y = 0,004x + 0,019 R² = 0,998 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 50 100 150 200 250 Ab sor b an si Konsentrasi (ppm)
Lampiran 1. Prosedur analisa kadar amilosa modifikasi metode IRRI
(AOAC1995)
Sebanyak 100 mg sampel dilarutkan dalam 1 ml etanol 95% dan 9 ml NaOH 1N. Kemudian larutan dipanaskan pada suhu 80-100oC selama ± 10 menit sampai tergelatinisasi. Larutan didinginkan lalu ditera pada labu takar 100 ml dengan akuades sebagai larutan induk. Selanjutnya diambil 1 ml sampel yang telah diencerkan dari larutan induk. Sampel tersebut ditambahkan dengan 0,1 ml iod 0,2%, 0,2 ml asam asetat 1N, dan 3 ml akuades. Setelah didiamkan selama 20 menit lalu diukur nilai absorbansi pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 620 nm.
Untuk kurva standar dibuat dengan cara yang sama dengan penentuan kadar amilosa pada sampel. Sebanyak 40 mg amilosa standar ditambahkan dengan 1 ml etanol 95% dan 9 ml NaOH 1N lalu dipanaskan pada suhu 80-100oC selama ± 10 menit sampai tergelatinisasi. Kemudian larutan didinginkan lalu dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan ditera dengan akuades. Selanjutnya dari labu takar tersebut dibuat beberapa konsentrasi mulai dari 50, 100, 150, sampai 200 ppm. Sampel diambil sebanyak 1ml dari masing-masing konsentrasi lalu ditambahkan 0,1 ml iod 0,2%, 0,2 ml asam asetat 1N, dan 3 ml akuades. Setelah didiamkan selama 20 menit, diukur nilai absorbansi pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 620 nm.
Kurva Standar Kadar Amilosa
Persamaan kurva standar : y = 0,0046x + 0,0196 Keterangan : x = konsentrasi pati
y = nilai absorbansi Cara menentukan kadar amilosa :
1.) Data hasil pembacaan spektrofotometer adalah nilai y
2.) Tentukan nilai x dengan menggunakan persamaan linier kurva standar amilosa 3.) Perhitungan dengan rumus:
y = 0,019x + 0,044 R² = 0,999 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 10 20 30 40 50 A b s o r b a n s i Konsentrasi gula (ppm)
Lampiran 2. Prosedur pengukuran total gula dengan metode fenol-sulfat
(Dubois et al. 1956) dan kurva standar glukosa untuk total gula
Prosedur Pengukuran Total Gula
Sampel sebanyak 1 ml (mengandung ≤ 100 µg karbohidrat) ditambahkan dengan 0,5 ml larutan fenol 5% kemudian dikocok-kocok dengan vortex agar homogen. Dilakukan penambahan 2,5 ml H2SO4 secara langsung pada bagian permukaan (tanpa menyentuh dinding tabung reaksi). Reaksi
pencampuran didiamkan tanpa gangguan selama 10 menit. Pembacaan nilai absorbansi dilakukan minimal 30 menit setelah pengocokan pada panjang gelombang 490 nm.
Pembacaan pada spektrofotometer memberikan nilai dalam satuan absorbansi sehingga untuk mengetahui jumlah total gula dalam sample tesebut, terlebih dahulu dibuat kuva standar glukosa. Untuk pembuatan kuva standar glukosa digunakan glukosa standar (0, 10,20, 30, dan 40 ppm). Masing-masing diambil 1 ml sesuai dengan prosedur pengukuran total gula. Hasil pembacaan pada spektrofotometer dikumpulkan dan dicari persamaannya, dari persamaan inilah dapat diketahui jumlah total gula yang terdapat di dalam sampel.
Kurva Standar Glukosa Untuk Total Gula
Persamaan kurva standar : y = 0.0198x + 0.0445 Keterangan : x = nilai konsentrasi total gula y = nilai absorbansi
Konsentrasi(ppm) Abs 10 0,245 10 0,242 10 0,236 20 0,443 20 0,435 20 0,442 30 0,639 30 0,646 30 0,642 40 0,833 40 0,831 40 0,835
y = 0,134x + 0,058 R² = 0,996 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 1 2 3 4 5 6 7 A b s o r b a s i Konsentrasi gula (ppm)
Lampiran 3. Tata cara analisa gula pereduksi metode Park-Johnson yang
dimodifikasi (Hizukuri et al. 1981)
Prinsip : Tereduksinya ferrisianida menjadi ferrosianida oleh senyawa gula pereduksi. Jumlah ferrosianida yang terbentuk ekivcalen dengan jumlah gula pereduksi dalam sampel. Prosedur : Sampel sebanyak 1 ml (mengandung 10µg gula pereduksi) ditambahkan 0,5 ml
larutan buffer sodium karbonat–sodium hidrogen karbonat (4,8 g Na2CO3, 9,2 g NaHCO3, dan 0,65 g KCN yang dilarutkan dalam aquades sampai 1L) dan ditambahkan 0,5 ml larutan potassium ferrisianid 0,1 % (b/v). Campuran larutan tersebut dipanaskan dalam penangas air selama 15 menit dan dinginkan dalam air mengalir selama 10 menit. Larutan tersebut ditambahkan 2,5 ml larutan ferric amonium sulfat (3g (NH4) Fe (SO3)4. 2H20 di dalam 1 L larutan 50 mM H2SO4), dikocok-kocok dengan vortex dan didiamkan selama 20 menit pada suhu ruang sebelum pembacaan absorbansi pada 715 nm.
