ELEKTROFORESIS SDS PAGE Makhyan Jibril A*
*Program Studi Magister Ilmu Biomedik FKUB 1. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Elektroforesis merupakan metode yang sudah dipakai oleh banyak peneliti terutama peneliti yang berkaitan dengan genetika ataupun molecular. Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat dinegara-negara berkembang akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak dibidang teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekul. Bidang ilmu pengetahuan Bidang Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah metode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Metode elektroforesis mulai berkembang akhir abad ke-19 setelah ditemukan penelitian yang menunjukkan adanya penelitian yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul yang bermuatan listrik, dalam hal ini termasuk juga protein. Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikelpartikel listrik. Metode elekroforesis telah digunakan dan dikembangkan didalam teknik analisa untuk penelitian di bidang biologi dan genetika. Metode tersebut berkembang sangat pesat sekali di zaman kemajuan teknologi, disebabkan karena pengerjaannya sangat sederhana dan sangat mudah. Di dalam ilmu biologi maupun biologi molekuler, metode elektrorofesis banyak digunakan untuk taksonomi, sistematik dan genetik dari hewan ataupun tumbuhan.
1.2. Tujuan
Untuk mengetahui proses pelaksanaan elektroforesis dan cara penggunaanya.
2. TINJAUAN PUSTAKA
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang seringdipakai dalam elektroforesis antara lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat.
Beberapa faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni: (Soedarmadji, 1996)
1. Ukuran molekul protein
Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil. 2. Konsentrasi gel
Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi.
3. Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat.
4. Medium penyangga
Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).
1. Jika ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid.
5. Kekuatan voltase
2. Voltase yang dipakai rendah (100-500) V, kecepatan migrasi molekul sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan.
3. Voltase yang dipakai tinggi (500-10000) V, mobolitas molekul meningkat secara lebih tajam dan digunakan untuk memisahkan senyawa dengan BM rendah serta jenis arus yang dipakai selalu harus searah (bukan bolak balik).
6. Temperatur medium disaat proses elektroforesis berlangsung. Jika temperatur tinggi akan mempercepat proses bermigrasinya protein dan sebaliknya jika temperatur rendah akan mengurangi kekuatan bermigrasinya protein. Pada saat elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu pada gel poliakrilamid tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh pula protein bergerak atau mobilitasnya tinggi. Sebaliknya protein dengan berat molekul lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek atau mobilitasnya rendah
(Sumitro et al., 1996).
Hasil elektroforesis akan didapatkan pita-pita protein yang terpisahkan berdasarkan berat molekulnya. Tebal tipisnya pita yang terbentuk dari pita protein menunjukkan kandungan atau banyaknya protein yang mempunyai berat molekul yang sama yang berada pada posisi pita yang sama. Hal ini sejalan dengan prinsip pergerakan molekul bermuatan, yakni molekul bermuatan dapat bergerak bebas di bawah pengaruh medan listrik, molekul dengan muatan dan ukuran yang sama akan terakumulasi pada zona atau pita yang sama atau berdekatan (Soedarmadji, 1996).
3. MATERI DAN METODE 3.1 Alat yang digunakan
Alat yang digunakan dalam metode elektroforesis adalah tabung eppendorf, mikropipet, mortar, tabung erlenmeyer, gelas ukur, penangas air (dengan suhu 800C), magnetic stirer, magnetic bar, sentrifuga, pinset, timbangan, pompa vacum, citakan gel 20x16x1 cm3, timer, meja pendingin, pembungkus plastik, freezer, kawat halus, inkubator, power supply, pisau, penggaris, spidol, kantong plastik tebal, nampan plastik, spon.
