PREPARAT POLEN (METODE ASETOLISIS)
Oleh :
Andriani Diah Irianti B1J012011 Linda Anita Tristiani B1J012021
Nur Ngafifah B1J012025
Yuniana Riska Khasanati B1J012049
Firza Thenia B1J012191
Nur Ulfah Khasanah B1J012199
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROTEKNIK
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO
2015
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Tanaman berkembang biak secara alami melalui berbagai macam cara. Tanaman berkembang biak secara alami dengan 2 cara yaitu generatif dan vegetatif. Generatif adalah bahwa tanaman tersebut berkembang biak secara kawin, yaitu bertemunya sel jantan yang terdapat pada benang sari dan sel betina yang terdapat pada putik. Bertemunya 2 sel ini nantinya akan menghasilkan buah yang berbiji 2 yaitu dikotil. Tanaman yang dikembangbiakkan melalui cara ini biasanya memiliki sifat genetis yang berbeda dari tanaman induk dan biasanya mengalami kemunduran. Tumbuhan berbiji memiliki alat perkembangbiakan generatif yang dikenal sebagai bunga. Dimana pada bunga terdapat daun-daun yang telah berubah bentuk dan fungsinya, daun bunga demikian lazim disebut stamen yang merupakan alat kelamin jantan dalam unit bunga tersebut. Stamen berfungsi menghasilkan serbuk sari atau pollen. Serbuk sari sangat penting dalam proses persarian ataupun pembuahan (Hidayat, 1995).
Butir pollen adalah mikrospora tumbuhan berbiji yang mengandung mikrogametofit masak atau belum masak. Serbuk sari atau pollen adalah alat reproduksi jantan yang terdapat pada tumbuhan dan mempunyai fungsi yang sama dengan sperma sebagai alat reproduksi jantan pada hewan. Serbuk sari berada dalam kepala sari (anthera) tepatnya dalam kantung yang disebut ruang serbuk sari (theca). Setiap anthera rata-rata memiliki dua ruang serbuk sari yang berukuran relatif besar (Septina, 2006).
Pollen memiliki dinding yang berfungsi untuk melindungi inti sperma tumbuhan dari proses desikasi dan iradiasi selama perpindahan dari antera menuju ke stigma. Butir pollen yang kecil dilapisi oleh lilin dan protein yang berupa elemen scluptura (Davis, 1999). Menurut Faegri & Iversen (1989), pollen mempunyai 2 lapis dinding yaitu lapisan dalam (intine) dan lapisasn luar (exine). Lapisan intine merupakan dinding pektoselulosa tipis yang mengelilingi butir pollen yang masak, sedangkan lapisan exine tersususn dari sporopollenin sebagai komponen utamanya, yaitu berupa substansi keras yang berfungsi memberikan daya tahan yang kuat kepada dinding butir pollen (Fahn, 1991). Pollen yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu berasal dari bunga turi (Sesbania grandiflora).
Metode asetolisis biasanya digunakan dalam mengamati preparat pollen. Metode ini merupakan salah satu metode yang digunakan dalam pembuatan preparat serbuk sari. Prinsip dari metode ini yaitu dengan melisiskan dinding sel serbuk sari dengan asam asetat glasial serta asam sulfat pekat (H2SO4) sebagai bahan tambahan. Hal ini bertujuan untuk mendapatkan hasil pengamatan morfologi dinding serbuk sari ornamentasi dari serbuk sari tersebut. Serbuk sari yang digunakan dalam pembuatan preparat ini haruslah merupakan serbuk sari yang matang. Serbuk sari yang matang ini dapat ditandai dengan sudah tidak ada air dalam serbuk sari tersebut, jika serbuk sari dipatahkan maka hanya akan seperti tepung saja (Suntoro, 1983).
B. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah mengetahui tahapan-tahapan pembuatan preparat pollen menggunakan metode asetolisis.
