LAMPIRAN. Lampiran 1. Daftar Singkatan

(1)

LAMPIRAN

Lampiran 1. Daftar Singkatan

cAMP : COX : DAB :

EGF : GM :

HE : HK ATP : HP : HS : IHK : IL 1β :

K : LR :

M : MS : NM : NO : NOS : OAINS : PA : PAS : PG : PG : PG1 : PG2 : PgE2 : PgI2 : PLN : PLP :

Cyclic Adenosine Mono Phosphate Cyclooxygenase

3,3'-diaminobenzidine Epidermal Growth Factor Glandular Mucosa

Hematoxylin Eosin

Hydrogen Kalium Hydrogen Kalium Adenosine Tri Phosphate Histopatologi

Human Stomach Imunohistokimia Interleukin 1beta Kontrol

Limiting Ridge Mucosa

Mouse Stomach

Non Glandular Mucosa Nitric Oxyde

Nitric Oxyde Sinthase

Obat Anti Inflamasi Non Steroid Patologi Anatomi

Periodic Acid Schiff Prostaglandin Pepsinogen Pepsinogen 1 Pepsinogen 2 Prostaglandin E2 Prostaglandin I2 Perlakuan Lesi Negatif Perlakuan Lesi Positif

(2)

S : SM : TGF α : VIP :

Serosa Sub Mukosa

Transforming Growth Factor alpha Vasoactive Intestinal Peptide

(3)

Lampiran 2. Komposisi pakan tikus

No. Bahan Persentase

1 Jagung 73,943

2 Bungkil 14,505

3 Dedak 6,8

4 Kapur 1,5

5 Tepung tulang 1,263

6 Minyak 1,0

7 Methionin 0,362

8 Lisin 0,31

9 Garam 0,213

10 Vitamin + mineral mix 0,106

(4)

Lampiran 3. Data Pakan Tikus Per- Hari

(5)

Lampiran 4. Metode Pewarnaan Alcian Blue-Periodic Acid Schiff

Metode Pewarnaan Alcian Blue-Periodic Acid Schiff :

1. Perendaman gelas objek dalam xylol I selama 2 menit (deparafinasi).

2. Perendaman dalam xylol II selama 2 menit (deparafinasi).

3. Pembilasan dengan air mengalir.

4. Pembilasan dengan aquades.

5. Perendaman dengan larutan asam asetat glacial (CH₃COOH) 3% selama 3- 5menit.

6. Perendaman dalam pewarna 1% Alcian Blue 8 GX dalam 3% CH3COOH (pH 2,5) selama 15-30 menit.

7. Pembilasan dengan larutan asam asetat glacial (CH3COOH) 3% selama 1- 5 menit.

11. Perendaman dalam asam asetat 1% selama 5 menit.

13. Tahap oksidasi kedalam Periodic Acid 1% selama 5-10menit.

14. Pencucian dengan aquades sebanyak 3 kali, dalam waktu 5 menit untuk satu kali pembilasan.

15. Masukkan kedalam Schiff reagen.

16. Pembilasan dengan air sulfite sebanyak 3 kali dengan campuran larutan:

a. 10% Sodium Bisulfite (NaHSO₃) sebanyak 10ml.

b. 1 N HCl sebanyak 10ml.

c. Aquadestilata sebanyak 200 ml.

ATAU

a. 10% Sodium Bisulfite (NaHSO₃) sebanyak 18ml.

(6)

b. 1 N HCl sebanyak 15ml.

c. Aquadestilata sebanyak 300 ml.

d. Hematoxyllin Mayer 30 detik.

17. Pembilasan dengan air mengalir selama 10-15 menit.

19. Perendaman dalam alkohol 95% selama 10 detik.

20. Perendaman dalam alkohol absolut I selama 1 menit.

21. Pencelupan dalam alkohol absolut II selama 2 menit.

22. Pencelupan dalam xylol I selama 1 menit.

23. Pencelupan dalam xylol II selama 2 menit.

24. Setelah proses pewarnaan selesai, kemudian preparat ditutup dengan cover glass dan diberi label.

25. Hasil: Ab (+) berwarna biru, PAS(+) berwarna merah magenta.

Pewarnaan ini bertujuan untuk melihat struktur organ/sampel, sel mukus dan jenis-jenis sel radang yang hanya jelas terlihat dengan pewarnaan AB-PAS.

