BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian
Penelitian yang dilakukan merupakan penelitian analitik dengan menggunakan desain case-control.
3.2 Tempat Penelitian
Amplifikasi DNA dan digesti enzim restriksi dilaksanakan di Laboratorium
Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.3 Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai April 2015 sampai bulan Juli 2016.
3.4 Populasi Penelitian
Penderita PPOK dan non PPOK.
3.5 Sampel Penelitian
Sampel berasal dari penelitian Dr.dr. Amira Permatasari Tarigan, Sp.P dalam
bentuk isolat DNA sebesar 30 sampel PPOK dan 30 sampel non PPOK.
3.6 Variabel Penelitian
3.7 Besar Sampel
Besar sampel ditentukan berdasarkan jenis penelitian case-control: 2
Zα√2PQ+Zβ√P1Q1+P2Q2 n1 = n2 =
(P1-P2)
dimana: P1 = 0,23 (frekuensi penderita PPOK (0,23%) (Li et al., 2012). P2 = 0,50 (perkiraan proporsi trial)
P = ½ (P1+P2) Q = 0,64 (1- P)
Q1 = 0,79 (1- P1) Q2 = 0,50 (1- P2)
Zα = 1,96 (Nilai standar normal deviasi untuk α) Zβ = 0,84 (Nilai standar normal deviasi untuk β)
n1 = n2 = 30.
Besar sampel yang telah memenuhi syarat untuk penderita PPOK (kasus) adalah 30 dan non PPOK (kontrol) adalah 30.
3.8 Kriteria Inklusi dan Eksklusi
Kriteria sampel penelitian kelompok kasus dan kontrol adalah kriteria untuk
* Untuk PPOK Kriteria Inklusi:
1. Penderita PPOK yang sudah dipastikan dengan hasil pemeriksaan spirometri: VEP1/KVP≤70%, 15 menit setelah diberikan salbutamol Inhaler dosis terukur dua semprot dengan alat bantu (spacer), derajat menurut GOLD : ringan-sangat berat.
2. Umur penderita ≥ 40 tahun 3. Laki-laki
4. Perokok aktif atau mantan perokok dengan riwayat merokok ≥ 200 Indeks Brinkman
5. Bersedia mengikuti prosedur penelitian dan diambil sampel darahnya,
dinyatakan secara tertulis setelah mendapatkan penjelasan mengenai penelitian. Kriteria Eksklusi:
1. Penderita asma, TB paru atau penyakit paru lainnya
2. Keadaan umum penderita dalam keadaan lemah (kaheksia) 3. Terdapat kesulitan dalam pengambilan darah
* Untuk non PPOK Kriteria Inklusi :
1. Normal faal paru yang sudah dipastikan dengan hasil pemeriksaan spirometri:
VEP1/KVP ≥ 70%
2. Umur penderita ≥ 40 tahun 3. Laki-laki
5. Bersedia mengikuti prosedur penelitian dan diambil sampel darahnya, dinyatakan secara tertulis setelah mendapatkan penjelasan mengenai penelitian. Kriteria Eksklusi :
1. Penderita penyakit paru seperti TB, Bronkitis kronik atau penyakit paru lain. 2. Keadaan umum penderita dalam keadaan lemah (kaheksia)
3. Terdapat kesulitan dalam pengambilan darah 4. Mempunyai keluarga yang berpenyakit PPOK
3.9 Definisi Operasional
No. Variabel Definisi Operasional Cara Ukur
1. Polimorfisme Gen MMP-12
Kriteria: perbedaan alel dalam lokus yang sama dengan gen MMP-12
Analisa
Nominal homozigot AA, GG dan heterozigot AG
2. PPOK Sudah ditetapkan sebelumnya oleh ahli paru
- - Nominal -
3. Non-PPOK Sudah ditetapkan sebelumnya oleh ahliparu
1.10. Pelaksanaan Penelitian 3.10.1 Isolasi DNA
Alat dan bahan :
1. Sarung tangan
2. Pipet automatic 1000µl, 100µl
3. Tabung ependorf 1,5ml 4. Sentrifus
5. Vortex
6. Tips steril berbagai ukuran 7. Stopwatch
8. Kulkas 9. Kertas label 10.Pena tahan air
11.Kit ekstraksi DNA [the Wizard® Genomic DNA Purification Kit, (Promega Corporation USA)].
