PENGARUH MEDIA PENGENCER TERHADAP KUALITAS SPERMATOZOA BEKU SAPI PO
(The Effect of Diluents Media to Frozen-Spermatozoa Quality in PO Cattle)
M.GUNAWAN,F.AFIATI,E.M.KAIIN,S.SAID danB.TAPPA
Puslitbang Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Jl. Raya Bogor Km. 46, Cibinong 16911
ABSTRACT
The purpose of this study is to compare optimum diluents media of spermatozoa in freezing sperm of PO Cattle. Diluents media have been used Tris-egg yolk (TKT, 20% v/v), skim milk-egg yolk (SKT, 10%, v/v), Andro Med (Minitub) and coconut juice-egg yolk (AK-KT, 20% v/v). Frozen spermatozoa PO cattle quality was analyzed based on motility percentage, live cell percentage, abnormality and intact the plasma membrane (MPU). The result of this research showed that sperm motility on diluent media TKT (46,67%) significant different (p< 0,01) with AK-KT (31,12%). MPU persentage on diluent media SKT (31,11) and AK-KT (31,12%) significant different (P<0,01) with Andro Med (18.78). There is no difference on all diluent media to live cell and abnormality percentage. It is concluded that the diluent media TKT, SKT and Andro Med can be used to make freezing process spermatozoa PO cattle with quality suitable for artificial insemination (AI).
Key words: Diluent media, PO cattle, sperm, motility
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan media pengencer spermatozoa yang optimal dalam pembuatan semen beku sapi PO. Media pengencer yang digunakan adalah Tris-kuning telur (TKT, 20% v/v), Susu skim-kuning telur (SKT, 10%, v/v), Andro Med (Minitub) dan air kelapa-kuning telur (AK-KT, 20%
v/v). Kualitas spermatozoa beku sapi PO dianalisis berdasarkan persentase motilitas, persentase sel hidup, abnormalitas dan membran plasma utuh (MPU). Hasil penelitian menunjukkan bahwa motilitas sperma pada media pengencer TKT (46,67%) berbeda sangat nyata (P<0,01) dengan AK-KT (31,12%). Persentase MPU pada media pengencer SKT (31,11) dan AK-KT (31,12) berbeda sangat nyata (P<0,01) dengan Andro Med (18,78). Tidak terdapat perbedaan pada seluruh media pengencer terhadap persentase sel hidup dan abnormalitas. Dapat disimpulkan, bahwa media pengencer TKT, SKT dan Andro Med dapat digunakan dalam proses pembuatan spermatozoa beku sapi PO dengan kualitas yang memenuhi syarat IB.
Kata kunci: Media pengencer, sapi PO, sperma, motilitas
PENDAHULUAN
Tantangan dalam keberhasilan Inseminasi Buatan (IB) di lapangan adalah rendahnya kualitas dan penanganan sperma beku yang digunakan, kondisi reproduksi, manajemen ternak dan ketrampilan inseminator (S
ITUMORANGdan S
ITEPU, 1991 dalam H
ERDIS1998). Standar kualitas semen beku yang baik yang digunakan untuk IB adalah yang sesuai dengan standar SNI 01-4869-1-1998, dimana untuk motilitas sperma setelah thawing ≥40%.
Peningkatan kualitas sperma beku sangat ditentukan oleh pemrosesan spermatozoa dari saat penampungan, pengenceran sampai
dengan dibekukan. Bahan pengencer spermatozoa berfungsi untuk memperbanyak volume, melindungi spermatozoa terhadap cold shock, sumber nutrisi, mencegah pertumbuhan kuman serta mempertahankan tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit (P
ARTODIHARJO, 1992).
Daya tahan hidup spermatozoa dalam
semen yang diencerkan diantaranya
dipengaruhi oleh jenis pengencer yang terdiri
atas pengencer anorganik (bahan kimia seperti
Tris, Na-Sitrat, Na-fosfat dan lain-lain) dan
pengencer organik (bahan alami seperti air
susu, santan kelapa, dan air kelapa) (H
AWK,
1965). Bahan pengencer susu segar dan susu
skim mengandung protein dan glukosa yang digunakan sebagai nutrisi bagi spermatozoa, akan tetapi di dalam protein susu mengandung albumin yang berupa lactenin, suatu zat anti streptococcus pada air susu dan dapat menurunkan kualitas sperma. Untuk menetralkan lactenin harus dipanaskan secara tidak langsung pada suhu 92 sampai 98
0C selama 10 menit (S
ALISBURYdan V
AND
EMARK, 1985). Air kelapa mengandung 4%
bahan padat, yang antara lain mengandung 1- 2% gula berupa sukrosa, glukosa, dan fruktosa (S
ILALAHI, 1972 dalam Q
OMARIAH, 2000).
