ELEKTROFORESIS
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarose merupakan matriks penyangga untuk separasi protein dan asam nukleat. Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektrode negatif. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya (Batur, 2008).
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Elektroforesis gel tidak hanya digunakan sebagai metode analisis, tetapi secara rutin digunakan untuk persiapan memurnikan fragmen-fragmen DNA tertentu (Klug, 2009). Molekul-molekul DNA itu bermuatan negatif dan di dalam medan listrik, molekul DNA bergerak melalui gel pada kecepatan yang berbeda tergantung ukurannya: molekul DNA yang kecil dapat dengan mudah melewati gel dan karenanya bergerak lebih cepat dibandingkan molekul yang lebih besar (Old, 1989).
Molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Gel agarosa biasanya digunakan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb), sedangkan gel poliakrilamid digunakan untuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil (biomul.wordpress.com). Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa , PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut (Batur, 2008). Keuntungan khusus yang diperoleh dengan melakukan elektroforesis gel adalah bahwa pita DNA dapat dideteksi dengan kepekaan yang tinggi.
Keuntungan khusus yang diperoleh dengan melakukan elektroforesis gel adalah bahwa pita DNA dapat dideteksi dengan kepekaan yang tinggi. Selain dapat memunculkan fragmen-fragmen DNA yang panjangnya berbeda-beda, elektroforesis gel dapat memisahkan konfigurasi molekul yang berbeda-beda dari suatu molekul DNA.molekul DNA yang berbentuk lingkaran tutup kovalen, lingkaran longgar, dan berbentuk lurus memiliki kecepatan yang berbeda-beda (Old, 1989).
Elektroforesis dengan hubungannya dengan bioteknologi
Bioteknologi adalah aplikasi prinsip-prinsip ilmu dan rekayasa dalam pengolahan bahan-bahan menggunakan agen biologis untuk menghasilkan barang dan jasa. Bioteknologi yang
berpotensi dikembangkan di Indonesia meliputi bioteknologi pertanian, farmasi dan kesehatan, industri (bioproses), lingkungan, dan kelautan.
Elektroforesis merupakan teknik pemisahan suatu molekul dalam suatu campuran di bawah pengaruh medan listrik. Molekul terlarut dalam medan listrik bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan oleh rasio muatan dan massa.DNA akan bergerak ke arah anoda dan molekul dengan ukuran paling kecil akan bergerak paling jauh/cepat.
Terdapat hubungan yang erat antara elektroforesis dengan bioteknologi. Misalnya dalam bidang kesehatan, elektroforesis dapat berfungsi sebagai kemajuan dalam bidang bioteknologi kesehatan. Seperti dalam memecahkan permasalahan yang sering timbul perebutan anak, mencari orangtua kandung hingga pembuktian teroris membuat tes DNA menjadi hal utama yang paling ditunggu. Tes DNA saat ini sudah makin familiar, apalagi dengan bermacam kasus yang terjadi di Indonesia. Berkat tes DNA, proses penyelidikan pun terbantu dan kebenaran lebih mudah terungkap. Tes DNA biasanya dilakukan untuk tujuan pribadi maupun tujuan umum seperti kasus-kasus untuk kepentingan penyelidikan polisi.
DNA atau Deoxyribo Nucleic Acid merupakan asam nukleat yang menyimpan semua informasi tentang genetika. DNA inilah yang menentukan jenis rambut, warna kulit dan sifat-sifat khusus dari manusia.Metode yang digunakan dalam tes DNA adalah dengan mengidentifikasi fragmen-fragmen dari DNA itu sendiri. Secara sederhananya, yaitu metode untuk mengidentifikasi, menghimpun dan menginventarisir file-file khas karakter tubuh. Di dalam inti sel, DNA membentuk satu kesatuan untaian yang disebut kromosom. Setiap sel manusia yang normal memiliki 46 kromosom yang terdiri atas 22 pasang kromosom somatik dan 1 pasang kromosom sex (XX atau XY). Setiap anak akan menerima setengah pasang kromosom
dari ayah dan setengah pasang kromosom lainnya dari ibu sehingga setiap individu membawa sifat yang diturunkan baik dari ibu maupun ayah.