(7)

Lampiran 5. Metode Pewarnaan Hematoxylin-Eosin

Metode Pewarnaan Hematoxylin-Eosin

WAKTU TAHAPAN

1. Xylol I 2’ Deparafinisasi

2. Xylol II

3. Alkohol Absolut 4. Alkohol 95%

5. Alkohol 80%

2’

1’

Rehidrasi

6. Cuci dalam air keran 7. Mayer’s Hematoksilin 8. Cuci dalam air keran 9. Lithin Karbonat 10. Cuci dalam air keran 11. Eosin

12. Cuci dalam air ketan

1’

8’

30’’

15’’-30’’

2’

2’-3’

2’

13. Alkohol 95%

14. Alkohol absolut I 15. Alkohol absolute II

10x celupan 10x celupan 2’

Dehidrasi

16. Xylol I 17. Xylol II

1’

2’

Clearing

18. Tutup dengan cover glass

(8)

Lampiran 6. Metode pewarnaan imunohistokimia isoenzim COX-1 dan COX-2

Prosedur pembuatan pulasan immunohistokimia

1. Sediaan dipotong dengan microtome setebal 4 s/d 5 micron 2. Tempelkan pada gelas objek yang telah di coating

3. Panaskan pada hotplate,lalu simpan didalam incubator bersuhu 38-40c semalam 4. Deparafinisasi dengan xylol sebanyak 3kali masing-masing 5 menit

5. Celupkan kedalam ethanol sebanyak 3 kali masing-masing 5 menit 6. Celupkan dalam alcohol 90%,80% dan70% masing-masing 5 menit 7. Cuci dengan air mengalir

8. Masukkan kedalam H2O2 dalam methanol dingin 15 menit 9. Cuci dengan aquadest selama 5 menit

10. Rendam dalam cairan buffer citrate,lalu panaskan didalam microwave 2 kali 5 menit

11. Dinginkan pada suhu ruangan selama 20-30 menit 12. Cuci dengan aquadest

13. Beri pembatas pada sekeliling sediaan dengnan Pap pen 14. Cuci dengan PBS 5 menit

15. Teteskan blocking serum lalu incubasi selama 5-10 menit 16. Cuci dengan PBS(baca protocol pabrikan)

17. Buang sisa pencuci,teteskan primary antibody lalu incubasi selama 60 menit 18. Cuci dengan PBS 2kali masing-masing 5 menit

19. Teteskan secondary antibody, incubasi selama 10-20 menit 20. Cuci dengan PBS 2kali masing-masing 5 menit

21. Teteskan HRP-streptavidin biotin,incubasi selama 10-20 menit 22. Cuci dengan PBS 2kali masing-masing 5 menit

23. Teteskan larutan kromogen DAB,incubasi 5-10 menit 24. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit

25. Counterstain dengan mayer haematoxylin ,incubasi selama 2 menit 26. Cuci dengan air mengalir selama 5-15 menit

27. Dehiddrasi dengan alcohol 70% sampai dengan xylol masing-masing 5 menit 28. Teteskan entelan lalu tutup dengan cover glass.

(9)

Mayers Hamatoxylin

Hamatoxylin……… 0,1 gr Tawas ………. 5 gr Natriumjodat ……….. 0,01 gr Aquadest ……… 100 ml

Campurkan sampai larut,diamkan semalam. Keesokan harinya tambahkan Chloral hydrat ……… 5 gr

Citric acid ……….. 0,1 gr

Campurkan kembali sampai larut, lalu didihkan selama 5 menit.

