INTISARI
Tanaman majapait (Crescentia cujete L.) merupakan salah satu tanaman berkhasiat obat. Dari penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, hasil uji in-vitro
ekstrak etanol daun majapait memberikan aktifitas antiinflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek antiinflamasi topikal dan mekanisme aktifitas antiinflamasi topikal dari ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada mencit betina galur Swiss yang diinduksi dengan karagenin 3% secara subkutan.
Penelitian ini termasuk eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak pola searah. Tiga puluh ekor mencit betina dibagi menjadi 6 kelompok, yaitu kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol Biocream®, kelompok kontrol positif, kelompok perlakuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75% dengan cara pemberian secara topikal. Pemotongan kulit hewan uji dilakukan pada 24 jam setelah perlakuan. Kulit hewan uji diawetkan mengunakan larutan fiksatif, yaitu larutan formalin 10%. Sel neutrofil yang bermigrasi di daerah subkutan diamati menggunakan metode pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan dilanjutkan dengan uji persen penekanan ekspresi siklooksigenase (COX) 2 dengan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2. Data yang diperoleh berupa dianalisis mengunakan uji Shapiro Wilk, dilanjutkan uji nonparametrik Kruskal Wallis dengan Post Hoc Test menggunakan uji Mann Whitney pada taraf kepercayaan 95%.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel neutrofil yang bermigrasi pada kelompok perlakuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75% berturut-turut adalah 31,20; 26,36 dan 16,76 lebih kecil dibandingkan dengan kontrol karagenin, yaitu 111,36. Dan pada konsentrasi yang sama memberikan persen (%) penekanan ekspresi COX-2 berturut-turut adalah 8,33; 13, 44; dan 14,13 lebih besar dibandingkan dengan kontrol karagenin, yaitu 1,45. Kesimpulan dari penelitian ini adalah ekstrak etanol daun majapait menunjukan aktifitas antiinflamasi pada pemberian topikal dan mekanisme aktifitas antiinflamasi diduga melalui penghambatan migrasi sel neutrofil dan penekanan ekspresi COX-2.
ii
ABSTRACT
Majapait (Crescentia cujete L.)is a plant that has pharmacological effect. From the previous study in-vitro test that the leaves ethanol extract of C. cujete
possessed inflammatory. The research aims is to investigate topical anti-inflammation effect and mechanism of action of Crescentia cujete leaves ethanolic extract in female mice strains Swiss induced by carrageenan 3% subcutaneously.
The study was pure experimental with completely randomized design direction. Thirty mice were devided into six groups of five animal each. Negatif control group, positif control group, Biocream® control group and group of leaves ethanolic extract of Crescentia cujete with a consentration of 1.67; 2.5; and 3.75% were given topically. Cutting animal skin test performed for 24 hours. Skin test animals preserved using a fixative solution, 10% formalin solution. The neutrophils migration was observed using Hematoxylin and Eosin (HE) Staining Method. And than Immunohistochemical Method using antibody anti cyclooxygenase-2’s observed suppress the expression of cyclooxygenase 2 (COX-2). These data were analyzed using Shapiro-Wilk test, continued byKruskal–Wallis test and Post Hoc test by Mann Whitneytest with 95% confidence level.
The result showed that neutrophils migrating of leaves ethanolic extractof
Crescentia cujete at consentration 1.67; 2.5; and 3.75%, respectively, 8.33; 13. 44; and 14.13. They are lower than carrageenan control group at 111.36. And at the same concentration showed that suppression expression of cyclooxygenase-2 (in %), respectively, 8.33; 13.44; and 14.13. They are higher than carrageenan control group at 1.45%. In conclusion, leaves ethanol extract of Crescentia cujete has topical antiinflammatory effect. Inhibiton of neutrophil migration and suppressthe expression of cyclooxygenase-2 are alleged this mechanism of antiinflammatory.
UJI EFEK ANTIINFLAMASI TOPIKAL EKSTRAK ETANOL DAUN MAJAPAIT (Crescentia cujete L.)TERHADAP JUMLAH NEUTROFIL DAN EKSPRESI SIKLOOKSIGENASE 2 PADA MENCIT TERINDUKSI
KARAGENIN
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Dui Sostales
NIM : 128114085
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
i
UJI EFEK ANTIINFLAMASI TOPIKAL EKSTRAK ETANOL DAUN MAJAPAIT (Crescentia cujete L.)TERHADAP JUMLAH NEUTROFIL DAN EKSPRESI SIKLOOKSIGENASE 2 PADA MENCIT TERINDUKSI
KARAGENIN
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Dui Sostales
NIM : 128114085
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Our greatest weakness lies in giving up. The most certain way to succeed is
always to try just one more time”
-Thomas Alva Edison-
Takut akan TUHAN adalah permulaan pengetahuan, tetapi
orang bodoh menghina hikmat dan didikan
(Amsal 1:7)
Kupersembahkan buat : Kemulian Tuhan Yesus Kristus sebagai juruselamat hidupku Kedua orang tuaku dan saudariku tercinta
vii
PRAKATA
Puji dan syukur ke hadirat Tuhan Yesus Kristus oleh karena berkat dan
rahmat-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Efek
Antiinflamasi Topikal Ekstrak Etanol Daun Majapait (Crescentia cujete L.) terhadap Jumlah Neutrofil dan Ekspresi Siklooksigenase 2 pada Mencit
Terinduksi Karagenin” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah
satu syarat dalam memperoleh gelar Serjana farmasi (S.Farm.) Fakultas Faramasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Penyelesaiaan skripsi ini tidak lepas dari dukungan dan bantuan dari
berbagai pihak, baik secara langsung maupun secara tidak langsung. Oleh karena
itu, penulis mengucapkan terima kasih banyak kepada :
1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta
2. Bapak Enade Perdana Istyatono, Ph.D.,Apt., selaku Dosen Pembimbing
Akademik yang telah memberikan bimbingan, pengarahan, dan dukungan
selama menjalani proses perkuliahan di Fakultas Farmasi hingga saat ini.
3. Ibu drh. Sitarina Widyarini, M.P.,Ph.D., selaku Pembimbing Utama atas
kesabaran dan ketabahan untuk selalu membimbing, menyemangati,
membantu, dan mengarahkan selama proses penelitian hingga penyusunan
skripsi ini.
4. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Pembimbing Pendamping atas
dukungan, bimbingan, dan masukan selama proses penelitian hingga
viii
5. Ibu Phebe Hendra, M.Si.,Ph.D.,Apt., selaku Dosen Penguji yang telah
memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun.
6. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji yang telah
memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun.
7. Bapak, Ibu, Kak Dea yang selalu memberikan doa, dukungan, semangat,
bantuan, dan kasih sayang.
8. Ibu Agustina Setiawati, M.Sc.,Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas
Farmasi yang telah memberikan izin dalam penggunaan semua fasilitas
laboratorium yang mendukung dalam penelitian ini.
9. Staf laboratorium, Bapak Heru, Bapak Purwanto, Bapak Wagiran, Bapak
Suparjiman, Bapak Kayatno, dan Bapak Lilik yang telah membantu dalam
proses penelitian di laboratorium.
10.Teman-teman seperjuangan dalam penelitian : Monika, Ruri, Kathrin, Farra,
Sinta, atas bantuan, kerja sama, perjuangan serta suka duka yang dialami
selama penelitian.
11.Penghuni kontrakan Dangau Kamuda Diri (DKD) : Bang Egi, Om Alim,
Vensi, Sambu, Iwan, serta Taufik yang selalu ada dikontrakan untuk
mendukung, menyemangati, membantu dan memberi masukan kepada penulis
dalam menyusun skripsi.
12.Teman-teman FSM B dan FST A 2012 atas kebersamaan, suka duka selama
menempuh pendidikan di Falkutas Farmasi.
ix
14.Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu
penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dan ketidaksempurnaan
dalam penyusunan skripsi ini. Maka penulis mengharapkan kritik dan saran yang
membangun yang dapat membuat karya ini menjadi lebih baik. Akhir kata,
semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan bagi perkembangan
ilmu pengetahuan.
