PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI KOLAGENASE DARI
ORGAN DALAM IKAN BANDENG (Chanos chanos, Forskal)
TATTY YUNIARTI
Tesis
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Magister Sains
pada Program Studi Teknologi Hasil Perairan
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Purifikasi dan Karakterisasi Kolagenase dari Organ Dalam Ikan Bandeng (Chanos chanos, Forskal) adalah karya saya dengan arahan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, Februari 2010 Tatty Yuniarti C351070071
ABSTRACT
TATTY YUNIARTI. Purification and Characterization of a Collagenase from Internal Organ of Milkfish (Chanos chanos, Forskal). Under direction of Tati Nurhayati and Agoes Mardiono Jacoeb.
The texture of fish is an important quality characteristic,and soft fillets are a problem for the fish industry. The quality of fish muscle will deteriorate during iced storage of raw fish. Endogenous proteases, which are able to hydrolyze different proteins in the muscle, are important early in the deterioration process. Endogenous fish muscle proteases are located in intracellular fluids and in the sarcoplasm, or they are associated with various cell organelles. In the live animal, the proteases function in muscle protein turnover. After death, the biological regulation of the enzymes is lost, and the enzymes hydrolyze muscle proteins and resolve the rigor mortis contraction. The proteolytic enzymes to be important for the textural properties of fish muscle, namely calpains, cathepsins, and collagenases.
Endogenous collagenases may break down the connective tissue in the fish muscle and thereby lead to undesirable textural changes and gaping, in addition to rendering the components of the extracellular matrix more vulnerable to attack by other proteases. So that is important to know its characterization of collagenase.
The milkfish (Chanos chanos, Forskal) is the most widely cultured marine fish in the Indonesia. Milkfish constitutes 269.530 ton of total production volume 2.625.800 ton from aquaculture. Collagenases activity in milkfish found in internal organ, and the higest was at post rigor. We observed collagenase at crude extract from milkfish internal organ at post rigor such as intestine, piloric caeca and liver.
The objectives of this study were to study where a part of internal organ has the highest collagenase activity, to purify that’s enzyme, and to characterize the enzyme with respect to it responses to pH, temperature, and inhibitors. We also observed temperature and pH stabilization of that’s collagenase and the molecular mass of the purified.
Collagenase was purified from internal organ of milkfish (Chanos chanos, Forskal), by extraction, ammonium sulfate presipitation, ion exchange chromatography on DEAE Sephadex A-50 and gel filtration on a Sephadex G-100 column. The molecular mass of the purified enzyme was estimated by gel filtration and SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
Crude extract from intestine had the higest collagenase activity. The purification were 114,731 fold. The optimum temperature and pH of collagenase were 50 oC and pH 7-9, it was strongly inhibited by serine proteinase inhibitor (PMSF), and that activity was increased by Ca2+ and Na+. The molecular mass of
milkfish serine collagenase was estimated to be 14,63 kDa dan 27,46 kDa. Collagenase stabilized at 10-50 oC and pH 8-9.
RINGKASAN
TATTY YUNIARTI. Purifikasi dan Karakterisasi Kolagenase dari Organ Dalam Ikan Bandeng (Chanos chanos, Forskal) (Dibawah bimbingan Tati Nurhayati dan Agoes Mardiono Jacoeb).
Kolagenase adalah enzim yang dapat menghidrolisa kolagen, yaitu protein yang berbentuk serabut, terdapat hanya pada hewan, misalnya otot achilles dan pada kulit. Aktivitas kolagenase pada post mortem ikan menyebabkan kerusakan tekstur daging ikan, yaitu terpisahnya jaringan ikat daging ikan (gaping). Penelitian terdahulu menyebutkan bahwa pada ikan bandeng (Chanos chanos, Forskal) terdapat aktivitas kolagenase pada fase post rigor. Namun letak kolagenase di dalam organ dalam, aktivitas serta sifat-sifat katalitiknya belum diketahui. Hal ini diperlukan untuk mempelajari kemunduran mutu ikan bandeng. Selain itu, sebagai produk bioteknologi, kolagenase dapat digunakan sebagai alternatif sumber enzim baru, sebab sumber-sumber enzim baru masih diperlukan. Dalam penelitian ini dilakukan purifikasi dan karakterisasi kolagenase dari organ dalam ikan bandeng.
Penelitian ini bertujuan untuk menentukan letak sumber kolagenase dari organ dalam ikan bandeng beserta aktivitasnya, dan mendapatkan kolagenase yang murni beserta sifat-sifat katalitiknya. Manfaat penelitian ini adalah untuk mendapatkan informasi letak sumber kolagenase dan sifat-sifat katalitiknya sehingga dapat dimanfaatkan sesuai dengan sifatnya.
