LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA DASAR
KI-3261 METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK
Percobaan 8
INDUKSI -GALAKTOSIDASE
Nama
: Nisrina Rizkia
NIM
: 10510002
Kelompok
: 6
Tanggal Percobaan
: 04 April 2013
Tanggal Laporan
: 11 April 2013
Asisten Praktikum
: Ka Aisyah
LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
INDUKSI -GALAKTOSIDASE I. Tujuan
Menentukan aktivitas enzim -galaktosidase secara kolorimetri.
II. Dasar Teori
Enzim -galaktosidase adalah enzim hidrolase yang berfungsi untuk mempercepat reaksi konversi dari galaktosida menjadi galaktosa, seperti laktosa menjadi monosakarida yaitu galaktosa dan glukosa. Sintesis -galaktosidase dikendalikan oleh sistem pengendalian ekspresi genetik yaitu lac operon. Operon adalah unit DNA genomik yang terdiri dari kluster gen yang berfungsi di bawah kontrol promotor atau suatu sinyal tunggal. Lac operon adalah operon yang mengendalikan ekspresi gen-gen untuk transpor dan metabolisme laktosa.
Aktivitas -galaktosidase dapat ditentukan secara kolorimetri untuk mempelajari ekspresi gen pada sistem lac-operon. ONPG (orto-nitrofenil- -D-galaktopiranosida) digunakan sebagai substrat pengganti laktosa. ONPG adalah senyawa yang tidak berwarna, adanya aktivitas -galaktosidase ditunjukkan dengan adanya warna kuning karena terbentuknya ONP (orto-nitrofenol) dan memiliki serapan maksimum pada 420 nm.
III. Data Pengamatan
Pengukuran Optical Density (OD) pada = 600 nm
Sampel Absorbansi NB 0.53 NB + Laktosa 0.537 NB + Glukosa + Laktosa 0.712 NB + Glukosa 0.414 NB + Sukrosa 0.536 NB + Maltosa 0.535
Absorban dari berbagai media
Sampel
Absorban pada T tertentu ( = 420 nm)
0 10 20 30 40 NB 0.131 0.136 0.355 0.340 0.287 NB + Laktosa 0.043 0.193 0.334 0.120 0.162 NB + Glukosa + Laktosa 0.027 0.202 0.342 0.264 0.379 NB + Glukosa 0.045 0.087 0.123 0.082 0.169 NB + Sukrosa 0.050 0.089 0.210 0.184 0.268 NB + Maltosa 0.083 0.107 0.236 0.237 0.136
IV. Perhitungan dan Pengolahan Data
Aktivitas enzim =
Misal tabung pertama untuk kultur NB dengan waktu inkubasi 10 Aktivitas enzim = = 15.37 menit-1 L-1
Dengan cara yang sama dapat diperoleh hasil sebagai berikut :
Sampel
Aktivitas Enzim (menit-1 L-1)
0 10 20 30 40 NB 0 15.37 20.05 12.80 8.11 NB + Laktosa 0 21.52 18.62 4.46 4.52 NB + Glukosa + Laktosa 0 16.99 14.38 7.40 7.97 NB + Glukosa 0 12.58 8.90 3.95 6.11 NB + Sukrosa 0 9.94 11.73 6.85 7.49 NB + Maltosa 0 11.98 13.21 8.84 3.81 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0 20 40 60 A b sor b an t (menit)
Kurva Absorban Vs Waktu
NB NB+laktosa NB+glukosa+laktosa NB+glukosa NB+sukrosa NB+maltosa
V. Pembahasan
Operon adalah sekumpulan gen yang diapit oleh sepasang terminator dan promoter, produk-produknya memiliki fungsi-fungsi yang berhubungan dan ditranskripsi bersama-sama sebagai suatu kesatuan. Daerah operon adalah daerah yang berperan dalam regulasi ekspresi gen. Contohnya saja operon lac yaitu operon yang mengendalikan kemampuan metabolism laktosa pada bakteri E.Coli. Dalam operon lac terdapat tiga macam gen structural yang mengkode protein yang berbeda yaitu gen Z untuk mengkode -galaktosidase yang akan menghidrolisis lakosa menjadi glukosa dan galaktosa, gen Y untuk mengkode permease yang akan membawa laktosa ke dalam sel dan gen A untuk mengkode transasetilase yang akan mentransfer gugus asetil dari acetyl-CoA ke -galaktosidase. Masing-masing gen structural tersebut mempunyai kodon inisiasi dan terminasi yang berbeda-beda, namun ekspresinya dikendalikan oleh satu promoter yang sama. Saat transkripsi, operon lac menghasilkan satu mRNA yang membawa kode-kode genetik untuk tiga macam polipeptida yang berbeda. Ketiga gen struktural tersebut diatur ekspresinya oleh satu promoter yang sama (p). Operator adalah bagian dari promoter tempat penempelan protein repressor yang dikode oleh gen I (Warianto, 2011). Operon lac dibutuhkan dalam transport dan metabolism dari laktosa pada
E.coli dan berbagai macam bakteri lainnya. Operon diregulasi oleh adanya glukosa dan laktosa. Gen structural akan aktif apabila ada induksi dari laktosa. Bila tidak adanya laktosa, gen lac I akan menghasilkan protein repressor yang mengikat operator lac dan mencegah terjadinya transkripsi karena RNA polimerase tidak lagi mengikat. Akan tetapi, saat aktossa
0 5 10 15 20 25 0 10 20 30 40 50 A kt iv itas e n zi m m e n it -1 L -1 t (menit)
Aktivitas Enzim Beta-Galaktosidase
NB NB+laktosa NB+laktosa+glukosa NB+glukosa NB+sukrosa NB+maltosaditambahkan, repressor lac I akan terlepas karena terikat pada alolaktosa lalu transkripsi ketiga gen structural akan berjalan (Joung, 2000).