Hampir semua bagian tubuh dapat digunakan untuk sampel tes DNA, tetapi yang sering digunakan adalah darah, rambut, usapan mulut pada pipi bagian dalam dan kuku. Sampel DNA yang digunakan bisa dari inti sel maupun mitokondrianya. Namun yang paling akurat adalah inti sel karena inti sel tidak bisa berubah. Biasanya yang paling sering dan mudah digunakan dalah sampel darah karena lebih gampang. Tapi sel darah yang diambil adalah sel darah putih, bukan sel darah merah, karena sel darah merah tidak mempunyai inti sel.
Akurasi kebenaran tes DNA hampir mencapai 100% akurat. Kesalahan pola DNA bisa saja terjadi, tapi sangat kecil kemungkinannya, mungkin satu diantara satu juta. Metode tes DNA yang umumnya digunakan adalah metode elektroforesis DNA. Metode ini sudahsesuai dengan standar yang dianjurkan oleh FBI, jika akan membantu dalam hal penyidikan kepolisian. Sedangkan metode tes DNA yang terbaru adalah dengan menggunakan kemampuan partikel emas berukuran nano untuk berikatan dengan DNA. Namun metode ini masih dikembangkan di Amerika.
Pada dasarnya tahapan metode tes DNA dengan cara elektroforesis meliputi beberapa tahapan berikut yaitu:
1. Preparasi sampel dan pengambilan sampel DNA (isolasi) dari bagian tubuh.
2. Pemurnian DNA dari kotoran-kotoran seperti protein menggunakan teknik sentrifugasi atau filtrasi vakum.
3. Pemasukan sampel DNA yang telah dimurnikan kedalam mesin PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai tahapan amplifikasi.
4. Hasil amplifikasi ini adalah kopi urutan DNA lengkap dari DNA sampel.
5. Karakterisasi kopi urutan DNA dengan elektroforesis untuk melihat pola pitanya. 6. Tahapan typing untuk memperoleh tipe DNA.
7. Finishing untuk mencocokan tipe-tipe DNA.
Gb 1. Elektroforesis
Komponen2 dan tahapan elektroforesis (Batur, 2008) :
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Gb 3. Contoh pemfotoan hasil elektroforesis DNA
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda (marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.
DNA memiliki muatan negatif, dan saat berada dalam aliran listrik, akan bermigrasi melalui gel menuju kutub positif. Molekul yang berukuran besar, memiliki kesulitan melewati pori-pori gel sehingga bermigrasi lebih lambat melalui gel dibandingkan DNA yang berukuran lebih kecil. (www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler)
DAFTAR PUSTAKA
Batur Agung, 2008, Electrophoresis Protein, http://oefy.blogmalhikdua.com, diunduh pada tanggal 11 November 2009
Klug, William.S., Michael R. Commings., Charlotte A. Spencer., Michael A. Palladino., 2009, Concepts of Genetics 9th Ed, Pearson Benjamin Commings, San Fransisco. hal 270
Old R.W., Primrose S.B., 1989, Prinsip-prinsip Manipulasi Gen : Pengantar Rekayasa Genetik edisi 4, Blackwell Scientific Publication, Oxford. Hal 5-11
http ://biomul.wordpress.com, diunduh tanggal 11 November 2009
MAKALAH PRESENTASI BIOTEKNOLOGI
ELEKTROFORESIS
Oleh: Kelompok 1 Ganjil Devi Putri H. 06/KG/07981 Kandhita Aliena R. 06/KG/07983 Oviani Bravista D. 06/KG/07985 Eldina Febrianifa 06/KG/07987 Renadya Elsaristy 06/KG/07989 Nurliana Puspitasari 06/KG/07991FAKULTAS KEDOKTERAN GIGI UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA 2009