Cara Kerja :
1. Label dan kode tabung ependorf untuk sampel darah
2. Darah EDTA disentrifus pada 3000 rpm selama 15 menit
3. Pisahkan plasmanya, lalu ambil 300µl leukosit dan masukkan kedalam tabung
ependorf 1,5ml kemudian ditambah 900µl EL bufer dan campur dengan cara dibolak-balik secara perlahan
4. Inkubasi selama 10 menit didalam kulkas lalu disentrifus pada kecepatan 13.000
5. Buang supernatan dengan hati-hati agar endapan tidak ikut terbuang dan tahapan 2-4 diulang sampai 3x dan terlihat warna supernatan menjadi jernih dan endapan berwarna putih
6. Setelah diperoleh endapan yang berwarna putih atau supernatan yang jernih, buang supernatan dan endapan divortex selama 20 detik
7. Tambahkan 300µl nuclei lysis solution dan campurkan dengan cara dibolak-balik
8. Tambahkan 100µl protein precipitation, dan vortex selama 20 detik
9. Campuran tersebut disentrifugasi pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit 10.Pindahkan supernatan kedalam tabung ependorf yang berisi 300µl isopropanol,
lalu dibolak-balik sampai terlihat benang-benang DNA
11.Campuran disentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit 12.Buang supernatan dan tambahkan larutan etanol 70%
13.Sentrifugasi kembali pada kecepatan 13.000 rpm selama 1 menit
14.Setelah proses sentrifugasi selesai, etanol diaspirasikan menggunakan pipet dan
dikeringkan selama 1 jam
15.Setelah kering, tambahkan 100µL DNA rehidration solution dan inkubasi pada suhu 4oC selama 1 malam. DNA dapat disimpan di freezer pada suhu -20oC
3.10.2 Amplifikasi isolat DNA dengan Polymerase Chain Reaction
Alat dan Bahan :
1. Mesin PCR/Thermal Cycler
2. Mikropipet 3. Tabung PCR
4. Tabung ependorf 1,5 ml 5. Tip steril berrbagai ukuran 6. Mesin sentrifugasi
7. PCR mix (Go Taq® Green Master Mix (Promega USA)] 8. Sampel DNA
9. Primer forward MMP-12: 5’GTCAAGGGATGATATCAGCT-3’ 10.Primer reverse MMP-12: 5’CTTCTAAACGGATCAATTCAG-3’ 11.Kertas label dan pena
Cara Kerja :
1. Label tabung PCR sesuai dengan kode nomor sampel
2. Buat campuran master mix untuk reaksi PCR dengan total volume 21µl untuk setiap sampel DNA yang terdiri dari 12,5µl master mix, 1µl masing-masing
primer forward dan reverse, dan 6,5 µl nuclease free water
3. Tambahkan 4µl isolat DNA sampel pada campuran master mix dan masukkan ke
dalam mesin PCR (thermal cycler)
4. MMP-12 pada sampel DNA diamplifikasi dengan menggunakan mesin PCR (thermal cycler) dengan suhu pre-denaturasi 95oC selama 5 menit, diikuti 28
selama 30 detik, dan elongasi pada suhu 72oC selama 45 detik, dan tahap akhir pada suhu 72o C selama 10 menit (Li et al., 2012)
5. Hasil elektroforesis pada agarose 2% akan terlihat fragmen DNA sebesar 137
bp (Li et al.,2012)
3.10.3 Digesti amplifikat DNA dengan Enzim Restriksi Alat dan Bahan :
1. Enzim Restriksi Pvu II (Thermoscientific®)
2. Buffer G
3. Nuclease Free Water
4. Produk PCR
5. Tabung ependorf 1,5ml 6. Mikropipet
7. Inkubator 8. Stopwatch
9. Kertas label dan pena tahan air
Cara Kerja :
1. Label tabung ependorf 1,5 ml sesuai kode nomor sampel
2. Buat campuran reaksi RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
dengan total volume 10µl untuk setiap sampel yang terdiri dari 2,5µl produk PCR, 0,3µl enzim Pvu II, 1,5µl Buffer G dan 6,2µl nuclease free water
4. Dilakukan elektroforesis pada agarose 2% maka akan terlihat 2 band pada homozigot AA (137bp, 119bp), 3 band pada heterozigot AG (137bp, 119bp, 18bp) dan 2 band pada homozigot GG (119bp, 18bp) (Li et al.,2012)
3.10.4 Visualisasi Hasil Restriksi dengan Elektroforesa Gel Agarosa Alat dan Bahan :
1. Top Vision Agarosa 100 g(Thermo scientific®) 2. TAE Buffer 1 x
3. Flask Beaker 250 ml 4. Magnetic Hot Stirrer
5. Timbangan Digital 6. Ethidium Bromide
7. Aluminium Foil
8. Gel Casting Tray
9. Gel Comb
10.Gel Documentation
11.Loading Dye dan Marker DNA
Cara Kerja :
1. Untuk membuat gel, timbang 0,7g agarosa dalam 35 ml TAE Buffer (Li et al.,
2012). Panaskan dan aduk diatas magnetic hot stirrer hingga larutan mendidih dan berwarna jernih.