II. MATERI DAN METODE A. Materi
Alat yang digunakan dalam praktikum kali ini yaitu tabung reaksi, skalpel, batang pengaduk, skalpel, sentrifuge, mikroskop cahaya, kaca benda dan penutupnya, pipet tetes, kamera dan kertas tissue.
Bahan yang digunakan yaitu pollen bunga turi (Sesbania grandiflora), asam asetat glasial, H2SO4, akuades, safranin jelly 1%, dan medium mounting gliserin jelly.
B. Metode
Metode yang digunakan dalam pembuatan preparat polen metode asetolisis adalah sebagai berikut :
1. Pollen bunga turi (Sesbania glandiflora) diambil dari anthera, dikumpulkan dalam kecil, kemudian difiksasi dengan asam asetat glacial selama 24 jam
2. Setelah itu larutan asetat glasial diganti dengan yang baru dan ditambahkan 1-2 tetes H2SO4.
3. Bahan selanjutnya dipanaskan dan diusahakan tidak sampai gosong.
4. Kemudian disentrifus, setelah itu supernatannya dibuang dan endapannya diganti dengan akuades.
5. Pencucian dengan akuades dilakukan selama 3 kali dimana setiap pencucian disentrifus lagi.
6. Kemudian dilakukan dengan perwarnaan dilakukan dengan pewarnaan dengan safranin jelly 1% yang ditambahkan medium mounting gliserin.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil
B. Pembahasan
Gambar 3.1. Preparat pollen Sesbania grandiflora menggunakan metode asetolisis dengan perbesaran 400x
Pembuatan preparat polen metode asetolisis diawali dengan melakukan penyisiran anther bunga turi (Sesbania grandiflora), selanjutnya dilakukan fiksasi menggunakan asam asetat glasial selama 24 jam. Tujuan fiksasi dengan asam asetat glasial yaitu untuk mematikan (penghentian proses-proses hidup secara tiba-tiba dan kekal (permanen) serta mengawetkan semua isi sel dalam ukuran serta posisi semula dalam sel atau hampir sama dengan pada waktu masih hidup. Tahap selanjutnya, asam asetat glasial diganti dengan asam asetat glasial yang baru dan ditambahkan 1-2 tetes H2SO4. Penambahan H2SO4 pekat berfungsi untuk melisiskan selulosa yang terdapat pada dinding serbuk sari sehingga ketika dibuat preparat maka secara morfologi ciri-ciri alami eksin serbuk sari akan terlihat lebih jelas dibandingkan dengan sebelum dilakukan asetolisis. Selain itu, juga berfungsi agar struktur sel serbuk sari tetap utuh seperti keadaan hidupnya ketika mendapat perlakuan selanjutnya. Kemuadian, bahan dipanaskan di waterbath diusahakan jangan sampai bagian bawah gosong.
Tahap selanjutnya bahan dipindahkan ke dalam tabung sentrifuge untuk dilakukan sentrifugasi. Tujuan dilakukan sentrifugasi yaitu untuk mendapatkan serbuk sari yang terpisah dari larutan asam asetat glasial dan H2SO4 dengan membentuk endapan. Selanjutnya, dilakukan pencucian dengan akuades yang dilakukan selama 3 kali, dan setiap pencucian dilakukan sentrifugasi. Tahap selanjutnya yaitu melakukan pewarnaan dengan menggunakan safranin jelly 1%. Setelah itu dilakukan mounting dengan mengambil bahan dan meletakkannya diatas objek glass. Preparat selanjutnya ditutup menggunakan gliserin jeli. Fungsi dari penutupan menggunakan gliserin jeli yaitu untuk membuat preparat awet serta berfungsi sebagai perekat. Penggunaan gliserin sebagai perekat karena preparat digunakan untuk dalam jangka waktu yang agak lama. Tahap terakhir dari metode asetolisis, preparat yang telah jadi diamati dibawah mikroskop dan selanjutnya diberi label.