Yogyakarta, Januari 2016
Penulis
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ……….. i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ……… ii
HALAMAN PENGESAHAN ……… iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ………. iv
SURAT PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ... v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ………. vi
PRAKATA ………. vii
DAFTAR ISI ……….. x
DAFTAR TABEL ……….. xiii
DAFTAR GAMBAR ………. xiv
DAFTAR LAMPIRAN ……….. xvi
INTISARI ……….. xviii
ABSTRACT ... xix
BAB I. PENGANTAR ……… 1
A. Latar Belakang ………. 1
1. Rumusan Masalah ……….. 5
2. Keaslian Penelitian ………. 6
3. Manfaat Penelitian ……….. 7
B. Tujuan Penelitian ……….. 8
xi
I. Imunohistokimia ... 25
J. Karagenin ...……….. 26
K. Hidrokortison ...……… 27
L. Landasan Teori ………. 27
M. Hipotesis ……… 29
BAB III. METODE PENELITIAN ……… 30
A. Jenis dan Rancangan penelitian ……… 30
B. Variael dan Definisi Operasional ………. 30
C. Bahan Penelitian ……… 32
xii
C. Uji Pendahuluan …...……… 43
D. Pengujian Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete.... 45
E. Metode pengecatan hematoksilin eosin (HE)... 46
F. Metode Immunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 ... 55
G. Mekanisme Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Majapait... 64
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ……… 68
A. Kesimpulan ………... 68
B. Saran ………. 68
DAFTAR PUSTAKA ……… 69
LAMPIRAN ……….. 74
xiii
DAFTAR TABEL
Tabel I. Hasil rerata jumlah sel neutrofil pada setiap kelompok
perlakuan ... 49
Tabel II. Rerata jumlah sel neutrofil masing-masing kelompok
perlakuan dan kontrol dengan uji Mann Whitney ... 52
Tabel III. Rerata ekspresi enzim COX-2 (dalam %) oleh e ekstrak etanol
daun maja dengan kontrol pada daerah subkutan diinduksi
karagenin 3%... 58
Tabel IV. Rerata penekanan ekspresi enzim COX-2 (dalam %)
masing-masing kelompok perlakuan dan kontrol dengan uji Mann
xiv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Tanaman dan Daun Crescantia cujete L...………… 9 Gambar 2. Struktur anatomi kulit normal. ………...………… 16
Gambar 3. Karateristik biomaterial pada inflamasi akut dan kronis... 17
Gambar 4. Metabolit Asam arakidonat melalui jalur siklooksigen dan
jalur lipoxygenase serta target dari obat antiinflamasi …... 21
Gambar 5. Konfigurasi C6-C3-C6 flavonoid... 23
Gambar 6. Kurva peningkatan tebal lipat kulit selama enam jam. ….... 44
Gambar 7. Mikrofotografi pengecatan HE kulit normal, perlakuan
ekstrak etanol daun maja konsentrasi 2,5% beserta kontrol
negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400
kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan
jaringan kulit (tanda lingkaran merah)... 48
Gambar 8. Diagram batang efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol
daun maja masing-masing perlakuan dan kontrol ……… 50
Gambar 9. Mikrofotografi pengecatan immunositokimia terhadap
COX-2 pada sel neutrofil (tanda lingkaran merah) di
daerah subkutan jaringan kulit mencit di bawah mikroskop
binokuler pada perbesaran 100 kali (a) dan 400 kali (b).
Tanda panah hitam menunjukkan hasil positif COX-2,
xv
antibodi anti-COX-2 kulit normal, perlakuan ekstrak
etanol daun maja konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif
(karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali.
Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan
kulit (tanda lingkaran merah). ………... 57
Gambar 11. Diagram batang ekspresi enzim COX-2 masing-masing kelompok perlakuan beserta kontrol... 59
Gambar 12. Target flavonoid dalam memodulasi respon inflamasi melalui jalur asam arakidonat dan protein kinase yang mengatur faktor-faktor transkripsi seperti CREB, AP-1, NF- B, dan C/EBP yang memodulasi ekspresi penanda pro-inflamasi seperti COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β, dan IL6... 65
Gambar 13. Daun Crescantia cujete……… 76
Gambar 14. Serbuk daun Crescantia cujete……….. 76
Gambar 15. Ekstrak kental etanol daun Crescantia cujete ………... 76
Gambar 16. Mencit betina galur Swiss... 77
Gambar 17. Kulit punggung mencit setelah pencukuran.………. 77
Gambar 18. Pengawetan kulit dengan formalin 10%…………... 77
Gambar 19. Kontrol Biocream sebagai basis ekstrak ………... 78
Gambar 20. Kontrol Hidrocortisone sebagai kontrol positif... 78
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi tanaman majapait
(Crescentia cujete L)... 74
Lampiran 2. Serbuk daun Crescentia cujete beserta ekstrak etanol Crescentia cujete ... 76
Lampiran 3. Hewan uji yang digunakan beserta pengawetan kulit... 77
Lampiran 4. Kontrol yang digunakan beserta alat spuit injeksi ………... 78
Lampiran 5. Surat Etical Clirens……… 79
Lampiran 6. Hasil perhitungan migrasi sel neutrofil pada uji hematoksilin eosin (HE) ... 80
Lampiran 7. Hasil uji normalitas migrasi sel neutrofil dengan uji Shapiro Wilk ………... 82
Lampiran 8. Hasil pengujian migrasi sel neutrofil dengan Kruskal-Wallis... 83
Lampiran 9. Hasil pengujian migrasi sel neutrofil dengan Mann-Whitney... 86
Lampiran 10. Hasil perhitungan sel ekpresi enzim COX-2 pada uji imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2... 94
Lampiran 11. Persen penekanan ekpresi enzim COX-2 pada uji imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2... 96
xvii
Lampiran 13. Hasil pengujian persen penekanan enzim COX-2 dengan
Kruskal-Wallis... 101
Lampiran 14. Hasil pengujian persen penekanan enzim COX-2 dengan
xviii
INTISARI
Tanaman majapait (Crescentia cujete L.) merupakan salah satu tanaman berkhasiat obat. Dari penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, hasil uji in-vitro ekstrak etanol daun majapait memberikan aktifitas antiinflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek antiinflamasi topikal dan mekanisme aktifitas antiinflamasi topikal dari ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada mencit betina galur Swiss yang diinduksi dengan karagenin 3% secara subkutan.
Penelitian ini termasuk eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak pola searah. Tiga puluh ekor mencit betina dibagi menjadi 6 kelompok, yaitu kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol Biocream®, kelompok kontrol positif, kelompok perlakuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75% dengan cara pemberian secara topikal. Pemotongan kulit hewan uji dilakukan pada 24 jam setelah perlakuan. Kulit hewan uji diawetkan mengunakan larutan fiksatif, yaitu larutan formalin 10%. Sel neutrofil yang bermigrasi di daerah subkutan diamati menggunakan metode pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan dilanjutkan dengan uji persen penekanan ekspresi siklooksigenase (COX) 2 dengan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2. Data yang diperoleh berupa dianalisis mengunakan uji
Shapiro Wilk, dilanjutkan uji nonparametrik Kruskal Wallis dengan Post Hoc Test menggunakan uji Mann Whitney pada taraf kepercayaan 95%.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel neutrofil yang bermigrasi pada kelompok perlakuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75% berturut-turut adalah 31,20; 26,36 dan 16,76 lebih kecil dibandingkan dengan kontrol karagenin, yaitu 111,36. Dan pada konsentrasi yang sama memberikan persen (%) penekanan ekspresi COX-2 berturut-turut adalah 8,33; 13, 44; dan 14,13 lebih besar dibandingkan dengan kontrol karagenin, yaitu 1,45. Kesimpulan dari penelitian ini adalah ekstrak etanol daun majapait menunjukan aktifitas antiinflamasi pada pemberian topikal dan mekanisme aktifitas antiinflamasi diduga melalui penghambatan migrasi sel neutrofil dan penekanan ekspresi COX-2.
xix
ABSTRACT
Majapait (Crescentia cujete L.)is a plant that has pharmacological effect. From the previous study in-vitro test that the leaves ethanol extract of C. cujete
possessed inflammatory. The research aims is to investigate topical anti-inflammation effect and mechanism of action of Crescentia cujete leaves ethanolic extract in female mice strains Swiss induced by carrageenan 3% subcutaneously.
The study was pure experimental with completely randomized design direction. Thirty mice were devided into six groups of five animal each. Negatif control group, positif control group, Biocream® control group and group of leaves ethanolic extract of Crescentia cujete with a consentration of 1.67; 2.5; and 3.75% were given topically. Cutting animal skin test performed for 24 hours. Skin test animals preserved using a fixative solution, 10% formalin solution. The neutrophils migration was observed using Hematoxylin and Eosin (HE) Staining Method. And than Immunohistochemical Method using antibody anti cyclooxygenase-2’s observed suppress the expression of cyclooxygenase 2 (COX-2). These data were analyzed using Shapiro-Wilk test, continued byKruskal– Wallis test and Post Hoc test by Mann Whitneytest with 95% confidence level.