2. Matikan pemanasnya dan ditambahkan 1µl ethidium bromide dan diaduk
3. Cairan dituang ke dalam casting tray dengan gel comb dan biarkan sampai mengeras
4. Setelah gel mengeras cabut gel comb perlahan-lahan
5. Pipet loading dye 2µl dan marker DNA 5µl, 3µl produk PCR dan produk RFLP masing-masing 10µl ke dalam sumur-sumur gel
6. Catat posisi sampel pada sumur-sumur gel
7. Jalankan elektroforesis selama 60 menit dengan tegangan 80 volt
8. Pindahkan gel ke dalam gel documentation untuk analisa dan dokumentasi hasil
elektroforesis
3.11 Kerangka Operasional
Homozigot Homozigot Heterozigot
AA GG AG DNA pasien dan kontrol yang sudah ada
PPOK n=30
Non-PPOK n=30
Genotyping dengan PCR
3.12 Analisa Data
Data akan dianalisa secara statistik dengan menggunakan SPSS. Distribusi genotip dan frekuensi alel yang akan diuji signifikansinya dengan menggunakan
chi-square test (x2), sedangkan distribusi genotip dan frekuensi alel individu dengan kejadian PPOK akan dianalisa menggunakan analisis Hardy Weinberg Equilibrium
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
4.1.1 Deskripsi Hasil Penelitian
Telah dilakukan penelitian analitik dengan desain penelitian case control, untuk
mengetahui hubungan polimorfisme gen MMP-12 dengan kejadian PPOK dibandingkan dengan non PPOK yang dilakukan di Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
Sampel penelitian merupakan isolat DNA yang disimpan di Laboratorium Terpadu FK USU yang merupakan sampel dari penelitian Dr.dr. Amira Permatasari
Tarigan, Sp.P dengan judul penelitian Hubungan Polimorfisme Gen TNFα Pada Posisi -308 dan -238 Dengan Kejadian Penyakit Paru Obstruktif Kronik yang merupakan disertasi program studi Doktor (S3) Ilmu Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas
Sumatera Utara yang telah memenuhi krtiteria inklusi dan eksklusi. Jumlah keseluruhan sampel adalah 60, dengan 30 penderita PPOK dan 30 yang merupakan kontrol dan
4.1.2 Analisa Hasil Penelitian
Berdasarkan analisa polimorfisme terhadap 30 sampel PPOK dan 30 sampel non PPOK diperoleh varian homozigot AA hampir sama pada PPOK 28 (93,3%) maupun non PPOK 29 (96,7%). Varian heterozigot AG ditemukan 2 (6,66%) pada PPOK dan 1
(3,33%) pada non PPOK. Varian GG sama sekali tidak dijumpai sehingga kemungkinan pada populasi yang diteliti dominan jenis wildtype.
Analisa data diuji secara statistik dengan menggunakan tekhnik chi square untuk melihat adanya hubungan antara frekuensi distribusi polimorfisme gen MMP-12 homozigot AA, heterozigot AG dan homozigot GG pada PPOK dan non PPOK. Hasil
uji statistik chi square menyatakan tidak ada hubungan polimorfisme gen MMP-12 pada PPOK (p>0,05) seperti yang ditunjukkan pada tabel 4.1
Tabel 4.1 Hubungan Antara Polimorfisme Gen MMP-12 dengan Kejadian PPOK
POLIMORFISME
PPOK NONPPOK TOTAL
Nilai p* n % n % n %
AG 2 6.7% 1 3.3% 3 5.0%
0.5 AA 28 93.3% 29 96.7% 57 95.0%
GG 0 0 0 0 0 0
TOTAL 30 100.0% 30 100.0% 60 100.0%
Tabel 4.2 Analisa Hukum Hardy-Weinberg Equilibrium dengan menggunakan
HWE calculator pada penderita PPOK
Genotypes AA AG GG Compute Exp.