Berdasarkan hasil pengamatan preparat polen yang telah dibuat menggunakan pollen bunga turi (Sesbania grandiflora) diperoleh pollen bunga turi (Sesbania grandiflora) berbentuk bulat. Dinding serbuk sari terdiri dari dua lapisan, yaitu eksin (lapisan luar) tersusun atas sporopolenin, dan intin (lapisan dalam) yang tersusun atas selulosa. Metode asetolisis biasa digunakan untuk mengamati preparat pollen. Metode asetolisis merupakan salah satu metode pembuatan preparat serbuk sari dengan menggunakan prinsip melisiskan dinding sel serbuk sari dengan asam asetat
glasial serta sam sulfat pekat sebagai bahan kimia fiksatif. Serbuk sari yang digunakan sebaiknya menggunakan serbuk sari yang matang. Hal ini karena, serbuk sari yang matang akan dengan mudah untuk diambil bagian serbuknya yang seperti tepung (Suntoro, 1983).
Langkah-langkah dari pembuatan metode asetolisis yaitu fiksasi, pemanasan, pencucian, pewarnaan (staining), penutupan (mounting), dan labelling. Berikut langkah-langkah pada metode asetolisis (Sugiharto, 1989):
1. Fiksasi
Fiksasi adalah suatu usaha untuk mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan, dalam hal ini serbuk sari agar tetap pada tempatnya, dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran dengan media kimia sebagai fiksatif. Selain itu fiksasi juga mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh jenis enzim yang terkandung di dalam jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autolisis. Ada dua macam fiksatif, yaitu fiksatif sederhana dan majemuk atau campuran. Fiksatif sederhana merupakan larutan yang didalamnya hanya mengandung satu macam zat saja, sedangkan fiksatif majemuk atau campuran adalah larutan yang di dalamnya mengandung lebih adri satu macam zat. Fiksatif yang digunakan dalam pembuatan preparat pollen yaitu asam asetat glasial dan H2SO4 pekat. Langkah awal yang dilakukan yaitu serbuk sari dimasukkan dalam larutan asam asetat glasial, selanjutnya fiksatif dibiarkan selama 24 jam di dalam suhu ruang. Setelah 24 jam, asam asetat diganti menggunakan asam asetat yang baru dan ditambahkan 1-2 tetes H2SO4
2. Tahap pemanasan
Setelah dilakukan penggantian larutan asam asetat glasial yang baru yang ditambah dengan 1-2 tetes H2SO4, selanjutnya dilakukan pemanasan dengan menggunakan waterbath. Pemanasan dilakukan jangan sampai gosong. Setelah dilakukan pemanasan, serbuk sari dalam larutan akan berubah warna menjadi agak kecoklatan. Serbuk sari dan larutan yang dipanaskan ini kemudian didinginkan sejenak. Setelah serbuk sari dingin dilakukan sentrifugase yang bertujuan untuk mendapatkan serbuk sari yang telah terasetolisis. Selain itu juga, sentrifugase bertujuan untuk memisahkannya serbuk sari dari larutan asam asetat glasial dan asam asetat H2SO4 pekat. Sentrifuse dilakukan dengan kecepatan 3000 rpm.
Langkah selanjutnya yaitu pencucian pollen turi (Sesbania grandiflora) menggunakan akuades yang dilakukan sebanyak tiga kali. Pencucian dilakukan dengan menambahkan akuades ke dalam tabung sentrifus yang berisi serbuk sari kemudian dilakukan sentrifuse untuk mendapatkan serbuk sari yang sudah bersih. Perlakuan tersebut dilakukan sebanyak tiga kali untuk mendapatkan serbuk sari yang bersih tanpa ada sisa zat kimia seperti fiksatif dalam serbuk sari yang akan dibuat preparat.