3.2 Bahan
No Bahan 1slap (μL) 2slap (μL) 1slap (μL) 1slap (μL) 1. Acrylamide 30% 2063 4126 1650 2470 2. Tris HCl 1.5 M pH 8.8 1250 2500 1250 1250 3. Sterile aquades 1635 3270 2050 1230 4. SDS 10% 50 100 50 50 5. APS 10% 50 100 12.5 12.5 6. Temed 10 20 10 10 Stacking Gel 3% 12.5% 10% 15%
No Materials 1 slap (μL) 2slap (μL) 1slap (μL) 1slap (μL)
1. Acrylamide 30% 257.5 515 412 620 2. Tris HCl 1 M pH 6.8 312.5 625 625 625 3. Sterile aquades 662.5 1325 1425 1220 4. SDS 10% 12.5 25 25 25 5. APS 10% 3.75 7.5 7.5 7.5 6. Temed 2.5 5 5 5 3.3. Metode 1. Pembuatan gel
Cara pembuatan gel adalah dengan melarutkan gel bubuk yang khusus digunakan untuk elektroforesis pada erlenmeyer,pada kesempatan ini yakni gel poliakrilamida (PAGE = polyacrilamida gel electrophoresis) kemudian di cetak pada cetakan khusus yang telah disediakan dan ditunggu hingga kering. Dalam pembuatan agar, proporsi campuran antara agar dan pelarutnya harus sesuai, karena kalau tidak maka substratnya tidak akan dapat berjalan 2. Penempatan sampel
Gel dilepaskan dari cetakan gel dengan cara mengiris keliling tepi gel dengan
menggunakan pisau. Bagian ujung gel diiris atau dibuat sumuran dengan cetakan khusus kira 2 cm dari salah satu tepi yaitu dari arah katoda yang sebagai penyimpan ekstrak
enzim. Sampel yang akan diuji dikeluarkan dari freezer dan dibiarkan sebentar hingga
mencair. Isi pada gel yakni 1) marker 2) H. pillory pilli, 3) Shigella dysentery pilli, 4) Shigella dysentery OMP, 5) S. typhi pilli (potongan 1), 6) S. typhi (potongan 2), 7) S. typhi OMP, dan 8) protein enterosit. Sebagai indikator adanya pergerakan maka celah irisan gel tersebut diberikan sedikit biru brom fenol.
3. Proses Elektroforesis
Gel yang telah siap kemudian diletakkan secara horizontal diatas kotak elektroforis yang telah berisi larutan penyangga elektroda. Proses ini dilakukan di dalam lemari pendingin dengan suhu 40C. Kedua sisi gel diberi spons yang telah dibasahi dengan larutan penyangga elektroda sebagai jembatan anatar larutan penyangga elektroda dengan gel. Setelah itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut diberi gel yang dingin. Proses elekrofororsis dijalankan dengan memberi daya listrik pada gel. Pemberian daya listrik disesuaikan dengan sampel yang akan digunakan, misalnya sebesar 120 V selama kurang lebih 3 jam. Setelah terlihat bahwa biru brom fenol mencapai titik yang berjarak ± 3 cm dari ujung gel, maka proses elekrofororsis dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai dipotong, sedangkan potongan gel yang menjadi tempat migrasi enzim diiris tipis secara horizontal dengan menggunakan gergaji yang berkawat tipis. Gel diiris menjadi beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar gel yang diletakkan dalam wadah plastik, untuk selanjutnya diwarnai dengan pewarnaan commasie brilliant blue
4. Metode Analisis
Dalam hal ini cara menganalisa hasil pita dari elektroforosis tersebut sangat tergantung dari topik apa yang akan diteliti. Hasil visualisasi enzim berupa binti atau noda yang disebut pola pita (bandmorp). Macam pola pita dibedakan atas tipe pola pita yang terbentuk. Semua tipe pola pita yang terbentuk diinterpretasikan sebagai lokus isozim dan alel yang kemudian dijadikan dasar dalam pengukuran parameter yanga ada dalam suatu populasi.
Gambar 1. Contoh Hasil Pita Protein yang Terbentuk
Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. Nomor 1. Balitbang Biologi Laut, Puslitbang Osenologi LIPI, Jakarta
Sudarmadji, S., 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Edisi Pertama.Liberty. Yogyakarta.
Sumitro, S. B, Fatchiyah, Rahayu, Widyarti, dan Arumningtyas. 1996. Kursus Teknik-Teknik Dasar Analisis Protein dan DNA. Jurusan Biologi FMIPA Universitas Brawijaya. Malang
Zubay, G. L. 1989. Biochemistry 2nd Edition. Mcmillan Publishing Coorporation. New York
Elektroforesis protein dan Gel
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = poly-acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.
Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul
berdasarkan muatannya.
Didalam elektroforesis tak-penyahaslian (nondenaturing) atau elektroforesis natif, protein dipisahkan dalam bentuk aslinya berdasarkan cas, saiz, dan bentuk molekul tersebut. Satu lagi bentuk elektroforesis yang selalu digunakan bagi pemisahan protein ialah elektroforesis penyahaslian. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE) dengan suatu detergen anion, sodium dodesil sulfat (SDS) digunakan untuk memisahkan subunit protein mengikut saiz. Protein dilarutkan didalam suatu larutan penimbal yang mengandungi SDS dan agen penurun,
merkaptoetanol atau ditiotreitol, untuk menceraikan protein menjadi subunit dan menurunkan ikatan disulfat (Rajah 1). Protein bergabung dengan SDS lalu bercas negartif, dan dipisahkan hanya berdasarkan saiz.