The result showed that neutrophils migrating of leaves ethanolic extract of Crescentia cujete at consentration 1.67; 2.5; and 3.75%, respectively, 8.33; 13. 44; and 14.13. They are lower than carrageenan control group at 111.36. And at the same concentration showed that suppression expression of cyclooxygenase-2 (in %), respectively, 8.33; 13.44; and 14.13. They are higher than carrageenan control group at 1.45%. In conclusion, leaves ethanol extract of Crescentia cujete
has topical antiinflammatory effect. Inhibiton of neutrophil migration and suppressthe expression of cyclooxygenase-2 are alleged this mechanism of antiinflammatory.
1
BAB I PENGANTAR
A. LATAR BELAKANG
Keanekaragaman hayati (biodiversity) yang dimiliki Indonesia, baik tumbuhan tropis dan biota lautnya, menduduki peringkat kedua di dunia setelah
Brazil. Sekitar 30.000 jenis tumbuhan dan 7.000 di antaranya ditengarai memiliki
khasiat sebagai obat. Kekayaan keanekaragaman hayati ini diteliti, dikembangkan
dan dimanfaatkan untuk peningkatan kesehatan maupun tujuan ekonomi dengan
tetap menjaga kelestariannya ( Sampurno, 2015).
Tumbuhan berkhasiat obat atau herbal medicine merupakan produk obat yang berasal dari bagian akar, batang, daun, kulit batang, biji, buah dan bunga
yang digunakan untuk pencegahan dan atau penyembuhan penyakit (Kamboj,
2000). Dewasa ini penggunaan obat herbal cenderung terus meningkat, baik di
negara-negara berkembang maupun di negara-negara maju. Peningkatan
penggunaan obat herbal ini terkait kompatibilitas yang lebih baik dengan tubuh
manusia dan efek samping yang lebih rendah.
Salah satu tumbuhan yang berkhasiat obat adalah tumbuhan majapait
(Crescentia cujete L.) yang tumbuh subur di daerah tropis Indonesia. Tumbuhan majapait atau disebut juga dengan maja atau berenuk merupakan tanaman perdu
yang termasuk dalam famili Bignoniaceae. Tumbuhan majapait sudah
dimanfaatkan sebagai obat pencuci perut, pencahar dan ekspektoran. Selain itu
panas. Kayunya digunakan untuk pengobatan demam dan sakit telinga sedangkan
daun digunakan untuk menurunkan tekanan darah. Tanaman ini sudah digunakan
sebagai pencahar oleh masyarakat di Kosta Rika, sedangkan di Kolombia
digunakan untuk penderitaan gangguan pernapasan (Khan, 2015).
Konstituen fitokimia tanaman majapait dilaporkan oleh Mahbub, Hoq,
Ahmed, dan Sarker (2011) terdiri atas tartaric acid, cianhidric, citric acid, crescentic acid, tannins, beta-sitosterol, estigmasterol, alpa and beta amirina, estearic acid, triacontanol, palmitic acid, flavonoids-quercetin, apigenin, naphthoquinones, iridoids glycosides, 3-hydroxybutanal glycosides. Dalam penelitian yang dilakukan Das, Islam, Jahan, Saiful, Khan, Rafikul, dan Parvin
(2014) melaporkan bahwa kandungan kimia dari ekstrak etanol daun majapait
diidentifikasi berupa steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. Ejelonu, Lasisi, Olaremu, dan Ejelonu (2011) juga melaporkan kandungan fitokimia buah majapait terdiri dari phenol, tannins, saponins, alkaloids, flavonoid, anthraquinone, cardenolides, phiobatannin.
Proses inflamasi merupakan mekanisme pertahanan tubuh sebagai
respon normal terhadap trauma fisik, zat kimia berbahaya atau agen mikrobiologi.
Respon tersebut penting untuk memungkinkan tubuh bertahan selama infeksi atau
cedera dan mempertahankan homeostasis jaringan saat kondisi berbahaya.
Adapun respon yang umumnya muncul meliputi rubor (kemerahan), kalor
(panas), dolor (nyeri) dan tumor (pembengkakan) (Corwin, 2008). Respon
inflamasi biasanya disertai dengan rasa tidak nyaman, sehingga mendorong
Setiap agen atau obat yang bekerja melawan atau menekan proses
peradangan disebut antiinflamasi (Dorlan, 2002). Obat antiinflamasi dapat
digunakan secara oral maupun topikal. Pada penggunaan topikal, antiinflamasi
dioleskan pada daerah yang mengalami inflamasi. Penggunaan anttiinflamasi
topikal semakin banyak dicari terkait keuntungan penggunaan sediaan topikal
yang dapat mempercepat aksi obat ditempat kerja karena tidak melalui sistem
percernaan dan menghindari rusaknya zat aktif disebabkan oleh aktifitas enzim
dan interaksi dengan makanan pada terapi antiinflamasi secara oral (Ansel, 1989).
Aktivitas protein siklooksigenase (COX) bertanggung jawab untuk
pengeluaran produksi prostaglandin (PG) yang tinggi selama proses inflamasi dan
respon imum melalui metabolisme asam arakidonat (Widiastuti, 2011). Protein
COX yang merupakan target aksi Obat Anti Inflamasi Non Steroid (OAINS)
terdapat dalam dua isoform, yaitu COX-1 dan COX-2. COX-1 bersifat konstitutif,
diekspresikan pada hampir semua jaringan untuk fisiologi normal dan
homeostasis, sedangkan ekspresi COX-2 terinduksi oleh berbagai stimulus
inflamasi dan bertanggung jawab pada biosintesis PG yang terlibat pada reaksi
inflamasi dan rasa nyeri (Ikawati, 2006). Sementara ini dapat disimpulkan bahwa
aktivitas COX-2, bukan COX-1, memainkan peranan penting dalam proses
inflamasi.
Fase seluler awal proses inflamasi ditandai dengan migrasi sel neutrofil
polimorfonuklear (PMN), sel leukosit pertama, yang secara kimia tertarik ke
daerah inflamasi. PMN neutrofil muncul dalam jumlah yang besar pada hari-hari
adanya peningkatan permeabilitas vaskular dan vasodilatasi pada proses
peradangan. Penghambatan migrasi sel neutrofil menjadi salah satu kunci
menghambat terjadinya inflamasi. Penurunan jumlah sel neutrofil yang secara
langsung menghambat pelepasan asam arakidonat yang menyebabkan kurang
tersedianya substart arakidonat bagi jalur siklooksigenase, yang pada akhirnya
akan menekan jumlah prostaglandin (Rahayu, 2009). Mengingat besarnya peran
sel neutrofil dan protein COX-2 dalam proses inflamasi, maka keduanya dapat
dijadikan sebagai target molekuler dalam skrining senyawa dari bahan alam yang
berperan sebagai agen yang mempengaruhi migrasi sel neutrofil dan regulasi
protein COX-2, melalui penekanan ekspresi protein COX-2.
Hasil uji in-vitro menggunakan metode HRBC (Human Red Blood Cell)
dengan membrane stabilization menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 1 mg/ml memiliki aktifitas anti-inflamasi. Aktifitas antiinflamasi
pada ekstrak daun majapait diyakini berasal senyawa flavanoid serta tanin.
Flavonoid seperti quercetin yang diketahui efektif dalam mengurangi peradangan akut. Adapun efek antiinflamasi dari senyawa flavonoid tertentu bekerja melalui
penghambatan kuat terhadap berbagai enzim seperti proteinkinase C, protein
kinase tirosin, fosfolipase A2, fosfodiesterase (Parvin et al.,2015).
Kusuma, Sulistyo, Susanti, dan Sabikis (2014) melaporkan bahwa
pengujian ekstrak etanol daun majapait secara in-vivo pada konsentrasi 40; 60; dan 80% memberikan aktifitas penghentian pendarahan luar yang lebih baik
dibandingkan kontrol. Flavonoid serta tanin yang terkandung pada ekstrak etanol
dari prostaglandin I2 vasodilatasi (prostasiklin) sehingga menyebabkan proses
kontraksi luka (vasokontriksi) menjadi lebih cepat.