Penggunaan Tris sebagai pengencer pada pembekuan semen karena memiliki toksisitas rendah dan sistem penyanggah yang baik dengan mempertahankan pH, tekanan osmotik dan keseimbangan elektrolit (A
FFANDIet al.
1998). Pengencer susu, air kelapa dan tris harus ditambahkan kuning telur, karena di dalam kuning telur terdapat lipoprotein dan lesitin yang dapat mengurangi efek cold shock bagi spermatozoa, sehingga mengurangi kerusakan pada saat pengenceran, pendinginan dan pembekuan. Penambahan gliserol pada proses pembuatan semen beku berfungsi untuk menggantikan air bebas di dalam sel dan mengeluarkan elektrolit intraseluler sampai titik konsentrasi yang tak berbahaya selama pembekuan (S
ALISBURYdan V
AND
EMARK, 1985).
Penelitian ini bertujuan untuk membandingkan media pengencer spermatozoa yang optimal dalam pembuatan semen beku sapi PO.
BAHAN DAN METODE Semen
Semen yang digunakan berasal dari semen sapi PO yang berumur empat tahun yang dipelihara di kandang Laboratorium Biologi Sel dan Jaringan, Puslit Bioteknologi–LIPI Cibinong Bogor. Kondisi kualitas semen yang diperoleh selama penelitian ini baik, dengan volume 7–8 ml/ejakulat, konsentrasi 1180–
1610 x 10
6sel/ml, motilitas 80–85%, gerakan massa (++) – (+++) dan abnormalitas < 20%.
Media pengencer
Semen setelah dievaluasi secara makroskopis dan mikroskopis diencerkan dengan media pengencer sebagai berikut:
Pengencer susu skim–kuning telur 10%
(SKT). Susu skim bubuk) ditambah aquabidest 10,42% (w/v) dipasteurisasi pada suhu 95°C selama 10 menit dan setelah didinginkan pada temperatur ruang ditambahkan kuning telur 10% (v/v) dan Penisilin–Streptomisin (Pen- strep) 1% (v/v).
Pengencer Tris–kuning telur 20% (TKT).
Tris (hydroxymethyl) aminomethan (3,09 g), Asam Sitrat (1,73 g), Fruktosa (1,27 g), aquabidest (100 ml), ditambah kuning telur 20% (v/v) dan Pen-step 1% (v/v).
Pengencer Air kelapa–kuning telur 20%
(AK-KT). Air kelapa muda (8 bulan) dari jenis Hibrida dengan pH + 6 dan ditambah kuning telur 20% (v/v) serta Pen-strep 1% (v/v).
Pengencer ini mampu mempertahankan daya hidup spermatozoa selama tiga hari dalam penyimpanan 5°C (A
FIATI, 2002).
Pengencer Andro Med dari Mini tub Jerman. Andro Med terdiri dari aquabidest, fruktosa, glycerol, asam citrate, buffer phospholipid dan antibiotik dengan pengenceran aquabides 1 : 4.
Proses analisis
Sperma sapi PO ditampung dengan vagina buatan kemudian dievaluasi secara makroskopis (volume, bau, warna, kekentalan dan pH) dan mikroskopis (gerakan masa, konsentrasi, motilitas, persentase sel hidup, persentase abnormalitas dan membran plasma utuh MPU). Semen yang telah diketahui volume, konsentrasi, motilitas kemudian dibagi menjadi empat sesuai pengencer yang digunakan dalam penelitian ini (SKT, TKT, AK-KT dan Andro Med). Alur pembuatan sperma beku seperti terlihat pada Gambar 1.