Eosin phloxin 1%

Eosin 1%

Eosin ……….. 1gr Aquadest ……… 20 ml

Alkohol 96% ………. 80 ml Phloxin 1%

Phloxin ……….. 1 gr Aquadest ………... 20 ml Alkohol ………. 80 ml Eosin 1%... 90 ml Phloxin 1%... 9ml Ethanol ……….. 715ml Asam acetat ………. 3,5ml

Prosedur pembuatan preparat Histopatologi

1. Sediaan dipotong dengan microtom setebal 4 s/d 5 micron 2. Tempelkan potongan pada objekglas, lalu panaskan pada hotplat 3. Deparafinisasi dengan

Xylol 1………. 3 menit Xilol 2.. ………... 3 menit 4. Cuci dengan ethanol, alkohol 90,80%,70% ,masing-masing 20 celup 5. Cuci dengan air mengalir

(10)

6. Rendam dalam hamatoxylin ……….. 5 menit 7. Cuci dengan air mengalir ………... 3 menit 8. Rendam dalam lithium carbonat 0,5% ………. 4 celup 9. Cuci dengan air mengalir

10. Rendam dalam alcohol 70% ……….. 20 celup 11. Rendam dalam Eosin Phloxin 1% ……….. 1 menit 12. Cuci dengan air mengalir ……… 30 celup 13. Rendam dalam alcohol 70%,80%,96% ………... 10-20 celup 14. Rendam dalam Carboxylol 2X ……… 10-20 celup 15. Rendam dalam Xylol 2X ……… 10-20 celup 16. Teteskan Entelan, lalu tutup dengan coverglas

Formula for acid decalcifying agent

Concentrated Hy drochloric acid ………. 15 ml Sodium chloride ………... 75 gr Distilled water ………. 1000 ml Hydrochloric acid ……… 80 ml Formic acid ………. 100 ml Distiled water ………. 1000 ml

Lithiumcarbonate 0.5%

Lithiumcarbonate ……… 0,5 gr Aquadest ……….. 100 ml

Mayer hamatoxylin (Jim Millios)

Hamatoxylin ……… 5 gr Alumuniumamonium sulfate/Tawas ……….. . 50 gr Sodium iodat ……… 1gr Aquadest ……….. 700 ml Glicerol ……… 300 ml Glacial acetic acid ……… 10 ml

(11)

Prosedur pemeriksaan immunohistokimia

1. Sediaan dipotong dengan microtome setebal 4 s/d 5 micron

-Blok paraffin sebaiknya disesuaikan dengan microtome yang kita pakai -Blok paraffin dicari yang ada lesi mukosa

-Blok paraffin harus yang baik dan benar dalam prosesnya 2. Lekatkan pada objekglas yang telah di coating

-Harap diperhatikan penomoran preparat dan nama antiboby -Lama waktu saat dalam waterbath

-Suhu waterbath

3. Keringkan dan panaskan diatas hot plate

-Sebaiknya dalam keadaan kering saat diatas hotplate

-Simpan dalam incubatos 38 s/d 40c semalam agar lebih kuat melekat 4. Deparafinisasi dengan xylol

5. Masukkan dalam ethanol

6 .Masukkan dalam alcohol 90%,80% dan 70%

7. Cuci dengan air mengalir

8. Masukkan dalam H²O² dalam methanol dingin 9. Cuci dengan aquadest

10. Rendam dalam larutan citrate buffer,panaskan dalam microwave 2x 5 menit 11. Dinginkan dalam suhu ruangan 20 s/d 30 menit

12. Cuci dengan aquadest

13. Beri pembatas pada sekeliling sediaan dengan PAP pen 14. Cuci dengan PBS 5 menit

15. Teteskan bloking reagen, incubasi 10 s/d 20 menit -Lihat intruksi manual dari perusahaan

-Harus dicuci PBS tidak ?