Das et al. (2014) melaporkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada
konsentrasi 100 g/ml menunjukan aktifitas antioksidan melalui pengujian dengan
DPPH, FRP dan TAC tests. Senyawa antioksidan seperti phenol dan flavonoids
mengikat radikal bebas sehingga menghambat mekanisme oksidatif yang
menyebabkan penyakit degeneratif dan lainnya. Aktifitas antioksidan telah
memiliki peran sangat penting dalam pengobatan penyakit akibat terpapar radikal
bebas, seperti kanker, penyakit jantung, diabetes, inflamasi, penyakit degeneratif,
anemia, penuaan, dan iskemia. Adanya aktifitas antiinflamasi senyawa
antioksidan dari uji in-vitro ekstrak etanol daun majapait memberikan peluang bagi penggunaan ekstrak etanol daun majapait secara topikal. Penelusuran
mengenai mekanisme aktivitas antiinflamasi ekstrak etanol daun majapait perlu
dilakukan lebih lanjut melalui perhitungan jumlah neutrofil menggunakan metode
hematoksilin dan eosin (HE) dan penekanan ekspresi protein COX-2
menggunakan metode imunohistokimia. Penelitian efek antiinflamasi topikal
ektrak etanol daun majapait (Crescentia cujete L.) dilakukan dengan pengujian terhadap kulit punggung mencit galur Swiss yang diinduksi karagenan 3%.
1. Rumusan masalah
a. Apakah ekstrak etanol daun tumbuhan Crescentia cujete L. memiliki efek antiinflamasi topikal terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi
b. Bagaimana mekanisme aktifitas antiinflamasi ekstrak etanol daun
Crescentia cujete L. pada mencit galur Swiss yang diinduksi karagenin 3% ?
2. Keaslian penelitian
Penelitian mengenai majapait yang pernah dilakukan antara lain:
a. Penelitian yang dilakaukan Mahbub et al. (2011) melaporkan kandungan kimia tanaman majapait, yaitu tartaric acid, cianhidric, citric acid, crescentic acid, tannins, beta-sitosterol, estigmasterol, alpa and beta amirina, estearic acid, triacontanol, palmitic acid, flavonoids-quercetin, apigenin, naphthoquinones, iridoids glycosides, 3-hydroxybutanal glycosides.
b. Penelitian yang dilakukan Das et al. (2014) melaporkan bahwa kandungan kimia dari ekstrak etanol daun majapait diidentifikasi berupa
steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. c. Penelitian yang dilakukan Das et al. (2014) juga melaporkan bahwa
ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 100 g/ml menunjukan
aktifitas antioksidan melalui pengujian dengan DPPH, FRP dan TAC
tests. Penelitian yang dilakukan Kusuma dkk. (2014) juga melaporkan bahwa pengujian ekstrak etanol daun majapait secara in-vivo pada konsentrasi 40; 60; dan 80% memberikan aktifitas penghentian
d. Penelitian yang dilakukan Parvin et al.(2015) melaporkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 1 mg/ml memiliki aktifitas
anti-inflamasi pada uji in-vitro menggunakan metode HRBC (Human Red Blood Cell) dengan membrane stabilization.
Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang efek antiinflamasi topikal
ekstrak etanol daun Crescentia cujete L. terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi COX-2 pada mencit yang diinduksi karagenin 3% melalui pengamatan
histopatologis jaringan kulit dengan pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan
imunohistokimia dengan antibodi anti-siklooksigenase-2 (COX-2) belum pernah
dilaporkan.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi dan bukti ilmiah
tentang penggunaan ekstrak etanol daun majapait sebagai antiinflamasi
topikal melalui pengamatan histopatologis jaringan kulit dengan
pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan imunohistokimia dengan
antibodi anti-siklooksigenase-2 (COX-2) .
b. Manfaat praktis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bahwa tumbuhan
majapait merupakan bahan obat dengan aktifitas antiinflamasi, sehingga
dapat mendukung penggunaan dan pengembangan tanaman majapait
B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum
Penelitian ini bertujuan untuk menguji efek antiinflamasi topikal ekstrak
etanol daun Crescentia cujete L.
2. Tujuan Khusus
a. Mengetahui efek antiinflamasi topikal ektrak etanol daun Crescentia cujete L. terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi siklooksigenase 2 pada mencit galur Swiss.
b. Mengetahui mekanisme aktifitas antiinflamasi ekstrak etanol daun
9
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Tanaman Crescentia cujete L.
Gambar 1. Tanaman dan Daun Crescentia cujete L.
1. Taksonomi tanaman
Kingdom : Plantae (Tumbuhan)
Subkingdom : Viridiplantae
Infrakingdom : Streptophyta
Divisi : Tracheophyta
Sub Divisi : Spermatophytina
Classs : Magnoliopsida
Superorder : Asteranae
Ordo : Lamiales
Genus : Crescentia
Spesies : Crescentia cujete L. ( Anonim, 2015).
2. Sinonim
Calabash Ayale, Calabacero, Miracle fruit, Vilayati Bel, Beggars bowl
(Khan, 2015).
3. Nama daerah
Sumatera : Tabu kayu (Melayu)
Jawa : Berenuk (Jawa)
Sulawesi : Bila balanda (Makasar),
Maluku : Buah no (Ternate)
Indonesia : Majapait
(Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012).
4. Penyebaran
Crescentia cujete L. (Gambar 1.) merupakan tanaman yang banyak dijumpai di daerah tropis. Distribusikan secara luas di kawasan Karibia, Meksiko,
Utara dan Selatan Amerika, Asia, Malesia dan kemudian diperkenalkan ke Afrika,
dari Senegal ke Kamerun kemudian ke bagian lain dari Afrika. Pohon ini banyak
ditanam di bagian utara negara Nigeria (Ejelonu et al., 2011).
Tanaman ini merupakan jenis tanaman dikotil berbunga yang berasal
tempat-tempat yang terbuka dan kena sinar matahari langsung, baik di dataran
rendah maupun dataran tinggi, yakni pada ketinggian 1 – 1.400 m di atas
permukaan laut. Ditanam di tempat yang agak ternaung atau sedikit terlindungi
pun masih dapat juga berbunga dan berbuah. Untuk mendapatkan tanaman yang
sehat, media tanam atau lahan yang akan ditanami harus subur, gembur dan
drainase diatur dengan baik (Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan
Sulawesi, 2012).
5. Morfologi
Pohon majapait tumbuh hingga 6-10 m, daun hijau terang, panjang 5
sampai 15 cm dan lebar dan lebar 2,5-5,5 cm , bunganya mekar di malam hari,
berwarna kuning atau hijau dengan merah atau ungu urat, berbentuk cangkir, dan
muncul langsung dari cabang. Buah berbentuk bola (bulat) dengan diameter 12
cm sampai 30 cm, cangkang keras yang halus, mengkilat atau licin yang
menggantung tepat di bawah cabang-cabang. Kulit kayu hijau keras (BTFP,
2005).
Bunganya adalah bunga tunggal atau dalam berkas yang terdiri dari 2-3
bunga, yang muncul pada batang dan cabang, bertangkai, menggantung, panjang
lebih kurang 5 cm, berwarna kuning kehijau-hijauan dengan urat berwarna merah.
Kelopak bunga mula-mula menutup, kemudian terbelah berbentuk upih atau
berbentuk 2-3 taju yang sampai pangkal tidak beraturan, panjang lebih kurang 1
cm. Tabung mahkota bunga membengkok, berbentuk lonceng, berperut dengan
sisa-sisa benang sari yang ke-5. Buahnya berbentuk bola, tertekan sedikit, licin,
berwarna hijau mengkilat, kulit buah berkayu, keras, diameter 25 cm. Setiap buah
berbiji banyak, bentuk biji pipih, terdapat dalam daging buah yang lumat
(Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012).
6. Kegunaan
Semua bagian dari tanaman majapait dapat dimanfaatkan. Kayunya dapat
digunakan untuk kayu bakar, gagang perkakas, tulang rusuk di perahu, bangunan
dan belenggu ternak, dan labu untuk cangkir, tas dan alat musik. Buah dan
daunnya dilaporkan memiliki khasiat obat (Mahbub, 2011). Daun Crescentia cujete berkhasiat sebagai obat luka baru dan daging buahnya untuk urus-urus. Untuk obat luka baru dipakai sebanyak +10 gram daun Cresentia cujete, dicuci dan diturnbuk sampai halus, ditempelkan pada bagian yang luka dan dibalut
dengan kain bersih (Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012).
Penggunaan secara tradisional, daging buah majapait dapat digunakan
untuk masalah pernapasan seperti asma dan juga digunakan sebagai pencahar.