Penelitian terbagi dalam tiga tahap, yaitu preparasi, purifikasi dan karakterisasi kolagenase dari organ dalam ikan bandeng. Preparasi bertujuan untuk memisahkan organ dalam ikan bandeng yaitu hati, pilorik kaeka dan usus. Purifikasi dilakukan secara bertahap yaitu ekstraksi, pengendapan menggunakan ammonium sulfat, dialisis, kromatografi penukar ion DEAE Sephadex A-50 dan kromatografi gel filtrasi Sephadex G-100. Karakterisasi meliputi penentuan pH dan suhu optimum, pengaruh inhibitor, ion logam, kestabilan terhadap suhu, kestabilan terhadap pH dan penentuan berat molekul.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa preparasi organ dalam ikan banding dengan berat ikan bandeng 188–547 g/ekor atau dengan berat rata-rata 375,57 g/ekor mempunyai prosentase berat usus sebesar 2,49%, hati sebesar 1,23% dan pilorik kaeka sebesar 1,26%. Prosentase ini berbeda dengan penelitian yang sebelumnya, pada spesies ikan yang lain, karena perbedaan fisiologi ikan antara seperti jenis spesies ikan, ukuran ikan, cara makan dan jenis makanan, habitat dan tingkat kematangan gonad.
Aktivitas kolagenase tertinggi organ dalam ikan bandeng terdapat pada organ usus yaitu 0,141 U/ml. Tingginya aktivitas kolagenase pada organ usus diduga karena kolagenase diproduksi oleh sel-sel jenis sel stromal, sel ephitel, makrofagus dan leukosit, dan usus adalah organ pencernaan yang terbangun dari sel-sel epitelium. Beberapa jenis proteinase telah ditemukan dalam usus ikan, antara lain tripsin, kimotripsin, kolagenase, elastase, karboksipeptidase dan karboksi esterase, yang secara normal disekresikan oleh pilorik kaeka dan pancreas.
Kolagenase ini telah dapat dimurnikan dengan baik. Purifikasi menghasilkan aktivitas spesifik kolagenase sebesar 20,642 U/mg dengan kelipatan pemurnian yang tinggi sebesar 114,731 kali, dan yield yang dihasilkan dari pemurnian ini adalah 1,26%. Kelipatan pemurnian ini lebih tinggi daripada kolagenase yang telah dipurifikasi dari organ dalam ikan makarel (Scomber japanicus), organ dalam ikan filefish (Novoden modestrus), pilorik kaeka ikan tuna(Thunnus thynnus) dan hepatopancreas udang (Pandalus eous) Aoki et al. (2003)
Kolagense mempunyai suhu dan pH optimum 50 oC. Hal ini disebabkan karena ikan adalah hewan yang bersifat poikiloterm yaitu suhu badannya dipengaruhi oleh suhu lingkungan perairan. Perbedaan suhu lingkungan dapat menyebabkan perbedaan sifat enzim. Sifat enzim juga Enzim pada umumnya mempunyai temperatur optimum seperti temperatur sel. Kondisi pH optimum kolagenase ini adalah 7-9. Kolagenase ini tergolong dalam enzim yang bekerja dengan optimum pada pH netral cenderung basa.
Kolagenase meningkat aktivitasnya jika ditambah dengan ion Ca2+ dan
Na+. Penambahan ion logam sebagai kofaktor dapat mempengaruhi stabilitas enzim. Kolagenolitik proteinase yang dipurifikasi dari usus ikan Atlantic cod (Gadus morhua) mempunyai sifat termo stabil, atau stabil pada suhu tinggi dengan penambahan ion Ca2+, tetapi tanpa ion tersebut, enzim ini tidak stabil pada suhu di atas 30 oC.
Kolagenase dihambat dengan baik oleh PMSF hingga 23%. Dari prosentase penghambatannya, kolagenase ini diduga adalah jenis serin protease. Kolagenase jenis serin umumnya ditemukan pada ikan. Tetapi kolagenase dari daging ikan Pasific rockfish (Sebastes sp), termasuk dalam jenis metallo. Diduga kolagenase ini terlibat dalam degradasi kolagen dan softening pada produk seafood.
Berat molekul kolagenase adalah 27,61 kDa dan 14,36 kDa. Kolagenase jenis serin dari berbagai sumber diketahui mempunyai berat molekul bervariasi, yaitu kurang dari 30 kDa. Kolagenase jenis metallo biasanya mempunyai berat molekul metallokolegenase bervariasi dari 30 hingga 150 kDa.