Tatakerja:
Sebuah pembekal kuasa dan radas elektroforesis mengandungi matrik gel poliakrilamid dan dua takungan (reservoir) larutan penimbal adalah diperlukan ubtuk menjalankan satu pemisahan. Contoh gel keping dan unit elektroforesis ditunjukkan didalam Rajah 2. Sumber kuasa digunakan untuk menwujudkan medan elektrik dengan menyediakan suatu sumber arus, voltan atau kuasa yang konstan. Penimbal elektrod mengawal pH bagi mengekalkan cas yang sesuai pada protein dan menkonduksikan arus melalui gel poliakrilamid. Sistem penimbal yang biasa digunakan termasuklah penimbal anionik tris-(hidroksimetil)amino metan dengan gel pelerai (desolving gel) pada pH 8.8 dan penimbal asetat yang kationik pada pH 4.3.
Matrik gel poliakrilamid terbentuk melalui pempolimeran akrilamid dengan sedikit (selalunya 5% atau kurang) reagen pempaut silang (cross-linking) N.N‟-metilen-bisakrilamid dengan kehadiran satu mangkin, tetrametiletilendiamin (TEMED) dan sumber radikal bebas, amonium persulfat seperti ditunjukkan didalam Rajah 3. Gel boleh disediakan didalam makmal atau dibeli siap diacu (pre-cast).
(resolution) protein didalam campuran yang kompleks. Matrik tak selanjar terdiri dari satu gel penimbun (stacking gel) dengan saiz liang yang besar (selalunya 3-4% akrilamid) dan satu gel pelerai (resolving gel) yang mempunyai saiz liang yang kecil. Gel penimbun, seperti yang dimaksudkan dengan namanya, digunakan untuk menimbunkan atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein itu memasukki gel pelerai (Rajah 4).
Pada pH 6.8, satu kecerunan voltan terbentuk diantara ion klorid (cas negatif tinggi) dan glisin (cas negatif rendah) didalam penimbal elektrod yang bertujuan menimbunkan protein menjadi jalur-jalur sempit diantara ion-ion. Migrasi kedalam gel pelarian (running gel) yang mempunyai pH berlainan (pH 8.9) mengganggu kecerunan voltan ini lalu membenarkan pemisahan protein menjadi jalur-jalur yang diskrit.
Saiz liang gel pelarian dipilih berdasarkan berat molekul protein yang hendak dipisahkan dan boleh diubah dengan cara menukar kepekatan akrilamid didalam larutan. Protein selalunya boleh dipisahkan pada gel pelarian yang mengandungi 4 ke 15 peratus akrilamid. Kepekatan akrilamid 15 peratus selalunya digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai berat molekul dibawah 50,000. Protein yang mempunyai berat molekul lebih besar dari 50,000 lazimnya dipisahkan pada gel yang kepekatan akrilamidnya dibawah 7 peratus. Satu gel kecerunan
(gradient gel) dimana kepekatan akrilamis meningkat dari atas kebawah gel selalunya digunakan untuk memisahkan satu campuran protein yang mempunyai banjaran berat molekul yang luas.
Bagi menjalankan sesuatu pemisahan, protein didalam penimbal yang sesuai pHnya dimuatkan disebelah atas gel penimbun. Pewarna penjejak (tracking dye) bromofenol biru ditambahkan kedalam larutan protein. Pewarna ini molekul kecil yang migrasi terdahulu daripada dan digunakan untuk memonitor kemajuan sesuatu pemisahan. Selepas sesuatu larian (run) elektroforesis, jalur-jalur yang terdapat pada gel umumnya divisualkan dengan menggunakan pewarna (stain) protein seperti Coomassie Brilliant Blue atau pewarna timah (silver stain). Pewarna enzim spesifik atau antibodi boleh juga digunakan untuk mengesan sesuatu protein.
Kegunaan:
Elektroforesis selalunya digunakan untuk menentukan komposisi protein sesuatu produk makanan. Sebagai contohnya, perbezaan yang terdapat didalam komposisi protein dari protein pekatan kacang soya dan pekatan protein weiyang dihasilkan melalui teknik pemisahan yang berlainan boleh dikesan. Elektroforesis boleh juga digunakan untuk menentukan ketulenan
sesuatu ekstrak protein.
SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk menganggar berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bercas tinggi atau glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan dengan membandingkan Rm subunit protein dengan Rm protein piawai yang diketahui berat molekulnya (Rajah 5). Piawai protein yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam beberapa banjaran berat molekul. Untuk menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat molekul protein piawai diplotkan melawan padanan Rm nya. Maka berat molekul protein tak diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan lengkok piawai.
2. Pemfokusan Isoelektrik (Isoelectric Focusing)
Prinsip:
Pemfokusan isoelektrik adalah merupakan satu modifikasi elektroforesis. Dalam kes ini, protein dipisahkan oleh cas didalam suatu medan elektrik pada matrik gel yang telah diwujudkan kecerunan pH menggunakan amfolit (ampholytes). Protein difokuskan atau migrasi ke lokasi didalam kecerunan dimana pH sama dengan pI protein tersebut (Rajah 6). Peleraian yang diperolehi adalah diantara yang paling tertinggi untuk sebarang teknik pemisahan protein dan boleh digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai pI berbeza kurang dari 0.02 unit pH.
Tatakerja:
Satu kecerunan pH diwujudkan menggunakan amfolit, iaitu polimer kecil (berat molekul kira-kira 5000 dalton) yang mengandungi kedua-dua kumpulan bercas positif dan negatif. Suatu campuran amfolit terdiri dari beribu-ribu polimer yang mempamirkan satubanjaran nilai pK. Amfolit ditambahkan kedalam larutan gel sebelum pempolimeran dijalankan. Selepas gel terbentuk dan arus dialirkan, amfolit ini bermigrasi lalu membentuk kecerunan pH; amfolit yang bercas negatif akan migrasi kearah anod, manakala yang bercas positif kearah katod. Campuran amfolit boleh diperolehi yang merangkumi banjaran pH yang sempit (2-3 unit) atau satu banjaran yang lebar (pH 3-10) dan perlulah dipilih untuk digunakan berdasarkan ciri-ciri protein yang hendak dipisahkan.
Pemfokusan isoelektrik merupakan kaedah pilihan untuk menentukan titik isoelektrik sesuatu protein dan sZt. Pemfokusan isoelektrik juga digunakan untuk membedakan spesis ikan yang berhubungan rapat dengan berdasarkan corak proteinnya.
ELEKTROFORESIS GEL
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya
merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif,
disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna “biru Coomassie”
(Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah “diwarnai” dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Sodium Dodecyl Sulphate– Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) Pendahuluan
SDS-PAGE merupakan suatu teknik elektroforesis yang menggunakan polyacrylamide sebagai bahan pemisah. SDS-PAGE banyak digunakan dalam praktikum biologi molekuler, genetik, biokimia, dan biomedik. SDS-PAGE biasanya digunakan untuk memisahkan protein berdasarkan sifat electrophoretic mobility (pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan
perbedaan tingkat migrasi dan berat molekulnya (BM) dalam sebuah medan listrik). Protein yang dipisahkan dengan SDS-PAGE dapat dikarakterisasi berdasarkan berat molekulnya dengan satuan Kilo Dalton (kDa). Satu dalton sama dengan satu hidrogen molekul.
SDS-PAGE merupakan teknik purifikasi skala kecil yang menghasilkan pemisahan suatu protein berdasarkan berat molekulnya dalam band (pita) spesifik yang tampak pada gel polyacrylamide. Teknik purifikasi dalam skala besar kita dapatkan degnan menggunakan chromatography. Gel acrylamide alam SDS-PAGE diletakkan diantara dua plat kaca. Ada dua macam gel yang digunakan, yaitu main atai separating gel dan stacking gel. Main gel merupakan gel yang komposisinya paling banyak dan terletak dibagian bawah alat. Main gel berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan berat molekulnya. Stacking gel terletak pada bagian atas, digunakan untuk mencetak sumuran (sekat pemisah untuk penempatan sempel). Protein tertarik ke bagian bawah oleh arus listrik. Protein yang memiliki berat molekul paling kecil bergerak cepat sehingga tertarik sampai bagian bawah gel, sedangkan protein yang memiliki berat molekul paling besar akan berada pada bagian atas dari gel. Protein marker digunakan sebagai standart untuk menentukan berat molekul dari sampel.