Kulit kayu digunakan untuk diare berlendir. Rebusan kulit kayu digunakan untuk
membersihkan luka dan ditumbuk daun digunakan sebagai tapal untuk sakit
kepala. Internal, daun digunakan sebagai diuretik dan juga digunakan untuk
mengobati hematoma dan tumor. Buah rebusan digunakan untuk mengobati diare,
sakit perut, dingin, bronkitis, batuk, asma, dan uretritis. Daun juga digunakan
7. Kandungan Kimia
Mahbub et al. (2011) melaporkan bahwa konstituen utama tanaman majapait terdiri atas tartaric acid, cianhidric, citric acid, crescentic acid, tannins, beta-sitosterol, estigmasterol, alpa and beta amirina, estearic acid, triacontanol, palmitic acid, flavonoids-quercetin, apigenin, naphthoquinones, iridoids glycosides, 3-hydroxybutanal glycosides. Senyawa naphtoquinones, iridoid glycosides, aucubin, plumieride,and asperuloside telah dilaporkan sebagai konstituen dari daun tanaman ini (Das et al., 2014).
Dalam penelitian yang dilakukan Das et al.(2014) juga melaporkan bahwa kandungan kimia dari ekstrak etanol daun majapait diidentifikasi berupa
steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. Mereka melaporkan bahwa semua fraksi dan ekstrak mentah etanol kulit dan daun
memiliki aktifitas antioksidan melalui tes DPPH, FRP dan TAC. Ejelonu et al.
(2011) melaporkan kandungan fitokimia buah majapait terdiri dari phenol, tannins, saponins, alkaloids, flavonoids, anthraquinone, cardenolides, phiobatannin. Senyawa flavonoid yang ditemukan dapat bertindak sebagai antioksidan dan melindungi sel-sel tubuh dari kerusakan radikal bebas.
B. Metode Penyarian
Ekstraksi adalah penyarian zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari
bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut
kimia yang terdapat pada bahan alam. Ekstraksi ini didasarkan pada prinsip
perpindahan massa komponen zat ke dalam pelarut, dimana perpindahan mulai
terjadi pada lapisan antar muka kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut
(DepKes RI, 1986)
Maserasi merupakan proses pengekstrakan simplisia dengan
menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan.
Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan
penyaringan maserat pertama dan seterusnya. Cairan penyari akan menembus
dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif yang akan
larut, karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel
dan di luar sel maka larutan terdekat didesak keluar (DitJen POM, 2000).
Maserasi dilakukan dengan cara memasukkan 10 bagian simplisia
dengan derajat yang cocok ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan penyari 75
bagian, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari, terlindung dari cahaya sambil diaduk
sekali-kali setiap hari lalu diperas dan ampasnya dimaserasi kembali dengan
cairan penyari. Penyarian diakhiri setelah pelarut tidak berwarna lagi, lalu
dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan pada tempat yang tidak
bercahaya, setelah dua hari lalu endapan dipisahkan (DepKes RI, 1986).
C. Kulit
Kulit adalah suatu organ pembungkus seluruh permukaan luar tubuh,
16 % berat tubuh, pada orang dewasa sekitar 2,7 – 3,6 kg dan luasnya sekitar 1,5 –
1,9 meter persegi. Tebalnya kulit bervariasi mulai 0,5 mm sampai 6 mm
tergantung dari letak, umur dan jenis kelamin. Kulit tipis terletak pada kelopak
mata, penis, labium minus dan kulit bagian medial lengan atas. Kulit tebal
terdapat pada telapak tangan, telapak kaki, punggung, bahu dan bokong
(Perdanakusuma, 2007).
Kulit merupakan “selimut” yang menutupi permukaan tubuh dan memiliki
fungsi utama sebagai pelindung dari berbagai macam gangguan dan ransangan
luar (Tranggono, 2007). Kulit menjaga bagian dalam tubuh dari gangguan fisik
atau mekanik (tarikan, gesekan,dan tekanan), gangguan kimia (zat-zat kimia yang
iritan), gangguan yang bersifat panas (radiasi,sinar ultraviolet) serta gangguan
infeksi luar dari bakteri atau jamur. Kulit juga menjalankan fungsi absorbsi,
termolegulasi, ekskresi, persepsi, pembentukan pigmen, keratinisasi, dan
pembentukan vitamin D (Djuanda, 2007).
Pembagian kulit secara garis besar tersusun atas tiga lapisan utama yaitu
lapisan epidermis, lapisan dermis, dan lapisan subkutis (Gambar 2.). Tidak ada
garis tegas yang memisahkan dermis dan subkutis, subkutis ditandai dengan
adanya jaringan ikat longgar dan adanya sel dan jaringan lemak Epidermis adalah
lapisan luar kulit, terdiri atas stratum korneum, stratum lusidum, stratum
granulosum, stratum spinosum, dan stratum basale. Lapisan dermis adalah lapisan
dibawah epidermis yang jauh lebih tebal daripada epidermis. Lapisan ini
mengandung pembuluh darah, akar rambut, kelenjar keringat, kelenjar minyak
nyeri, suhu, gatal, dan tekanan. Subkutis adalah lapisan di bawah dermis. Tidak
ada garis tegas yang memisahkan dermis dan subkutis, Subkutis ditandai dengan
adanya jaringan ikat longgar dan adanya sel dan jaringan lemak (Perdanakusuma,
2007).
Gambar 2. Struktur anatomi kulit normal (Perdanakusuma, 2007) D. Inflamasi
1. Definisi Inflamasi
Inflamasi adalah respon terhadap cedera jaringan dan infeksi. Ketika
proses inflamasi berlangsung, terjadi reaksi vaskular di mana cairan,
elemen-elemen darah, sel darah putih (leukosit), dan mediator kimia berkumpul pada
tempat cedera jaringan atau infeksi. Proses inflamasi merupakan suatu mekanisme
perlindungan di mana tubuh berusaha untuk menetralisir dan membasmi
agen-agen yang berbahaya pada tempat cedera dan untuk mempersiapkan keadaaan
selama proses perbaikan jaringan (Kee dan Hayes, 1996).
Respon inflamasi sering dikategorikan sesuai dengan durasi, yaitu
terhadap trauma (cedera atau pembedahan) dengan durasi relatif singkat dari
hitungan menit sampai hari. Sedangkan inflamasi kronis mencerminkan respon
inflamasi yang berkelanjutan untuk kondisi jangka panjang dari hitungan hari
sampai tahun (Anonim, 2015).
Inflamasi akut memiliki durasi relatif singkat, yang berlangsung dari
menit sampai dengan hari, dan tergantung dari keparahan cedera yang terjadi.
Karakteristik utama dari peradangan akut adalah eksudasi cairan dan plasma
protein (edema) dan imigrasi leukosit (terutama neutrofil). Setelah respon
inflamasi akut mereda, monosit dan limfosit mendominasi di daerah cedera dan
menjadi ciri dari peradangan kronis. Monosit akan bermigrasi dari darah,
berdiferensiasi menjadi makrofag dalam jaringan di sisi implan. Makrofag ini
akan berfusi atau menyatu menjadi sel raksasa bersama benda asing. Makrofag
dan sel raksasa bersama benda asing yang menonjol pada antarmuka
jaringan/implan (Black and Hastings, 1998). Adapun karateristik biomaterial pada inflamasi akut dan kronis terhadap waktu dapat dilihat pada gambar 3.
2. Gejala
Inflamasi menghasilkan gejala-gejala berikut: (1) rasa sakit karena kerja
bahan sitotoksik yang dilepaskan dari elemen-elemen humoral, selular, dan
microbial pada ujung saraf; (2) pembengkakam disebabkan karena filtrasi
makromolekul dan cairan ke dalam jaringan yang terpegaruh; (3 dan 4)
kemerah-merahan dan panas, disebabkan karena vasodilatasi pembuluh-pembuluh dan
aliran darah ke jaringan yang terpengaruh; dan (5) gangguan fungsi, disebabkan
oleh perubahan pada Jaringan yang terpengaruh (Wilmana, 1995).
3. Mekanisme inflamasi
Ketika jaringan terluka, kehadiran infeksi atau kerusakan akan dirasakan
oleh sel tubuh, terutama makrofag termasuk juga sel-sel dendritik, sel mast, dan
sel lainnya. Sel-sel ini mensekresikan molekul (sitokin dan mediator) yang
menginduksi dan mengatur respon inflamasi selanjutnya. Jalur metabolisme
arakidonat bertanggung jawab dalam kegiatan enzimatik untuk menghasilkan
metabolit yang bertindak sebagai mediator dari banyak sisi penting dari proses
inflamasi. Mediator-mediator ini yang menyebabkan vasodilatasi, emigrasi
neutrofil, kemotaksis, dan peningkatan permeabilitas pembuluh darah (Mansjoer,
1999).