Rumus pengenceran yang dipakai untuk membuat 30 x 10
6sel spermatozoa/0.25 ml adalah:
X = [A x B x M x 0,0083] – A keterangan:
X = Volume pengencer
A = Volume semen
B = Konsentrasi
M = Motilitas
Gambar 1. Diagram alur pembuatan sperma beku
Motilitas spermatozoa dihitung dengan
menggunakan pipet haemocytometer batu merah dan kamar hitung neubaeur. Semen dihisap sampai angka 0,5 kemudian diencerkan dengan larutan NaCl fisiologis sampai tanda 101 (pengenceran 200 kali). Campuran tersebut dikocok secara perlahan membentuk angka delapan agar larutan menjadi homogen.
Sperma yang diam, mundur, bergerak melingkar dan bergerak di tempat dianggap mati.
Persentase motilitas spermatozoa dihitung menggunakan rumus:
M = [(Y – X) / Y] x 100%
keterangan:
X = Spermatozoa mati/non motil Y = Konsentrasi total spermatozoa M = Persentase motilitas
Spermatozoa hidup dihitung dengan mencampur satu tetes semen dengan satu tetes eosin 2% dan dicampur secara merata di atas gelas objek. Selanjutnya dibuat preparat ulas, Sperma sapi PO
A. Sperma + ½ bagian media (TKT/SKT/AK-KT) B. Media + 8% Gliserol
Sperma + Andro Med
Pendinginan 15-30 menit (suhu 5°C)
Pendinginan (suhu 5°C)
Gliserolisasi 30 menit
Filling & Sealing
(1-2 jam)
Quick freezing (10 menit)
Container (minus 196°C)
Thawing
Equilibrasi
spermatozoa yang mati berwarna merah dan yang hidup tidak berwarna. Sedikitnya 100 sel sperma dihitung untuk menentukan persentase spermatozoa hidup.
Abnormalitas spermatozoa diamati dengan membuat preparat ulas pada gelas objek dari satu tetes sperma yang dicampur satu tetes eosin 2%. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop dengan perbesaran 40 kali dan dihitung sampai 100 sel spermatozoa.
Persentase abnormalitas spermatozoa dihitung dengan menggunakan rumus:
A = [P / (P + Q) ] x 100%
keterangan:
A = Persentase abnormalitas spermatozoa P = Jumlah spermatozoa yang abnormal Q = Jumlah spermatozoa yang normal Membran Plasma Utuh (MPU) diamati dengan cara memasukkan sample semen ke dalam larutan hipo-osmotik 0,032 M NaCl (0,179 g NaCl dalam 100 ml akuabides), kemudian diinkubasi selama satu jam pada suhu 37°C. Spermatozoa dengan membran plasma utuh ditandai dengan ekor yang melingkar dan sperma yang rusak ditandai dengan ekor lurus. Evaluasi dilakukan dengan menggunakan mikroskop perbesaran 40 kali, dengan menghitung 100 spermatozoa.
Data yang diperoleh diuji dengan menggunakan uji statistik rancangan acak lengkap (RAL) pola searah dengan empat perlakuan dan setiap perlakuan diulangi enam kali. Apabila dalam uji RAL terdapat berbeda nyata, maka dilanjutkan uji Jarak Berganda Duncan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan Tabel 1, motilitas sperma dalam media pengencer pada saat sebelum pembekuan tidak berbeda nyata dengan nilai 70,83−74,17%, sehingga masih layak diproses menjadi sperma beku, hal ini sesuai pendapat T
OELIHERE(1985) yang menyatakan bahwa motilitas sperma cair yang akan dibekukan adalah ≥70%. Hasil motilitas sperma setelah pembekuan pada pengencer TKT (46,67%) berbeda sangat nyata (P<0,01) dengan pengencer AK-KT (37,50%). Sperma beku dengan pengencer TKT, SKT dan Andro Med menghasilkan motilitas lebih dari 40%, ini
sesuai dengan standar Post Thawing Motility (PTM) minimal 40% (A
NONIMOUS, 2000) sehingga layak digunakan untuk IB.
Penggunaan SKT sebagai pengencer sperma karena didalam susu terdapat glukosa yang dapat dimetabolisme oleh spermatozoa (M
ORGAN, 1953). Pengencer yang dapat mempertahankan osmolaritas sperma adalah dengan unsur utama tris hal ini karena mengandung garam dan asam amino (H
AFEZ, 1993). Pada pengencer komersial Andro Med walaupun tidak terdapat kuning telur akan tetapi terdapat penyanggah phospholipids yang dapat mencegah efek Cold Shock (Minitube, 2002). Motilitas pengencer AK-KT belum memenuhi standar PTM yang kemungkinan disebabkan oleh air kelapa sebagai bahan penyanggah bagi spermatozoa kurang begitu baik (T
OELIHERE, 1985).