Kolagenase stabil selama penyimpanan pada suhu 10-50 oC. Selanjutnya, kolagenase mengalami penurunan aktivitasnya setelah penyimpanan pada suhu 60
oC. Enzim-enzim dari organ pencernaan hewan laut mempunyai sifat bersifat
termostabil yang rendah, erta stabil pada suhu rendah. Kestabilan aktivitas kolagenase pada suhu dingin ini, pada beberapa spesies ikan masih dapat mengakibatkan perubahan sifat tekstur daging ikan, selama penyimpanan dingin.
Kolagenase pada pH 3-4 mempunyai aktivitas yang rendah, tetapi pada pH 6-11 kolagenase mempunyai aktivitas yang masih tinggi. Aktivitas tertinggi kolagenase stabil pada pH 7-9. Hal tersebut umumnya terjadi pada proteinase dari ikan mempunyai sifat stabil pada pH netral mendekati basa.
Mengingat pemurnian kolagenase dari usus ikan bandeng ini belum sempurna, karena masih terdapat dua band, maka disarankan untuk dilakukan pemurnian lebih lanjut dengan metoda penelitian yang lain, sehingga diharapkan dapat dihasilkan kolagenase yang benar-benar murni.
©Hak Cipta milik IPB, tahun 2010
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa emncantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunanlaporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa ijin IPB.
PURIFIKASI DAN KARAKTERISASI KOLAGENASE DARI
ORGAN DALAM IKAN BANDENG (Chanos chanos, Forskal)
TATTY YUNIARTI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
LEMBAR PENGESAHAN TESIS
Judul Proposal : Purifikasi dan Karakterisasi Kolagenase dari Organ Dalam Ikan Bandeng (Chanos chanos, Forskal)
Nama : Tatty Yuniarti NIM : C351070071
Disetujui:
Komisi Pembimbing
Dr. Tati Nurhayati, S.Pi ,M.Si Dr.rer.nat. Ir. Agoes M Jacoeb, Dpl.-Biol
Ketua Anggota
Dr. Tati Nurhayati, S.Pi, M.Si Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penelitian dengan judul Purifikasi dan Karakterisasi Kolagenase dari Organ Dalam Ikan Bandeng (Chanos chanos, Forskal) telah selesai. Tesis ini disusun sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Teknologi Hasil Perairan, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Ruddy Suwandi, M.S, M.Phil selaku Ketua Departemen Teknologi Hasil Perairan, Ibu Dr. Tati Nurhayati, S.Pi, M.Si selaku Ketua Program Studi S2 Teknologi Hasil Perairan dan ketua komisi pembimbing serta Bapak Dr. Ir. rer.nat. Agoes Mardiono Jacoeb, Dpl.-Biol selaku anggota komisi pembimbing, serta seluruh staf pengajar pada Departemen THP, FPIK, IPB. Disamping itu, penghargaan penulis sampaikan atas ijin menjalankan tugas belajar, kepada Ibu Dr. Iin Siti Djunaidah, selaku Kepala BPSDM, Departemen Kelautan dan Perikanan, Bapak. Dr. Maimun, M.Ed selaku Direktur Sekolah Tinggi Perikanan Jakarta, Bapak Iskandar Musa, A.Pi, MM selaku Ketua Jurusan Penyuluhan Perikanan STP serta segenap rekan-rekan Sekolah Tinggi Perikanan Jakarta khususnya Jurusan Penyuluhan Perikanan. Terima kasih juga atas terselenggaranya penelitian ini yang dibiayai oleh Dana Hibah Bersaing Batch DP2M-Ditjen Dikti-DEPDIKNAS Thun 2009 atas nama Dr. Tati Nurhayati, S.Pi, M.Si.
Penulis juga menyampaikan terima kasih atas kerja sama yang baik selama penelitian, kepada Ibu Ema, Ibu Ika, Mbak Selin, Mas Wahyu, Mbak Ida, Widodo Setiyo Pranowo, Sefri, Febri, Ari, Fahrul, Zen, Nina, Kiki, Riri, Iful, Krisan, Elin, Ulina, Diah, Mbak Rita, Mbak Julin, Rafitah, Sitkun dan tanpa mengurangi rasa terima kasih ini, kepada temen-teman lain yang tidak bisa disebutkan namanya satu per satu.
Kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan untuk kesempurnaan penelitian ini. Semoga penelitian bermanfaat.
Bogor, Februari 2010 Tatty Yuniarti