Asam arakidonat dilepaskan dari fosfolipid di membran sel untuk
menanggapi rangsangan, baik mekanik ataupun kimia. Pelepasan asam arakidonat
oleh fosfolipase memulai serangkaian reaksi kompleks yang menyebabkan
produksi dari keluarga eicosanoid sebagai mediator inflamasi (prostaglandin,
dua jalur yaitu: jalur siklooksigenase, yang berpuncak pada sintesis tromboksan
A2, prostacylin (PGI2) dan prostaglandin (PGF). Dan jalur lipoksigenase, yang
memuncak pada sintesis leukortrienes (LTs) dan lipoxins (LX) (Williams and
Wilkins, 2011).
Siklooksigenase merupakan asam lemak (COX-1 dan COX-2), yang
mengaktifkan arakidonat untuk membentuk prostaglandin endoperoxide (PGG2),
PGG2 secara enzimatis diubah menjadi PGH2 dan dengan bantuan oksigen radikal,
PGH2 selanjutnya membentukan 3 metabolit sebagai berikut:
a) Prostaglandin (PGD2, PGE2 dan PGF2-α). PGD2 dan PGE2 menyebabkan
peningkatan permeabilitas vanular, vasodilatasi dan bronkodilatasi dan
menghambat fungsi sel inflamasi. PGF2-α menginduksi vasodilatasi dan
bronkodilatasi
b) Tromboksan A2 (TXA2), dibentuk aktif dalam agregasi plateletyang
menginduksi vasokonstriksi. Trombosit hanya mengepresikan COX-1, sehingga
Laufer (2003) menegaskan bahwa TXA2 hanya dapat dibentuk oleh COX-1
c) Prostasiklin (PGI2), PGI2 menginduksi vasodilatasi dan bronkodilatasi dan
menghambat agregasi platelet
(Mohan, 2011).
Enzim lipooksigenase merupakan enzim yang dominan di neutrofil, yang
hydroperoxy (5-HPETE) yang diperoksidasi lebih lanjut membentuk 2 metabolit, yaitu:
a) Leukotrien (LT), leukotrien A4 (LT4) merupakan hasil enzimatik dari
5-HPETE untuk membentuk LTB4 (Kemotaktik untuk sel fagosit dan merangsang
sel fagositik adhereence) dan LTC4, LTD4 dan LTE4 yang menyebabkan
vasokonstriksi, bronkokonstriksi dan meningkatkan permeabilitas pembuluh darah
b) Lipoxins (LX), merupakan mediator antiinflamsi hasil derivat dari leukotrien
(LT4) yang menghambat kemotaksis neutrofil dan adhesi ke endotelium dan
dengan demikian berfungsi sebagai antagonis endogenenous leukotrien.
Trombosit tidak dapat mensintesis LXA4 dan LXB4 tetapi mereka dapat
membentuk mediator ini dari intermediet LTA4 yang berasal dari neutrofil yang
berdekatan, oleh jalur biosintesis transelular
(Mohan, 2011).
E. Antiinflamasi
Obat-obat antiinflamasi non-steroid, atau NSAID (Nonsteroidal
antiinflammatory drugs) merupakan obat-obat yang menghambat sintesa
prostaglandin, mempunyai efek analgesik dan antipiretik yang berbeda-beda tetapi
terutama dipakai sebagai agen antiinflamasi untuk meredakan inflamasi dan nyeri
(Kee dan Hayes, 1994). Mekanisme utama untuk efek mereka adalah
penghambatan ekspresi protein yang disebut siklooksigenase. Protein COX
mengkatalisis pembentukan prostanoids (termasuk PG, Prostacyclins, dan
sintesis prostanoids akan berhenti sehinggaakan mengurangi peradangan. NSAID
selektivitas akan menghambat salah satu dari dua isoform COX, COX -1 dan
COX-2 sedangkan NSAID non-selektif akan menghambat COX-1 dan COX-2
(Porth, 2011). Adapun metabolisme asam arakidonat melalui jalur siklooksigenase
dan lipoksigenase dan tempat aksi kerja obat kortikosteroid dan obat-obat
antiinflamasi non-steroid dapat dilihat pada gambar 4.
Gambar 4.` Metabolit Asam arakidonat melalui jalur siklooksigen dan jalur lipoxygenase serta target dari obat antiinflamasi (Porth, 2011).
Kortikosteroid menghambat aktifitas fosfolipase A2, yang mengurangi
pelepasan asam arakidonat. Dengan demikian, kortikosteroid akan menghambat
pembentukan prostaglandin, tromboksan dan leukotrien. Steroid anti-inflamasi
menghambat fosfolipase A2 secara tidak langsung dengan pelepasan protein
penghambatan, yaitu lipocortin-1. Protein ini merupakan anggota dari superfamili
lipocortin-1 ini akan mencegah pelepasan eikosanoid dari paru-paru dan
merupakan agen anti-inflamasi yang kuat (Vane, 1996).
F. Sistem Imun
Sistem imun merupakan suatu sistem pertahanan tubuh manusia melalui
interaksi yang kompleks pada tingkat molekul, sel, dan jaringan baik lokal dan
sistemik. Sistem imun hanya dapat diaktifkan oleh antigen, baik molekul dan
ataupun organisme, sehingga menimbulkan respon imun. Sistem imun terdiri atas
sistem imun alamiah atau non-spesifik (natural/innate/native) dan didapat atau spesifik (adaptive/acquired) (Bhagavan, 2011).
Sistem imun non-spesifik (sudah ada sejak lahir) merupakan suatu respon
cepat yang efektif terhadap serangan patogen dan zat asing. Respon imun yang
diperlihatkan selalu respon yang sama. Mekanisme sistem imun non-spesifik bisa
melalaui fagositosis yang menyerang partikel asing oleh sel-sel sistem kekebalan
tubuh (makrofag dan granulosit) dan inflamasi yang berkerja untuk memulihkan
jaringan yang rusak yang ditandai dengan peningkatan aliran darah, peningkatan
permeabilitas kapiler, dan melarikan diri dari cairan dan sel-sel dari kapiler
membesar ke dalam ruang jaringan (Kent, 2000).
Sistem imun spesifik meliputi sel dan protein dalam darah dan getah
bening yang menyerang, menghancurkan, dan mengeluarkan dari tubuh. Respon
yang ditimbulkan terbilang lambat dan hanya efektif melawan patogen yang
spesifik. Respon yang cepat bila terjadi infeksi berulang dengan patogen yang
Neutrofil adalah sel fagosit yang menjaga kulit dan selaput lendir.
Fungsinya melindungi terhadap antigen yang dirasakan, bermigrasi pada tempat
infeksi serta menghancurkan antigennya. Neutrofil beredar dalam darah selama
sekitar 6-10 jam tapi bisa tetap dalam jaringan dalam keadaan tidak aktif selama
2-6 hari. Migrasi neutrofil dalam inflamasi akut disertai dengan peningkatan
permeabilitas pembuluh darah (Bhagavan, 2011).
G. Flavonoid
Senyawa flavonoid merupakan senyawa polifenol yang mempunyai 15
atom karbon yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6. Kerangka flavonoid
terdiri atas satu cincin aromatik A, satu cincin aromatik B, dan cincin tengah
berupa heterosiklik yang mengandung oksigen dan bentuk teroksidasi cincin ini
dijadikan dasar pembagian flavonoid ke dalam sub-sub kelompoknya (Redha,
2010). Sistem penomoran digunakan untuk membedakan posisi karbon di sekitar
molekul flavonoid dapat dilihat pada gambar 5.
Gambar 5. Konfigurasi C6-C3-C6 flavonoid (Redha, 2010)
Senyawa flavonoid adalah senyawa fenol terbesar yang terdapat pada
semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, bunga,
buah, dan biji. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah,ungu, dan biru
dalam tubuh manusia berfungsi sebagai antioksidan dan mempunyai bioktifitas
sebagai obat. Manfaat flavonoids antara lain adalaha untuk melindungi stuktur sel,
meningkatkan efektifitas vitamin C, antiinflamasi, mencegah keropos tulang dan
sebagai antibiotik (Rathee, 2009).