Tabel 1. Motilitas spermatozoa sebelum dan sesudah pembekuan dalam media pengencer
Perlakuan Sebelum
pembekuan (%) Setelah pembekuan (%)
TKT 74,17 46,67 a
SKT 72,50 44,17 ab
Andro Med 71,67 44,17 ab
AK-KT 70,83 37,50 b
a,bSuperskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01)
Berdasarkan data pada Tabel 2 menunjukkan
bahwa hasil persentase sel hidup spermatozoa
setelah pembekuan tidak berbeda nyata pada
semua perlakuan. Persentase sel spermatozoa
hidup dengan pengencer SKT menujukkan
hasil tertinggi (50,43%), memenuhi standar
sperma beku yang baik yaitu persentase sel
hidup >50% (T
OELIHERE, 1985). Hasil
persentase sel hidup spermatozoa terendah
terdapat pada pengencer Andro Med. Hal ini
disebabkan oleh proses pencampuran pada
pengencer Andro Med dilakukan satu tahap,
sehingga kontak spermatozoa dengan gliserol
lebih lama dibandingkan pengencer yang
pencampurannya dilakukan dua tahap. Hasil
penelitian ini sesuai dengan pendapat M
ATOS(1992) dalam S
ALAMONdan M
AXWELL(1995)
yang menyatakan bahwa gliserol dapat
memberikan perlindungan terhadap cold shock tetapi dapat menyebabkan kerusakan pada struktur spermatozoa selama proses pembekuan. Perlindungan efektif diperoleh setelah kontak yang singkat dengan spermatozoa, hal ini terjadi karena fungsi gliserol sebagai krioprotektan juga dapat bersifat racun.
Tabel 2. Persentase sel spermatozoa hidup sebelum dan sesudah pembekuan dalam media pengencer
Perlakuan Sebelum pembekuan (%)
Setelah pembekuan (%)
TKT 72,52 44,96
SKT 74,22 50,43
Andro Med 67,40 42,61
AK-KT 64,62 45,88
Dalam penelitian ini nilai persentase abnormalitas spermatozoa pada semua perlakuan media pengencer setelah pembekuan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata.
Persentase abnormalitas tertinggi pada pengencer TKT (8,54%) dan terendah pada pengencer Andro Med (6,84%). Nilai abnormalitas pada penelitian ini masih dalam kisaran normal nilai abnormalitas sperma sapi yaitu 20%. Hal ini sesuai dengan pendapat H
AFEZ(1993) bahwa sapi dengan spermatozoa yang abnormalitasnya melewati 20%
menunjukkan adanya infertilitas atau ketidaksuburan dari pejentan tersebut.
S
ALISBURYdan V
AND
EMARK(1985) menyatakan bahwa abnormalitas ada dua yaitu:
(1) abnormalitas sperma primer, yang meliputi microcephalic, macrochephalic, kepala pendek melebar, kepala sempit memanjang, kepala pyriformis, kepala ganda, ekor ganda, bagian tengah membengkak, ekor melingkar dan pertautan abaksial; (2) abnormalitas sperma sekunder, yang meliputi kepala tanpa ekor, ekor terputus dan akrosom yang terlepas.
Membran plasma utuh sebelum pembekuan tidak memberikan perbedaan yang nyata pada semua media pengencer, tetapi nilai tersebut menurun setelah pencairan kembali. Penurunan ini disebabkan kerusakan membran selama proses pengenceran sampai dengan pembekuan. Nilai persentase MPU spermatozoa setelah pembekuan AK-KT
(31,12%), SKT (31,11%) dan TKT (22,55%) tidak berbeda nyata, tetapi AK-KT dan SKT berbeda sangat nyata (P<0,01) dengan Andro Med. Hal ini disebabkan pada pengencer Andro Med saat pencampuran dengan sperma dilakukan secara langsung sehingga gliserol yang terkandung dalam pengencer tersebut lebih lama kontak dan sifat toksiknya merusak membran plasma (S
ALAMONdan M
AXWELL, 1995). Pengencer AK-KT dan SKT merupakan pengencer yang memenuhi standar kualitas sperma beku yaitu mempunyai nilai MPU diatas 30% (E
VANdan M
AXWELL, 1987).