4. Tahap pewarnaan (staining)
Pewarnaan (staining) dilakukan menggunakan safranin 1 %. Tujuan utama dari pewarnaan yaitu untuk meningkatkan kontras warna serbuk sari dengan sekitarnya, sehingga memudahkan dalam pengamatan serbuk sari dibawah mikroskop. Pewarnaan juga dapat memperjelas bentuk ornamen dinding sel serbuk sari serta mempermudah mengetahui ukuran serbuk sari.
5. Tahap penutupan (mounting)
Mounting atau penutupan ini merupakan langkah penting dalam pembuatan preparat, dimana serbuk sari diambil tabung sentrifuse yang kemudian diletakkan pada salah satu sisi objek gelas. Kemudian, serbuk sari disusun empat potongan kecil Selanjutnya di atas serbuk sari ditetesi dengan gliserin jeli. Susunan tersebut perlu dipertimbangkan peletakannya agar dapat dihasilkan preparat yang rapi dan proporsional. Setelah penyusunan gliserin jeli dan serbuk sari selesai langkah berikutnya dalam mounting adalah penutupan susunan tersebut dengan cover glass. 6. Tahap labelling
Labelling merupakan tindakan pelabelan preparat. Preparat diberikan label dengan kertas label bertuliskan nama preparat.
Metode asetolisis adalah metode yang digunakan dalam pembuatan preparat polen dan spora. Prinsip dasar asetolisis, adalah memecah atau melisis dinding polen (eksin dan intin) dan spora dengan menggunakan asam kuat. Penggunaan metode asetolisis memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihan metode ini yaitu untuk mendapatkan hasil amatan morfologi dinding serbuk sari ornamentasi dari serbuk sari tersebut. Kekurangannya adalah langkah-langkah dalam mengerjakan pembuatan preparat dengan menggunakan metode asetolisis banyak sekali tahap-tahapanya, sehingga dalam melakukan tahapan harus berhati-hati agar bisa mendapatkan hasil serbuk sari yang baik (Suntoro, 1983).
Berdasarkan hasil dan pembahasan dapat disimpulkan bahwa :
1. Preparat polen turi (Sesbania grandiflora) yang didapat yaitu bentuk pollennya bulat.
2. Cara membuat preparat polen metode asetolisis yaitu diawali dengan menyisir anther polen, selanjutnya difiksasi asam asetat glasial selama 24 jam, asam asetat glasial diganti dengan asam asetat glasial yang baru dan ditambahkan 1-2 tetes H2SO4., dipanaskan di waterbath diusahakan jangan sampai bagian bawah gosong, dilakukan sentrifugasi, pencucian dengan akuades yang dilakukan selama 3 kali dan setiap pencucian dilakukan sentrifugasi, pewarnaan dengan menggunakan safranin jelly 1%, tahap mounting dengan medium gliserin jelly dan tahap terakhir labelling dan pengamatan preparat dibawah mikroskop.
DAFTAR REFERENSI
Davis, G. L. 1999. Systematic Embryology of the Angiosperms. John Wiley and Sons Inc., New York. 528 p.
Faegri, K dan J. Inverson. 1989. Text Book of Pollen Analysis. 3rd revised edition by Faegri, K. Munksgaard, Copenhagen and Denmark. Pp. 1-295.
Fahn, A. 1991. Anatomi Tumbuhan Edisi 3. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.
Hidayat, B. E. 1995. Anatomi dari Tumbuhan Berbiji. ITB. Bandung.
Septina, S. 2006. Hubungan Kekerabatan Beberapa Tanaman Murbei (Morus sp.) Berdasarkan Morfologi Pollen. Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Sugiharto. 1989. Mikroteknik. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Pusat Antar Universitas Ilmu Hayat Institut Pertanian Bogor. Bogor.
Suntoro, H. 1983. Metode Pewarnaan (Histologi dan Histokimia). Fakultas Biologi, UGM, Yogyakarta.