Kurva Standar Gula Pereduksi
Konsentrasi (ppm) Abs 1 0,190 1 0,193 2 0,328 2 0,330 3 0,447 3 0,436 4 0,620 4 0,620 5 0,731 5 0,724 6 0,865 6 0,844
Persamaan kurva standar : y = 0,134x + 0,0584
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 A b s o r b a n s i Waktu (menit)
Lampiran 4. Penentuan aktivitas α-amilase (bacterial)
Menit Absorbansi Gula Pereduksi (μg/ml) Jumlah Gula Pereduksi (μmol) Unit/ ml Enzim Larutan Induk (fp=1000x) 0 0,066 14,179 15 0,158 366,067 1,95493 0,521316 521,316 30 0,244 680,312 1,746 0,46555 465,55 45 0,289 845,703 0,919 0,245025 245,025 60 0,365 1125,032 1,552 0,41382 413,82 75 0,375 1161,785 0,204 0,05445 54,45 90 0,402 1264,696 0,572 0,15246 152,46 105 0,404 1270,209 0,031 0,00817 8,17 120 0,553 1817,840 3,042 0,811305 811,305 135 0,555 1827,028 0,051 0,01361 13,61 150 0,604 2005,284 0,99 0,264082 264,082 165 0,622 2069,603 0,357 0,095287 95,287 180 0,664 2225,806 0,868 0,231412 231,412
∑U =
811,305 U/ml Cara Perhitungan : Menit Ke-0 :Persamaan kurva standar y = 0,134x+ 0,0584
gula pereduksi (x) = (0,066 – 0.0584) / 0,134 = 0,056716 Faktor pengenceran = 0,056716 *250 = 14,179 μg/ml Menit ke-15 :
gula pereduksi (x) = (0,158 – 0.0584) / 0,134 =0,743284 Faktor pengenceran = 0,743284 * 1,97*250 = 366,067 μg/ml
Selisih gula pereduksi (menit ke-0 dan ke-15) = 366,067– 14,179= 351,888
Σ mol gula pereduksi = Gula pereduksi / BM glukosa = 351,888 μg/ml /180 μg/μmol
= 1,95493 μmol/ml Enzim yang ditambahkan adalah 10 ml dan Total larutan campuran 40 ml.
Unit / ml enzim = (1,95493 μmol/ml * (40/10 ) ) / 15 menit = 0,521316 U/ml Pengenceran terhadap α-amilase adalah 1000 kali, maka aktivitas enzim pada larutan induk adalah = 0,521316* 1000 = 521,316U/ml
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 A b s o r b a n s i Waktu (menit)
Lampiran 5. Penentuan aktivitas α-amilase (pankreatin)
∑U =
758,430 U/mlCara Perhitungan
:
Menit Ke-0 :
Persamaan kurva standar y = 0,134x+ 0,0584 gula pereduksi (x) = (0,157– 0.0584) / 0,134 = 0,7358 Faktor pengenceran = 0,7358*200 = 147,16 μg/ml Menit ke-15 :
gula pereduksi (x) = (0,5– 0.0584) / 0,134 = 3,2955 Faktor pengenceran = 3,2955*200 = 659,10μg/ml
Selisih gula pereduksi (menit ke-0 dan ke-15) = 659,10– 147,16 = 511,94
Σ mol gula pereduksi = Gula pereduksi / BM glukosa = 511,94 μg/ml /180 μg/μmol
= 2,844 μmol/ml Enzim yang ditambahkan adalah 10 ml dan Total larutan campuran 40 ml.
Unit / ml enzim = (2,844 μmol/ml * (40/10 ) ) / 15 menit = 0,75843 U/ml Pengenceran terhadap α-amilase adalah 1000 kali, maka aktivitas enzim pada larutan induk adalah = 0,75843 * 1000 = 758,43 U/ml
Menit Absorbansi Gula Pereduksi (μg/ml) jumlah gula pereduksi (μmol) Unit/ ml Enzim Larutan Induk (fp=1000x)
0 0,157 146,418 15 0,5 658,358 2,844 0,75843 758,430 30 0,683 931,493 1,517 0,40464 404,640 45 0,713 977,015 0,252 0,06744 67,440 60 0,723 991,194 0,078 0,02101 21,010 75 0,742 1020,299 0,161 0,04312 43,120 90 0,766 1056,119 0,199 0,05307 53,070 105 0,816 1130, 746 0,414 0,11056 110,560 120 0,824 1141, 940 0,062 0,01658 16,580 135 0,826 1145, 672 0,02 0,00553 5,530 150 0,834 1157,612 0,066 0,01769 17,690 165 0,848 1178,507 0,116 0,03096 30,960 180 0,852 1183,731 0,029 0,00774 7,740