i. Memahami konsep teknik elektroforesis khususnya SDS-PAGE dan memiliki kompetensi melakukannya
ii. Mengidentifikasi suatu protein berdasarkan berat molekulnya Metode
i. Alat dan Bahan
Bahan pembuatan gel
Running/Main Gel 12.5% 10% 15%
No Materials 1 slap (μL) 2 slap (μL) 1 slap (μL) 1 slap (μL)
1. Acrylamide 30% 2063 4126 1650 2470 2. TrisHCl 1.5 M pH 8.8 1250 2500 1250 1250 3. Sterile aquades 1635 3270 2050 1230 4. SDS 10% 50 100 50 50 5. APS 10% 50 100 12.5 12.5 6. Temed 10 20 10 10 Stacking Gel 3% 12.5% 10% 15%
No Materials 1 slap (μL) 2 slap (μL) 1 slap (μL) 1 slap (μL)
1. Acrylamide 30% 257.5 515 412 620 2. TrisHCl 1 M pH 6.8 312.5 625 625 625 3. Sterile aquades 662.5 1325 1425 1220 4. SDS 10% 12.5 25 25 25 5. APS 10% 3.75 7.5 7.5 7.5 6. Temed 2.5 5 5 5
Arus listrik 120 Volt Micropippet
Cutter ii. Procedures
20 μL sampel ditambah 20 μL Reducing Sample Buffer (RSB) dimasukkan dalam eppendorf
Panaskan selama 5 menit pada air mendidih
Tuangkan gel yang telah dibuat. Pertama main gel dituangkan sampai garis batas atas main gel. Tuangkan stacking gel di atas maingel. Buat cetakan sumuran pada stacking gel.
Masukan sampel pada sumuran elektroforesis. Pada praktikum kali ini kita menuangkan pada sumuran: sumu 1 standart marker, sumur 2 H. pillory pilli, sumur 3 Shigella
dysentery pilli, sumur 4 Shigella dysentery OMP, sumur 5 S. typhipilli (cut 1), sumur 6 S. typhi (cut 2), sumur 7 S. typhiOMP, dan sumur 8 enterocyte protein.
Angkat gel, lakukan staining dengan Commasie brilliant blue R 250 di atas shaker selama 20-30 menit
Pindahkan gel pada larutan destaining selama 1-2 jam di atas shaker Lakukan destaining semalam di atas shaker sampai gel kelihatan bersih
Hitung berat molekul protein pada band (pita) protein yang tampak pada gel berdasarkan persamaan regresi linier yang mengacu pada berat molekul standart dari pita standart marker
Result
i. Gel SDS-PAGE
SDS-PAGE gel ii. Analisis Regresi-Linier
Protein marker (well 1)
Band MW Marker Tracking distance Log MW RF
2 135 6.5 2.130333768 0.095588 3 95 8 1.977723605 0.117647 4 72 10.5 1.857332496 0.154412 5 52 17 1.716003344 0.25 6 42 21.5 1.62324929 0.316176 7 34 26 1.531478917 0.382353 8 26 31.5 1.414973348 0.463235
Persamaan regresi linier H. pillory pilli (sumur 2)
Band MW Marker Tracking distance Log MW RF
1 164.9293237 4 2.217297878 0.058824
2 99.78376762 10.5 1.999059898 0.154412
4 67.79294938 15.5 1.831184529 0.227941
5 51.72157842 19 1.71367177 0.279412
6 22.09764323 30 1.344345958 0.441176
Discussion
SDS-PAGE merupakan salah satu teknik elektroforesis yang banyak digunakan saat ini untuk memisahkan suatu protein berdasarkan berat molekul dan muatan yang dimilikinya karena pelaksanaannya mudah dan relatif tidak mahal. SDS-PAGE
menggunakan polyacrylamide gel.Polyacrylamide dibentuk dari polimerisasi dari dua
compound, acrylamide dan bis. Bis merupakan cros-linking agent untuk gel. Polimerisasi diawali dengan penambahan ammonium persulfat dengan TEMED. Gel bermuatan netral, hydrofilik, tridimensional network dari hidrokarbon yang dicros-link dengan methylen.
Pergerakan dari protein di dalam gel mengikuti persamaan Rf = 1 / BM (berat molekul) dimana Rf adalah mobility. Oleh karena itu kecepatan migrasi / mobility dari protein berbanding terbalik dengan berat molekulnya. Semakin berat maka akan semakin lambat pergerakannya atau dengan kata lain berada pada posisi atas dari gel. Selain itu pergerakan protein juga mengikuti
persamaan Rf = (Z x V) / f. Z merupakan muatan yang ada pada protein, V adalah kuat arus listrik, dan f adalah fraction pada gel. Fraction pada gel bergantung pada besarnya pori-pori di dalam gel. Makin kecil pori-pori maka fractionnya makin besar.