16. Teteskan Primary antibody, incubasi 60 menit -Lihat intruksi manual

-Berapa pengenceran yang disarankan -Berapa lama incubasi yang disarankan 17. Cuci dengan PBS 2x 5menit

18. Teteskan secondary antibody(Link),incubasi 10s/d 20 menit

(12)

19. Cuci dengan PBS 2x 5menit

20. Teteskan streptavidin biotin, incubasi 10 s/d 20 menit 21. Cuci dengan PBS 2x 5menit

22. Teteskan DAB incubasi 5 s/d 10 menit 23 .Cuci dengan air mengalir 5 menit

24.Counterstain dengan mayers haematoxilin 2 s/d 3 menit 25.Cuci dengan air mengalir

26.Dehydrasi dengan alcohol 70% s/d xylol 27.Mounting

Citrat buffer (10 mM citric acid pH 6.0 ) Citric acid (anhydrous)………...1.92 g Aquadest ………..…1000 ml

Sodium citrate buffer ( 10mM sodium citrate pH6.0 ) Tri-sodium citrate (dihydrat ) ……….2.94 g Aquadest ………1000 ml

Phosphate Bufferd Saline (PBS)

Na2HPO4 ……….1,92 gr NaH2PO4………..0,92 gr NaCL ………5,90 gr Aquadest ………..1000 ml

Mayers Hamatoxylin

Hamatoxylin ………..…..1 gr Natrium jodat ………...0,2 gr Tawas ………...50 gr Aquadest ………..1000 ml Campurkan dan aduk sampai larut,lalu biarkan semalam.

Keesokan harinya tambahkan :

Chloral hydrat ………50 gr

(13)

Asam citrate ………1 gr Diaduk sampai larut, lalu didihkan selama 5 menit Sebelum dipakai harus disaring

Proses jaringan dengan alat Tissue Processor

 Alkohol 70% ……… 1jam

 Alkohol 80% ……… 1 jam

 Alkohol 95% ……… 1 jan

 Alkohol 95% ……… 1 jam

 Ethanon ……… 1 jam

 Ethanol ………. 1,5 jam

 Ethanol+Xylol ………. 1 jam

 Xilol 1 ………. 1 jam

 Xilol 2 ………...1 jam

 Parafin 1 ……….. 1,5 jam

 Parafin 2 sisa waktu

(14)

Lampiran 7. Analisa Statistik Hasil Penelitian

Perhitungan statistik sel radang Antrum/Pilorus.

Anova untuk sel radang (Antrum/Pilorus)

ANOVA Sel radang

44152.997 2 22076.499 19.696 .000

17933.950 16 1120.872

62086.947 18

Between Groups Within Groups Total

Sum of

Squares df Mean Square F Sig.

Uji Duncan untuk sel radang (Antrum/Pilorus)

Sel radang Duncan^a,b

10 45.4000

5 118.2000

4 161.2500

1.000 1.000 1.000

Lesi mukosa Kontrol Negatif Positif Sig.

N 1 2 3

Subset f or alpha = .05

Means f or groups in homogeneous subsets are display ed.

Uses Harmonic Mean Sample Size = 5.455.

a.

The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Ty pe I error lev els are not

guaranteed.

b.

Perhitungan statistik sel mukus regio Antrum/Pilorus

Anova untuk sel mukus (Antrum/Pilorus)

ANOVA Sel goblet

108877.9 2 54438.958 9.149 .004

71402.083 12 5950.174

180280.0 14

Sum of

Uji Duncan untuk sel mukus (Antrum/Pilorus)

(15)

Sel goblet Duncan^a,b

6 11.6667

5 163.0000

4 206.2500

1.000 .399

Lesi mukosa Kontrol Negatif Positif Sig.

N 1 2

Means f or groups in homogeneous subset s are display ed.

a.

The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Ty pe I error lev els are not guaranteed.

b.

Perhitungan statistik sel parietal regio Antrum/Pilorus

Anova untuk sel parietal (Antrum/Pilorus)

ANOVA Sel parietal

31.121 2 15.561 .721 .501

345.300 16 21.581

376.421 18

Sum of

Uji Duncan untuk sel parietal (Antrum/Pilorus)

Sel pari etal Duncan^a,b

4 5.0000

5 7.4000

10 8.3000

.283 Lesi mukosa

Positif Negatif Kontrol Sig.

N 1

Subset f or alpha

= .05

Uses Harm onic Mean Sample Size = 5.455.

a.

b.