Jaringan dan sel didalam tubuh akan mengalami kerusakan yang
disebabkan oleh radikal bebas dari aktifitas RSO (reactive oxygen species) yang dihasilkan dari proses metabolisme oksigen sel radang. Meningkatnya produksi
ROS dapat memicu kerusakan pada jaringan sehingga akan memperparah proses
inflamasi. Senyawa flavonoid dapat berperan sebagai antioksidan dengan cara
mengikat berbagai macam radikal bebas sehingga mencegah kerusakan jaringan
yang semakin parah (Gomes, 2008).
Mekanisme lain flavonoid dalam menghambat terjadinya radang yaitu
melalui dua cara, yang pertama menghambat pelepasan asam arakidonat dan
sekresi enzim lisosom dari sel neutrofil dan sel endotelial, dan yang kedua
menghambat fase proliferasi dan fase eksudasi dari proses radang. Terhambatnya
pelepasan asam arakidonat dari sel radang akan menyebabkan kurang tersedianya
substrat arakidonat bagi jalur siklooksigenase dan jalur lipooksigenase, yang pada
akhirnya akan menekan jumlah prostaglandin, prostasiklin, endoperoksida,
tromboksan di satu sisi dan asam hidroperoksida, asam hidroksieikosatetraienoat,
leukotrien di sisi lainnya (Rahayu, 2009).
H. Hematoksilin dan Eosin
Pewarnaan hematoksilin dan eosin merupakan metode pewarnaan yang
diagnosa medis dan penelitian. Jaringan yang diwarnai dengan hematoksilin dan
eosin akan menunjukkan sitoplasma berwarna merah jambu-jingga dan nukleus
berwarna gelap, biru atau ungu. Hematoksilin merupakan ekstrak dari pohon
logwood (Haematoxylum campechianum) yang digunakan sebagai bahan pewarna pada pewarnaan histoteknik (Junquera, 2007).
Hematoksilin bekerja sebagai pewarna basa, artinya zat ini mewarnai
unsur basofilik jaringan. Produk oksidasi hematoksilin berupa hematin bertindak
sebagai bahan aktif dalam larutan pewarnaan. Hematin akan membentuk
kompleks berwarna sangat kuat dengan ion logam tertentu, yang paling menonjol
adalah garam Fe (III) dan Al (III). Kompleks logam-haematein digunakan untuk
mewarnai inti sel sebelum diperiksa di bawah mikroskop. Hematoksilin menandai
inti dan struktur asam lainnya dari sel (seperti bagian sitoplasma yang kaya-RNA
dan matriks tulang rawan) menjadi biru. Eosin yang bersifat asam akan mewarnai
komponen asidofilik jaringan seperti mitokondria, granula sekretoris dan kolagen.
Tidak seperti hematoksilin, eosin mewarnai sitoplasma dan kolagen menjadi
warna merah muda (IHC World, 2015).
I. Imunohistokimia
Imunohistokimia merupakan metode yang digunakan untuk mendeteksi
adanya protein atau antigen tertentu dalam sel menggunakan antibodi spesifik
(IHC, 2015). Imunohistokimia menggabungkan teknik anatomi, imunologi dan
biokimia yang memungkinkan untuk memvisualisasikan distribusi dan lokalisasi
komponen seluler tertentu dalam sel dan dalam jaringan yang tepat sehingga dapat
Tahapan metode imunohistokimia terdiri atas empat tahap yaitu (1)
penanaman sel, (2) fiksasi dan perwarnaan dengan antibodi, (3) visualisasi sel
dengan mikroskop, dan (4) analisis ekspresi protein yang telah divisualisasikan.
Tahapan fiksasi menggunakan pelarut organik seperti alkohol dan aseton untuk
melepaskan lipid, mendehifrasi sel,dan mengendapkan protein (The Human Protein Atlas, 2015). Sel yang mengekspresikan protein tertentu akan memberikan warna coklat/gelap, sedangkan sel yang tidak mengekspreiskan
protein memberikan warna ungu/biru. Sel yang mengekspresikan protein tertentu
dari keseluruhan sel dinyatakan dalam satuan persen (%) (Ikawati, 2006).
J. Karagenin
Iritan yang digunakan untuk pengujian efek antiinflamasi beraga
jenisnya, satu diantaranya adalah karagenin. Karagenin merupakan polisakarida
hasil ekstraksi rumput laut dari famili Eucheuma, Chondrus, dan Gigartina.
Bentuknya berupa serbuk berwarna putih hingga kuning kecoklatan, ada yang
berbentuk butiran kasar hingga serbuk halus, tidak 24 berbau, serta memberi rasa
berlendir di lidah. Karagenin juga memiliki sifat larut dalam air bersuhu 80ºC
(Rowe et all., 2009).
Karagenan terdiri dari tiga tipe, yaitu kappa ( ), lambda (α), dan iota ( ),
yang diekstrak dari rumput laut merah. Mereka terutama diambil dari spesies
Gigartina dan Chondrus crispus, yang menghasilkan tipe kappa dan labda dan spesies Eucheuma cottonii dan spinosum, yang menghasilkan kappa dan iota jenis. Setiap jenis karagenan memiliki karakteristik tersendiri, meliputi kekuatan gel,
Karagenin berperan dalam pembentukan edema dalam model inflamasi
akut. Karagenin dipilih karena dapat menstimulasi pelepasan prostaglandin
setelah disuntikkan ke hewan uji. Oleh karena itu, karagenin dapat digunakan
sebagai iritan dalam metode uji yang bertujuan untuk mencari obat-obat
antiinflamasi, tepatnya yang bekerja dengan menghambat sintesis prostaglandin
(Winter et all., 1962).
K. Hidrokortison
Hidrokortison merupankan anti inflamasi steroid yang secara dramatis
menurunkan manifetasi dari inflamasi. Hidrokortison menghambat manifestasi
awan dan akhir inflamasi,yaitu tidak hanya tanda-tanda radang (kemerahan,
panas, sakit, edema, dan gangguan fungsi), tetapi juga stadium lebih lanjut
penyembuhan luka dan perbaikan dan reaksi proliferasi yang terlihat pada
inflamasi kronis. Hidrokortison mempengaruhi semua tipe reaksi inflamasi yang
disebabkan baik oleh invasi patogen, rangsangan kimia atau fisik, ataupun oleh
respon immun yang tidak tepat seperti terlihat pada hipersensitivitas atau
penyakit autoimmun (Tjay, 2007).
L. Landasan Teori
Inflamasi merupakan respons protektif setempat yang ditimbulkan oleh
cedera atau kerusakan jaringan. Respon yang muncul meliputi rubor (kemerahan),
kalor (panas), dolor (nyeri), dan tumor (pembengkakan). Penyebab inflamasi
antara lain mikroorganisme, trauma mekanis, zat-zat kimia, dan pengaruh fisika.
darah, sel darah putih (leukosit), dan mediator kimia berkumpul pada tempat
cedera jaringan atau infeksi. Metabolisme asam arakidonat bertangung jawab
sebagai substrat utama dalam produksi mediator-mediator inflamasi.
Prostaglandin dan tromboksan dihasilkan melalui jalur siklooksgenase.
Leukotriene, lipoksin, dan komponen penginduksi inflamasi lainnya dihasilkan
melalui jalur lipooksigenase.
Aktivitas protein siklooksigenase (COX) bertanggung jawab untuk
pengeluaran produksi prostaglandin (PG) yang tinggi selama proses inflamasi dan
respon imum melalui metabolisme asam arakidonat. Respon imun berupa migrasi
sel neotrofil ke daerah inflamasi merupakan fase seluler awal proses inflamasi.
Penurunan jumlah sel neutrofil yang secara langsung menghambat pelepasan
asam arakidonat yang menyebabkan kurang tersedianya substart arakidonat bagi
jalur siklooksigenase, yang pada akhirnya akan menekan jumlah prostaglandin.
Tanaman majapait merupakan salah satu tanaman yang memiliki efek
terapetik dengan kandungan kimia didalamnya teriidentifikasi berupa steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. Pendekatan penelitian ini didasarkan pada penelitian yang dilakukan Das et al. (2014) yang melaporkan
bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 100 g/ml menunjukan
pemberian ekstrak daun majapait secara in-vitro, diduga juga akan memperlihatkan adanya efek antiinflamasi apabila diberikan secara topikal.