Aktivitas operon dikendalikan oleh system regulasi positif dan negative. Pengendalian positif pada suatu operon adalah operon dapat diaktifkan oleh produk ekspresi gen regulator. Sedangkan pengendalian negatif adalah operon dinonaktifkan oleh produk ekspresi gen regulator. Terdapat dua macam produk gen regulator yaitu aktivator yang berperan dalam pengendalian positif dan repressor yang berperan dalam pengendalian neagatif. Pengikatan aktivator atau repressor pada promoter ditentukan oleh keberadaan suatu molekul efektor yang biasanya merupakan molekul kecil. Molekul efektor yang mengaktifkan ekspresi suatu gen disebut induser dan yang bersifat menekan ekspresi suatu gen disebut repressor. Pada keadaan tidak ada laktosa, repressor lac akan berada dalam konfigurasi aktifnya. Sedangkan, apabia terdapat laktosa, alolaktosa akan mengikatkan diri pada repressor lac dan mengubah konformasinya, menghilangkan repressor untuk mengikatkan diri pada operator. Operator lac akan menghasilkan mRNA untuk enzim-enzim jalur laktosa, hal tersebut dapat dilihat pada gambar 1 dan 2.
Gambar 1. Pengaruh adanya laktosa Gambar 2. Pengaruh tidak adanya laktosa Enzim -galaktosidase dapat disintesis dalam jumlah yang layak, apabila terdapat laktosa dan rendahnya glukosa. E.coli dapat mengetahui konsentrasi glukosa dengan mengandalkan interaksi antara protein pengatur alosteik dengan suatu molekul organik yang berukuran kecil. Molekul kecil tersebut adalah AMP siklik (cAMP) dan akan berakumulasi bila tidak ada glukosa. Protein yang mengatur hal tersebut adalah protein repressor cAMP (cAMP reseptor protein atau CRP) yang merupakan aktivator transkripsi. Ketika cAMP terikat pada CRP, protein akan berubah ke bentuk aktifnya dan mengikatkan diri pada tempat tertentu di sebelah promoter lac. Penempelan CRP pada DNA membuat RNA polymerase mudah terikat pada promoter dan
memulai proses transkripsi operon. Apabila jumlah glukosa meningkat maka cAMP akan menurun dan CRP akan lepas dari operon lac. Keadaan dari repressor lac akan menentukan ada atau tidaknya transkripsi gen operon lac. Kondisi CRP akan mengontrol laju transkripsi apabila opero bebas dari repressor.
Pada percobaan ini dilakukan penentuan aktivitas -galaktosidase yang diinduksi oleh berbagai jenis gula. Medium yang digunakan ditambahkan dengan berbagai jenis gula, dalam praktikum kali ini adalah NB, NB + laktosa, NB + glukosa + laktosa, NB + glukosa, NB + sukrosa dan NB + maltosa. Sebelumnya medium yang sudah ditambahkan berbagai jenis gula ini disentrifugasi untuk mengendapkan bakteri dan memisahkannya dari media. Buffer Z untuk mencuci sisa media yang masih ada, sentrifuga dilakukan beberapa kali agar bakteri dapat terpisahkan dengan baik. Kloroform berfungsi untuk mengekstrak komponen sel yang sudah tidak dibutuhkan. SDS untuk merusak membrane sel agar terjadi proses lisis sel. Setelah itu diinkubasi pada suhu 37oC karena suhu optimum untuk kerja -galaktosidase. Penambahan ONPG (orthonitrofenil- -galaktopiranosida) digunakan sebagai substrat. Lalu diinkubasi untuk mengoptimumkan kerja enzim dan kemudian ditambahkan Na2CO3, Na2CO3 bersifat basa dan
akan mengubah pH larutan, sehingga kerja enzim terganggu dan aktivitasnya akan menurun. Penyimpanan dalam es pun akan membuat enzim tidak bekerja. Setelah itu disentrifugasi, dan akan didapatkan fasa ONP hasil hidrolisis dan fasa organik (kloroform dan SDS). Kemudian diukur absorban dari cairan tersebut dan jangan sampai fasa organik terambil dalam pengukuran. Pada pengukuran untuk waktu nol menit, didapatkan absorbansi yang tidak nol untuk semua tabung dengan berbagai media. Hal tersebut mungkin disebabkan oleh lamanya penambahan Na2CO3 dan penyimpanan dalam es, dan enzim sudah menunjukkan aktivitasnya