(16)

45.40 29.33 9.27

11.67 3.50 1.43

8.30 5.85 1.85

316.50 81.93 25.91

7.33 1.86 .76

118.20 27.96 12.50

163.00 120.29 53.79

7.40 1.67 .75

319.20 26.95 12.05

78.00 19.67 8.80

161.25 48.53 24.27

206.25 67.00 33.50

5.00 2.94 1.47

322.50 89.53 44.77

102.00 39.30 19.65

Sel radang Sel goblet Sel parietal Sel chief Sel kelenjar aktif Kontrol

Sel radang Sel goblet Sel parietal Sel chief Sel kelenjar aktif Negatif

Sel radang Sel goblet Sel parietal Sel chief Sel kelenjar aktif Positif

Lesi mukosa

Mean St d Dev iat ion

St andard Error of Mean

Perhitungan statistik sel chief regio Antrum/Pilorus

Anova untuk sel chief (Antrum/Pilorus)

ANOVA Sel chief

106.437 2 53.218 .010 .990

87360.300 16 5460.019

87466.737 18

Sum of

Uji Duncan untuk sel chief (Antrum/Pilorus)

Sel chief Duncan^a,b

10 316.5000 5 319.2000 4 322.5000 .901 Lesi mukosa

Kontrol Negatif Positif Sig.

N 1

Subset f or alpha

= .05

a.

b.

Data Summary

(17)

Perhitungan statistik diameter lambung regio Fundus/Korpus

Perbedaan diameter antara perlakuan lesi positif, perlakuan lesi negatif dan kontrol pada fundus/korpus

ANOVA

4.082 2 2.041 1.333 .290

26.030 17 1.531

30.112 19

.396 2 .198 .463 .637

7.264 17 .427

7.660 19

Between Groups Within Groups Total Diamet er sagital (cm)

Diamet er transf ersal (cm)

Sum of

Uji Duncan untuk diameter sagital dan tranversal pada fundus/korpus

Diameter sagital (cm) Duncan^a,b

2 8.7000

10 9.8700

8 10.2875

.097 Fundus/korpus

lesi negatif Kontrol lesi positif Sig.

N 1

Subset f or alpha

= .05

a.

b.

Diameter transfersal (cm) Duncan^a,b

2 4.3000

10 4.5400

8 4.7500

.362 Fundus/korpus

N 1

Subset f or alpha

= .05

a.

b.

(18)

Perbedaan diameter antara perlakuan lesi positif, perlakuan lesi negatif dan kontrol pada fundus/korpus

ANOVA

.171 2 .086 .049 .953

29.941 17 1.761

30.112 19

.241 2 .121 .276 .762

7.419 17 .436

7.660 19

Sum of

Uji Duncan untuk diameter sagital dan transversal pada fundus/korpus

2 9.7500

10 9.8700

8 10.0250 .782 Fundus/korpus

lesi positif Kontrol lesi negatif Sig.

N 1

Subset f or alpha

= .05

a.

b.

2 4.4000

10 4.5400

8 4.7250

.512 Fundus/korpus

lesi positif Kontrol lesi negatif Sig.

N 1

Subset f or alpha

= .05

a.

b.

(19)

Perhitungan statistik diameter lambung regio Antrum/Pilorus

Perbedaan diameter antara perlakuan lesi positif, perlakuan lesi negatif dan kontrol pada Antrum/Pilorus

ANOVA

5.379 2 2.690 1.849 .188

24.733 17 1.455

30.112 19

1.516 2 .758 2.097 .153

6.144 17 .361

7.660 19

Sum of

Uji Duncan untuk diameter sagital dan tranfersal pada Antrum/Pilorus

5 9.2400

10 9.8700

5 10.7000

.062 Antrum/pilorus

N 1

Subset f or alpha

= .05

a.

b.

5 4.2800

10 4.5400

5 5.0400

.052 Antrum/pilorus

N 1

Subset f or alpha

= .05

a.

b.

(20)

Perhitungan statistik sel radang regio Fundus/Korpus

Anova untuk sel radang (Fundus/korpus)

ANOVA Sel radang

55521.543 2 27760.771 27.546 .000

17132.457 17 1007.792

72654.000 19

Sum of

Uji Duncan untuk sel radang (Fundus/korpus)

Sel radang Duncan^a,b

10 33.2000

7 121.8571

3 165.0000

1.000 1.000 1.000

Lesi mukosa Kontrol Positif Negatif Sig.