Kandungan flavonoid pada daun majapait diduga bertanggung jawab
dalam memberi efek antiinflamasi. Flavonoid dapat berperan sebagai antioksidan
dengan cara mengikat berbagai macam radikal bebas sehingga mencegah
kerusakan jaringan yang semakin parah akibat aktifitas radikal bebas dari RSO
yang dihasilkan dari proses metabolisme oksigen sel radang. Flavonoid juga
menghambat pelepasan asam arakidonat dari sel radang sehingga menyebabkan
berkurangnya ketersedian substrat arakidonat, baik jalur siklooksigenase dan jalur
lipooksigenase, untuk membentuk mediator inflamasi.
Sel neutrofil dan protein COX-2 dalam proses inflamasi, keduanya
merupakan target molekuler dalam skrining senyawa dari bahan alam yang
berperan sebagai agen antiinflamasi. Pengujian terhadap efek antiinflamasi
ekstrak etanol daun majapait dilakukan melalui pengamatan histopatologis
jaringan kulit punggung mencit yang diinduksi karagenin 3%. Migrasi sel
neutrofil dapat dideteksi dengan menggunakan metode pengecatan hematoksilin
dan eosin (HE) untuk melihat penghambatan migrasi sel neutrofil. Pengukuran
ekspresi protein COX-2 dapat dilakukan dengan imunohistokimia dengan antibodi
anti-COX-2 untuk melihat penekanan ekspresi COX-2.
M. Hipotesis
Ekstrak etanol daun Crescentia cujete L. memberikan efek antiinflamasi topikal dengan berkurangnya migrasi sel neutrofil dan penekanan ekspresi COX-2
30
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian tentang efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada mencit betina galur Swiss diinduksi karagenan merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak lengkap
pola searah.
B. Variabel Penelitian dan Definifi Operasional 1. Variabel Penelitian
a. Variabel utama
1) Variabel bebas : Konsentrasi ekstrak etanol daun majapait.
2) Variabel tergantung :
a) Jumlah sel-sel neutrofil yang bermigrasi
b) Penekanan ekspresi siklooksigenase-2 didaerah subkutan.
b. Variabel pengacau
1) Variabel pengacau terkendali
a) Subyek uji : Mencit betina galur Swiss
b) Umur : 6 – 8 minggu (2-3 bulan)
c) Berat badan : 20-30 gram
d) Keadaan subyek : Sehat
2) Variabel pengacau tidak terkendali : kondisi patofisiologis mencit
2. Definisis oprasional
a. Inflamasi merupakan mekanisme pertahanan tubuh sebagai respon
normal terhadap trauma fisik, zat kimia berbahaya atau agen
mikrobiologi. Adapun respon yang umumnya muncul meliputi rubor
(kemerahan), kalor (panas), dolor (nyeri) dan tumor (pembengkakan).
b. Migrasi Neutrofil merupakan sel leukosit yang bermigrasi dari pembuluh
darah ke daerah subkutan (punggung mencit) dalam 3 bentuk berbeda
yaitu, berinti satu, berinti dua dan beriti ladam kuda pada pengukuran 24
jam setelah diinjeksikan karagenin 3%.
c. Ekspresi COX-2 merupakan ekspresi COX-2 oleh sel neutrofil yang
berwarna coklat/gelap pada daerah subkutan jaringan kulit mencit selama
pengukuran 24 jam setelah diinjeksikan karagenin 3%.
d. Daun Crescentia cujete yang digunakan merupakan daun yang berwarna hijau segar, tidak berlubang, serta tidak terdapat kotoran dari binatang
kecil yang didapat dari tanaman milik warga di Jl. Garuda, No. 168,
Pringwulung, Yogyakarta.
e. Ekstrak etanol daun Crescentia cujete merupakan hasil ekstraksi simplisia daun Crescentia cujete seberat 15 gram yang dimaserasi pada 100 mL etanol 70% selama dua hari. Kemudian diremaserasi dalam
jumlah pelarut yang sama selama satu hari, disaring dengan kertas saring,
dan dipekatkan pada waterbath hingga menjadi ekstrak kental.
dengan satuan b/b. Konsentrasi ekstrak kental daun Crescentia cujete
yang digunakan adalah 1,67; 2,5; dan 3,75 %.
g. Efek antiinflamasi ekstrak etanol daun Crescentia cujete adalah kemampuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete untuk mengurangi migrasi sel-sel neutrofil dan penekanan ekspresi COX-2 pada daerah
subkutan secara mikroskopik pada pengukuran 24 jam setelah injeksi
karagenin 3 %.
h. Injeksi subkutan merupakan injeksi yang dilakukan pada jaringan di
bawah kulit pada punggung mencit yang sudah dicukur rambutnya
terlebih dahulu.
i. Pemberian topikal ekstrak daun Crescentia cujete dilakukan dengan cara mengoleskan sediaan sebanyak 0,1 gram yang menutupi area seluas 2,25
cm2 (1,5 cm x 1,5 cm) pada kulit punggung kulit mencit yang telah
diinduksi karagenin 3% secara subkutan.
C. Bahan penelitian
Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu :
1. Hewan uji pada penelitian ini mengunakan mencit betina galur Swiss yang
berumur sekitar 6 – 8 minggu (2-3 bulan) dengan bobot sekitar 20- 30 gram
dalam kondisi yang sehat yang diperoleh dari Laboratorium Imuno
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Prosedur penelitian ini telah
Medicine dan Medical and Health Research Ethics Committee (MHREC)
dengan nomor KE/61/05/2015.
2. Bahan uji daun majapait diperoleh dari tanaman milik warga di Jl. Garuda,
No. 168, Pringwulung, Yogyakarta.
3. Karagenin tipe I (Sigma Chemical co.) sebagai inflamatogen diperoleh dari
Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Falkutas Farmasi Universitas
Islam Indonesia, Yogyakarta.
4. Etanol 70% diperoleh dari PT. Brataco di Jl. Letjend Suprapto No. 70,
Ngampilan, Yogyakarta
5. NaCl 0,9% teknis sebagai pelarut karagenin diperoleh dari Apotek K-24
Yogyakarta.
6. Akuades diperoleh dari PT. Brataco di Jl. Letjend Suprapto No. 70,
Ngampilan, Yogyakarta.
7. Biocream® diperoleh dari Apotek K-24 Yogyakarta, Depok, Sleman,
Yogyakarta.
8. Hidrokortison cream sebagai control positif mengandung Hidrokortison
Asetat 2.5% diproduksi oleh Galenium, diperoleh dari dari Apotek K-24
Yogyakarta, Depok, Sleman, Yogyakarta.
9. Veet® sebagai perontok bulu diproduksi oleh Reckitt Benckiser, diperoleh
dari Alfamart Paingan Sleman.
D. Alat atau Instrument Penelitian
1. Alat Ekstraksi
a) Oven
b) Mesin Penyerbuk
c) Ayakan no. 40
d) Alat-alat Gelas ( Labu ukur, gelas beker, erlemeyer, gelas ukur, cawan
porselen, pipet tetes, batang pengaduk dan gelas arloji)
2. Alat induksi dan pengukuran edema kulit punggung mencit dan lain-lain
a) Neraca analitik
b) Gunting
c) Gelas arloji
d) Stopwatch
e) Spuit injeksi 1 mL
f) Stopwatch
g) Mikroskop cahaya Olympus CX21 h) Jangka sorong digital
i) Mortir dan Stamper
3. Alat dan bahan yang digunakan pemotongan organ kulit
a) Formalin 10%
b) Karton
c) Gunting bedah
d) Container
e) Pinset
E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman Crescentia cujete dengan cara mencocokkan ciri-ciri makroskopik yang terdapat pada tanaman yang dilakukan secara benar
menurut Steenis (1992) di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Pengumpulan Bahan
Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa
membandingkan dengan daerah lain. Daun Crescentia cujete didapat dari warga di Jl. Garuda, No. 168, Pringwulung, Yogyakarta dan dipanen serta
dikumpulkan. Daun yang digunakan adalah daun yang berwarna hijau, segar,
tidak berlubang dan tidak terdapat kotoran binatang.
3. Pembuatan Simplisia
Pembuatan simplisia daun Crescentia cujete diawali dengan mencuci bersih daun majapait yang telah dipanen menggunakan air mengalir dan
ditiriskan untuk meniadakan airnya. Kemudian dikeringkan kembali
menggunakan oven pada suhu 30-45 derajat celcius hingga benar-benar
kering ditandai dengan warna daun hijau kecoklatan dan mudah dihancurkan.
Selanjutnya daun diserbuk dengan mesin penyerbuk. Serbuk yang diperoleh
diayak menggunakan ayakan nomor 40.
4. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete
