi sampel dilakukan dengan tujuan untuk memastikan kebenaran identitas dari sampel yang akan digunakan, sehingga kemungkinan kesalahan dalam pengambilan sampel yang akan digunakan dalam penelitian dapat dihindari. Determinasi sampel dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
B. Hasil Pengumpulan dan Penyiapan Bahan
Kacang hijau yang digunakan diperoleh dari PT. Super Indo dengan
batch number : 8-993408-010226, pemilihan kacang hijau dibeli di supermarket ini didasarkan karena penulis mengalami kesulitan menemukan petani kacang hijau dan kacang hijau dengan kualitas yang bagus dipasaran.
Sortasi basah kemudian dilakukan pada kacang hijau tersebut untuk memisahkan sampel kacang hijau dengan pengganggu seperti tanah, debu, dan kacang hijau yang rusak. Selanjutnya pencucian dengan air mengalir dilakukan untuk menghilangkan kotoran yang melekat di kacang hijau, dilanjutkan dengan pengeringan kacang hijau. Proses pengeringan dilakukan dengan menghamparkan kacang hijau pada tampah dan ditutupi kain hitam yang diberi sedikit ruang sirkulasi udara dibawah sinar matahari, penggunaan kain hitam ini bermaksud agar tidak terjadi kontak langsung dari matahari dan meratakan pemanasan ke kacang hijau. Akhir pengeringan ditandai dengan perubahan warna menjadi lebih gelap dari sebelum dijemur.
Setelah kacang hijau tersebut telah kering dilakukan sortasi kering, untuk menghilangkan pengotor yang mungki mencemari saat proses pengeringan berlangsung. Biji kacang hijau tersebut kemudian diserbuk dan disimpan dalam wadah kedap udara dengan silika penyerap lembab untuk menjaga kelembapan saat penyimpanan serbuk simplisia.
atau sampai berat konstan, yang dinyatakan dalam nilai prosen. Metode susut pengeringan identik dengan kadar air, dalam keadaan apabila bahan tidak mengandung minyak menguap dan sisa pelarut organik menguap. Berdasarkan uji susut pengeringan yang telah dilakukan didapatkan kadar air simplisia kacang hijau yaitu 9,05 % b/b dengan hasil perhitungan terlampir (lampiran 3). Kadar air tersebut sudah sesuai dengan ketentuan kadar air ≤ 10% b/b dalam Keputusan Mentri Kesehatan RI NOMOR : 661/IMENKES/SK/VII/1994 tentang persyaratan obat tradisional.
Dalam penelitian ini pembuatan simplisia kulit kacang hijau dan keping biji kacang hijau juga dilakukan, proses diawali dengan pemisahan kulit kacang hijau dengan isi keping biji kacang hijau. Kulit kacang hijau dan keping bijinya kemudian melewati proses pembuatan simplisia yang sama dengan proses simplisia kacang hijau, diawali dengan sortasi basah, pencucian, pengeringan, sortasi kering, penyerbukan dan penyimpanan menggunakan wadah tertutup yang telah diberi silika penyerap lembab.
C. Hasil Ekstraksi
1. Hasil ekstraksi kacang hijau
Simplisia yang telah diserbuk tersebut kemudian di ekstraksi menggunakan etanol 90% v/v, alasan penggunaan etanol 90% v/v karena berdasarkan ketentuan yang ditetapkan dalam Farmakope Indonesia edisi IV, cairan penyari yang diperbolehkan adalah air, etanol, etanol-air atau eter. Proses penyarian pada industri obat tradisional saat ini masih terbatas pada penggunaan cairan penyari air, etanol atau etanol-air. Selain itu, etanol tergolong pelarut yang cenderung universal digunakan, walaupun polar tetap dapat menyari senyawa-senyawa dengan tingkat kepolaran lebih rendah.
Metode yang digunakan dalam ekstraksi adalah