H-Tabel 4.3 Analisa Hukum Hardy-Weinberg Equilibrium dengan menggunakan
HWE calculator pada penderita non PPOK
Genotypes AA AG GG Compute Exp.
H-W Equilibrium
Freq.
& Chi2P-Value
Clear Form Values
Observed 29 1 0
ini tidak menyimpang dari Hukum Hardy-Weinberg Equilibrium. Berdasarkan analisa
HWE tidak terdapat hubungan yang signifikan pada frekuensi gen MMP-12 yang dinyatakan dengan nilai p≥0,05 (seperti yang ditunjukkan pada tabel 4.2 dan 4.3) yang berarti bahwa populasi yang diteliti sesuai dengan HWE.
4.2Pembahasan
Pada hasil penelitian ini polimorfisme gen MMP-12 -82 A/G tidak berperan secara signifikan dalam menentukan seseorang terkena PPOK atau non PPOK. Penelitian ini
menunjukkan hasil yang tidak signifikan (nilai p=0,5). Hal ini sejalan dengan penelitian Li et al (2012) yang menemukan pada populasi di Cina Han dengan nilai p=0,537 yang
berarti bahwa hasil yang diperoleh juga tidak signifikan (p>0,05).
Sejalan dengan penelitian Schirmer et al (2009) pada populasi Brazilia (p=0,11) dan Zhou et al (2013) pada populasi Kaukasia (p=0,877) juga mendapatkan hasil yang
tidak signifikan (p>0,05) yang artinya tidak menemukan hubungan antara MMP-12 dengan kejadian PPOK.
Karakteristik sampel (PPOK dan non PPOK) pada penelitian ini adalah populasi seluruh orang Indonesia dengan berbagai macam suku. Karakteristik pada penelitian Li
et al (2012) adalah populasi orang Cina suku Han dengan kebudayaannya. Kelompok
suku Han ini merupakan salah satu suku yang ada pada bangsa Cina.
Karakteristik sampel pada penelitian Schirmer et al (2009) adalah populasi
orang Brazilia dari Pusat Rehabilitasi Paru dan Rumah Sakit Umum Brazil. Karakteristik pada penelitian Zhou et al (2013) adalah populasi orang Kaukasia.
Hal yang sebaliknya ditemukan oleh Hunninghake et al (2009) pada populasi
-82A/G adalah faktor resiko PPOK. Haq et al (2010) pada populasi Eropa (p=0,03) menemukan bahwa alel AG pada Polimorfisme Nukleotida Tunggal (SNP) positif berhubungan dengan perokok dewasa sebagai faktor penyebab PPOK.
Karakteristik sampel pada penelitian Hunninghake et al (2009) pada populasi dengan tingkat resiko tinggi PPOK, yaitu dari Pusat Penelitian Genetik Asma Kosta
Rika (GACRS), Program Managemen Asma pada Anak (CAMP), Pusat Penelitian PPOK Boston (BAMSE), Pusat Pemulihan Nasional Emfisema (NETT), Studi Kohort pada Perokok Lovelace, dan Penelitian PPOK berdasarkan Usia Normatif (NAS).
Karakteristik sampel pada penelitian Haq et al (2010) adalah populasi Eropa secara keseluruhan (Kaukasia berkulit putih) meliputi Barselona (Spanyol), Bristol
(Inggris), Dublin (Irlandia), Edinburgh (Inggris), Leiden (Belanda) dan Pisa (Italia). Pada hasil penelitian ini tidak tampak band 18bp dari homozigot GG. Hal ini dikarenakan berat molekulnya sebesar 18bp sangat kecil dan juga kecepatan
elektroforesisnya sangat tinggi dalam gel agarosa sehingga tidak ditemukan (Li et al.,
2012).
Isolat DNA tersimpan yang digunakan pada penelitian ini tidak dilakukan
pengukuran kalibrasinya. Bahan biologi tersimpan ini masih dalam keadaan yang cukup baik, dibuktikan dari hasil amplifikasi isolat DNA pengukuran PCR dan RFLP pada analisa elektroforesa gel agarosa 2% tampak band pada 137bp dan 119 bp.