N 1 2 3

Means f or groups in homogeneous subsets are display ed.

a.

The group sizes are unequal. The harmonic mean of the group sizes is used. Ty pe I error lev els are not

guaranteed.

b.

Perhitungan statistik sel mukus regio Fundus/Korpus

Anova untuk sel mukus (Fundus/korpus)

ANOVA Sel goblet

136643.6 2 68321.786 11.715 .001

87476.929 15 5831.795

224120.5 17

Sum of

(21)

Uji Duncan untuk sel mukus regio Fundus/Korpus

Sel goblet Duncan^a,b

8 12.2500

7 173.7143

3 213.0000

1.000 .429

Lesi mukosa Kontrol Positif Negatif Sig.

N 1 2

a.

b.

Perhitungan statistik sel Parietal regio Fundus/Korpus

Anova untuk sel parietal (Fundus/korpus)

ANOVA Sel parietal

17245.026 2 8622.513 2.971 .078

49335.524 17 2902.090

66580.550 19

Sum of

Uji Duncan untuk sel parietal (Fundus/Korpus)

Sel pari etal Duncan^a,b

3 197.3333 7 200.1429 10 258.0000 .102 Lesi mukosa

Negatif Positif Kontrol Sig.

N 1

Subset f or alpha

= .05

a.

b.

(22)

Perhitungan statistik sel Chief regio Fundus/Korpus

Anova untuk sel chief (Fundus/korpus)

ANOVA Sel chief

2701.576 2 1350.788 .194 .826

118635.6 17 6978.566

121337.2 19

Sum of

Uji Duncan untuk sel chief (Fundus/Korpus)

Sel chief Duncan^a,b

3 250.6667 7 255.8571 10 277.3000 .633 Lesi mukosa

Negatif Positif Kontrol Sig.

N 1

Subset f or alpha

= .05

a.

b.

(23)

33.20 15.79 4.99

12.25 6.73 2.38

258.00 61.37 19.41

277.30 98.19 31.05

10.50 2.88 1.02

165.00 40.85 23.59

213.00 82.71 47.75

197.33 21.50 12.41

250.67 41.68 24.06

187.00 91.28 52.70

121.86 43.88 16.58

173.71 110.66 41.83

200.14 49.18 18.59

255.86 68.79 26.00

166.14 76.02 28.73

Sel radang Sel goblet Sel parietal Sel chief Sel kelenjar aktif Kontrol

Sel radang Sel goblet Sel parietal Sel chief Sel kelenjar aktif Negatif

Sel radang Sel goblet Sel parietal Sel chief Sel kelenjar aktif Positif

Lesi mukosa

Mean St d Dev iat ion

St andard Error of Mean

LAMPIRAN. Lampiran 1. Daftar Singkatan

LAMPIRAN

Lampiran 1. Daftar Singkatan

Lampiran 2. Komposisi pakan tikus

Lampiran 3. Data Pakan Tikus Per- Hari

Lampiran 4. Metode Pewarnaan Alcian Blue-Periodic Acid Schiff

Lampiran 5. Metode Pewarnaan Hematoxylin-Eosin

Lampiran 6. Metode pewarnaan imunohistokimia isoenzim COX-1 dan COX-2

Lampiran 7. Analisa Statistik Hasil Penelitian

Perhitungan statistik sel radang Antrum/Pilorus.

Perhitungan statistik sel mukus regio Antrum/Pilorus

Perhitungan statistik sel parietal regio Antrum/Pilorus

Perhitungan statistik sel chief regio Antrum/Pilorus

Data Summary

Perhitungan statistik diameter lambung regio Fundus/Korpus

Perhitungan statistik diameter lambung regio Antrum/Pilorus

Perhitungan statistik sel radang regio Fundus/Korpus

Perhitungan statistik sel mukus regio Fundus/Korpus

Perhitungan statistik sel Parietal regio Fundus/Korpus

Perhitungan statistik sel Chief regio Fundus/Korpus

Ringkasan Data