tanpa adanya inkubasi terlebuh dahulu. Pada tabung pertama yang hanya berisi NB. Akibatnya bakteri akan memiliki sedikit ATP namun molekul cAMP akan banyak. cAMP akan mengikat protein CRP dan akan menginduksi pengikatan RNA polimerase. Proses transkripsi akan berjalan dengan lancar, sehingga absorbannya semakin lama semakin meningkat, namun ternyata dari data yang diperoleh ada penurunan nilai absorban. Pada tabung kedua, di mana medium ditambahkan dengan laktosa seharusnya menunjukkan absorban yang paling tinggi di antara yang lain karena laktosa berperan sebagai induser sehingga ONP lebih banyak terbentuk. ATP yang dihasilkan sedikit dan jumlah cAMP cukup banyak dan dapat mengikat CRP dan
menginduksi RNA polimerase. Pada tabung ketiga, medium ditambahkan dengan glukosa dan laktosa. Terdapat laktosa yang berperan sebagai induser namun karena adanya glukosa maka jumlah ATP akan lebih banyak dibandingkan dengan hanya laktosa saja. Kompleks CRP-cAMP hanya sedikit sehingga pengikatan RNA polymerase tidak diindukksi. Tanskripsi yang terjadi akan mengalami penurunan dan ONP yang terbentuk akan menjadi sedikit. Pada tabung keempat, gula yang ditambahkan adalah glukosa, glukosa sangat mudah untuk menghasilkan ATP. Jumlah ATP akan banyak dan jumlah cAMP akan sedikit, sehingga pengikatan RNA polymerase menurun dan transkripsi juga menurun. Repressor pun akan mengikat operator dan mengganggu proses transkripsi -galaktosidase. Pada tabung kelima digunakan sukrosa yang merupakan disakarida sehingga ATP yang akan dihasilkan sedikit, kompleks cAMP-CRP akan menjadi banyak sehingga pengikatan RNA polimerase terinduksi. Pada tabung keenam, gula yang ditambahkan adalah maltose, maltose adalah disakarida dan sulit untuk menghasilkan ATP dibandingkan dengan glukosa, sehingga jumpah cAMP cukup banyak, transkripsi akan meningkat.
Dari hasil percobaan kali ini maka didapatkan beberapa aktivitas -galaktosidase, tabung dengan menggunakan laktosa memberikan aktivitas yang besar dan aktivitas paling kecil didapatkan untuk tabung dengan penambahan glukosa terlihat pada grafik tren yang dihasilkan terdapat penurunan aktivitas yang cukup signifikan. Pada percobaan kali ini tren data yang didapatkan sangatlah buruk, terjadi naik turun absorban pada setiap tabung. Pada tabung pertama tanpa inkubasi pun seharusnya absorban nya nol. Diantara semua tabung seharusnya tabung dengan laktosa yang memiliki absorban paling besar yaitu tepatnya pada waktu inkubasi 40 menit. Namun, ternyata absorban terbesar diperoleh untuk glukosa dan laktosa pada menit ke 40. Hal tersebut sangat jauh berbeda, beberapa kesalahan yang dimungkinkan terjadi adalah selang waktu penambahan ONPG dan waktu penyetopan reaksi tidak tepat sehingga reaksi melebihi atau kurang dari yang seharusnya serta kuvet yang digunakan sebaiknya adalah kuvet kuarsa karena memilki kualitas yang lebih baik dibandingkan kuvet yang digunakan.
Selain operon lac terdapat juga operon triptofan, triptofan lac terdiri dari lima gen strukturan yang diperlukan untuk konversi asam chorismic enjadi triptofan, lima gen structural tersebut adalah antrhanilate syntetase (komponen I yang dikode oleh trpE dan komponen II yang
synthase yang disandikan oleh trpC, Tryptophan synthase (β-subunit yang disandikan
oleh trpBI dan α-subunit yang disandikan oleh trpA).
Gambar 3. Trp operon
VI. Kesimpulan
Sampel
Aktivitas Enzim (menit-1 L-1)
0 10 20 30 40 NB 0 15.37 20.05 12.80 8.11 NB + Laktosa 0 21.52 18.62 4.46 4.52 NB + Glukosa + Laktosa 0 16.99 14.38 7.40 7.97 NB + Glukosa 0 12.58 8.90 3.95 6.11 NB + Sukrosa 0 9.94 11.73 6.85 7.49 NB + Maltosa 0 11.98 13.21 8.84 3.81
VII. Daftar Pustaka
J.H. Miller in, Experiment in Molecular Genetics, 1972 Cold Spring Harbor Laboratories p.352-355
Joung J, Ramm E, Pabo C (2000). A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Proc Natl Acad Sci USA 97 (13): 7382–7.