MMP-12 merupakan famili endopeptidase dalam golongan makrofag metaloelastase yang memiliki kemampuan untuk memecah dinding matriks ektraselular
Peningkatan aktivitas MMP-12 berhubungan dengan penghancuran dan remodeling dari matriks ekstraselular, seperti invasi tumor, penyakit peridontal, reumatoid artritis, dan penyakit vaskular (obstruktif kronik) (Haq et al., 2010).
Polimorfisme MMP-12 -82A/G dalam area promotor telah terbukti memiliki efek pada ekspresi MMP-12. Pembawa alel A pada gen MMP-12 memiliki aktivitas
transkripsi yang lebih tinggi dari pembawa alel G (Schirmer et al., 2009). Polimorfisme tersebut di area promotor dengan alel A akan mempengaruhi pengikatan faktor transkripsi Aktivator Protein-1 (AP-1) yang berhubungan dengan peningkatan aktivitas
transkripsi (Wieczorek et al., 2013).
Vlaykova dan Dimov (2011) dan Nguyen et al (2013), menyatakan bahwa
substitusi alel A→G pada posisi -82 di area yang berdekatan dengan elemen AP-1
binding site dan itu menunjukkan bahwa polimorfisme mempengaruhi pengikatan faktor transkripsi AP-1. Afinitas ikatan yang lebih tinggi dari AP-1 ke alel A berhubungan
dengan aktivitas promotor MMP-12 yang lebih tinggi pada sel makrofag. Polimorfisme MMP-12 -82A/G telah diselidiki berhubungan dengan resiko terjadinya PPOK.
Nakamura, 2011 juga menemukan bahwa alel A berhubungan dengan penurunan fungsi paru pada polimorfisme -82A/G. Hal tersebut juga berkaitan dengan ketidakseimbangan protease-antiprotease dan stres oksidatif.
Hunninghake et al., 2009 menemukan bahwa alel minor dari Single Nucleotide Polymorphism (SNP) di MMP-12 (-82A→G) positif berhubungan dengan penurunan fungsi paru pada perokok dewasa sebagai faktor risiko pada PPOK.
Berdasarkan HWE pada penelitian ini berada dalam keseimbangan dengan signifikansi nilai p HWE > 0,05. HWE menyatakan distribusi frekuensi alel dalam suatu
prediksi alel suatu populasi pada masa depan sehingga berkaitan pada penelitian yang berhubungan dengan polimorfisme.
Terdapat beberapa jenis dari golongan gen MMP lain yang secara teori
berhubungan secara signifikan dengan kejadian PPOK, misalnya MMP-1 dan MMP-9. Berdasarkan teori oksidan-antioksidan dan protease-antiprotease juga berhubungan
dengan patogenesis PPOK.
Berdasarkan temuan-temuan tersebut, telah diperoleh hasil yang berbeda yaitu ada yang mendapatkan hasil positif dan berhubungan dengan kejadian PPOK (p<0,05),
tetapi ada pula yang hasilnya negatif dan tidak ditemukan hubungan antara polimorfisme MMP-12 dengan kejadian PPOK (p>0,05). Hal ini disebabkan pada
populasi Indonesia yang diteliti pada studi ini hanya ditemukan distribusi genotip Homozigot AA dan Heterozigot AG sedangkan homozigot GG tidak ditemukan. Berdasarkan hasil yang paradoks tersebut, tidak terdapat hubungan yang signifikan yang
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian polimorfisme gen MMP-12 dengan menggunakan
sampel isolat DNA tersimpan penderita PPOK dan non PPOK dengan analisa statistik dan beberapa pembahasan dapat disimpulkan bahwa:
1. Tidak terdapat hubungan antara polimorfisme gen MMP-12 dengan kejadian
PPOK dan non PPOK
2. Pada PPOK ditemukan distribusi genotip Homozigot AA berjumlah 28 dan
Heterozigot AG berjumlah 2
3. Pada non PPOK ditemukan distribusi genotip Homozigot AA berjumlah 29 dan Heterozigot AG berjumlah 1
4. Isolat DNA tersimpan pada penelitian ini masih dalam kondisi cukup baik dan masih bisa digunakan untuk penelitian selanjutnya
5. Untuk analisa elektroforesis hasil RFLP dengan enzim restriksi Pvu II lebih baik menggunakan agarose 4% untuk memaksimalkan visualisasi, karena diantara band 137bp dan 119bp merupakan jarak yang tidak terlalu jauh.
5.2Saran
1. Dilakukan penelitian lanjutan pada analisis polimorfisme gen MMP yang lain untuk melihat hubungannya dengan kejadian PPOK