Tabel 3. Persentase abnormalitas spermatozoa sebelum dan sesudah pembekuan dalam media pengencer
Perlakuan Sebelum pembekuan (%)
Setelah pembekuan (%)
TKT 6,94 8,54
SKT 6,90 7,62
Andro Med 6,21 6,84
AK-KT 8,02 8,19 Tabel 4. Persentase membran plasma utuh (MPU)
spermatozoa sebelum dan sesudah pembekuan dalam media pengencer Perlakuan Sebelum
pembekuan (%)
Setelah pembekuan (%)
TKT 72,68 22,55 ab
SKT 72,93 31,11 a
Andro Med 70,33 18,78 b
AK-KT 55,44 31,12 a
a,bSuperskrip yang berbeda pada kolom yang sama menunjukkan perbedaan yang sangat nyata (P<0,01)
KESIMPULAN DAN SARAN
Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan
bahwa penggunaan media pengencer TKT,
SKT dan Andro Med dapat digunakan dalam
proses pembuatan spermatozoa beku sapi PO
dengan kualitas yang baik setelah di thawing
kembali. Pada media pengencer AK-KT belum
mampu menghasilkan kualitas spermatozoa
beku yang baik akan tetapi dapat sebagai
alternatif media pengencer spermatozoa beku
sapi PO.
DAFTAR PUSTAKA
AFIATI, F. 2002. Kombinasi kuning telur dan air kelapa terhadap daya tahan hidup spermatozoa sapi pembawa kromosom X dan Y. Skripsi.
Universitas Djuanda, Bogor.
AFFANDI,L.,U.UMIYASIH dan K.MA`SUM. 1998.
Evaluasi kualitas semen beku sapi Madura dengan berbagai diluter dan kandungan kuning telur yang berbeda. Pros. Seminar Nasional Peternakan dan Veterinr. Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan Bogor.
ANONIMOUS. 2000. Petunjuk Teknis Pengawasan Mutu Bibit Ternak. Direktorat Pembibitan.
Direktorat Jenderal Peternakan. Departemen Pertanian. Jakarta.
EVANS,G. and W.M.C.MAXWELL. 1987. Salamons Artificial Insemination of Sheep and Goats.
Butterworths. Sidney.
HAFEZ,E.S.E. 1993. Reproduction in Farm Animals.
6th ed. Lea and Febiger. Philadelphia.
HAWK, P.B.,B.L.OSCAR and W.H.SUMMER SON. 1965. Practical Phisiologycal Chemistry. Mc.
Graw Hill Book Compagni. New York.
Toronto London. pp. 1077-1103.
HERDIS. 1998. Metode Pemberian Gliserol dan Lama Ekuilibrasi pada Proses Pembekuan Semen Kerbau Lumpur. Tesis. Program Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.
MORGAN,E.B. 1953. The Metabolism and Fertility of Bovine Spermatozoa in Egg Yolk-Citrate and Milk Diluents. M. S. Thesis. Lousiana State Univ. 1953.
PARTODIHARJO, 1992. Ilmu Reproduksi Hewan.
Mutiara Widya, Cetakan Ketiga, Jakarta.
QOMARIAH. 2000. Pengaruh Kombinasi Kuning Telur Dengan Air Kelapa Terhadap Daya Tahan Hidup dan Abnormalitas Spermatozoa Domba Priangan Pada Penyimpanan 5°C.
Skripsi. Fakultas Peternakan Universitas Padjajaran. Sumedang.
SALAMON,S. and W.M.C.MAXWELL. 1995. Frozen Storage of Ram Semen. Procesing, freezing, thawing and fertility after cervical insemination. Anim. Reprod. Sci. 37: 85-99.
SALISBURY,G.W., dan H.L.VAN DENMARK. 1985.
Fisiologi Reproduksi dan Inseminasi Buatan pada Sapi. Penterjemah PROF. DRS. R.
DJANUAR. Gadjah Mada University Press.
Yogyakarta. pp. 274-302; 314-343; 350-380;
568-586.
TOELIHERE, M.R. 1985. Inseminasi Buatan pada Ternak. Angkasa. Bandung