Pori-pori di dalam gel bergantung pada konsentrasi acrylamide dan cros-linker. Semakain tinggi konsentrasi acrylamide maka diameter pori-pori akan semakin kecil. Apabila protein berukuran besar atau memiliki berat molekul yang besar, maka memerlukan gel dengan konsentrasi acrylamide yang kecil. Konsentrasi acrylamide dalam gel 5% biasanya digunakan untuk protein dengan berat molekul 60 kDa – 200 kDa, konsentrasi 10% untuk 16 kDa – 70 kDa, dan
konsentrasi 15% untuk 12 kDa – 45 kDa.
Intrepetasi dari SDS-PAGE dapat dibaca dengan membuat persamaan regresi linier dari pita marker sebagai standart acuan. Didapatkan R2 = 0,917, semakin mendekati 1 maka persamaan regresi linier yang didapatkan semakin bagus. Semakin mendekati 1 menunjukkan bahwa persamaan tersebut makin menunjukkan kepastian dari berat molekulnya.
Setelah mendapatkan persamaan regresi linier dari marker, kita dapat menghitung berat molekul dari sampel dengan cara memasukkan pada persamaan tersebut. Persamaan regresi linier dari marker : y=0,438x + 1,030. Y menunjukkan panjang jarak dari bagian atas gel samapai pita protein yang akan diukur. Sedangkan x menunjukkan berat molekul.
Pada praktikum kali ini kami hanya mengintrepetasi berat molekul dari protein pada sumur 2 (H. pillorypili) saja karena keterbatasan waktu. Pita-pita protein dari H. pillory pili dengan berat molekul 82,2 kDa dan 67,7 kDa terlihat paling tebal, hal ini menunjukan bahwa protein dengan berat molekul tersebut terdapat dengan konsentrasi sangat banyak pada H. pillory pili.
Apabila kita memperhatikan dengan lebih teliti posisi pita-pita dari sampel dan pita-pita dari marker pada gel, kita akan melihat bahwa posisi berat molekul yang ada pada pita sampel relatif tidak sesuai dengan perkiraan posisi berat molekul pada marker, dan beberapa pita sampel
terlihat membentuk cekungan (seperti huruf U). Hal ini dapat disebabkan karena persamaan linier yang didapatkan kurang mendekati 1 (R2 = 0,917), kemungkinan hal ini terjadi karena kesalahan peneliti dalam memasukkan sampel sehingga menyebabkan pencampuran dari sampel dengan marker, atau karena kuat arus listrik di laboratorium yang tidak stabil, menyebabkan penarikan dari muatan molekul tidak stabil.
BER LITERATUR ELEKTROFORESIS
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan
perbedaan tingkatmigrasinya dalam sebuah medan listrik .[1] Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. [2] Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada padamakromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. [2] Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. [2] Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.[2] Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik.
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA. [3]
JENIS ELEKTROFORESIS
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase diam
dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ion kompleks. [4]Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. [4]Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut. [5]
Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam untuk
memisahkan molekul-molekul. [6] Awalnya elektoforesis gel dilakukan dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar seperti protein-protein. [6] Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikan agarosa danpoliakrilamida sebagai gel media.[6]
REFERENSI
1. ^ (en) Westermeier. 2004. Electrophoresis in Practice: A Guide to Theory and
Practice. New Jersey: John Wiley & Sons inc.
2. ^ abcd Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta: Erlangga. 3. ^ Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. Malang: Brawijaya Press
4. ^ ab Sulaiman, Hardi A & Kundari NA. 2007. Pemisahan dan karakterisasi spesi senyawa kompleks ytrium-90 dan sstronsium-90 dengan elektroforesis kertas. JFN, Vol.1
No.2
5. ^ Khopkar SM. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI-Press.
6. ^ abc Yepyhardi. 2009. Elektroforesis; Pintu Gerbang Penelitian Biologi
Molekular. Sciencebiotech.net[web]. http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular
http://id.wikipedia.org/wiki/Elektroforesis
Elektroforesis
Posted by admin on Friday, June 19, 2009 · 2 Comments
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen/molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik (Westermeier, 2004). Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatannya. Dalam hal ini protein diberi muatan negatif. Sampel protein dimasukkan ke dalam slot atau sumuran pada ujung agar. Karena sampel ini memiliki berat, mereka akan turun ke dasar sumuran.
Elektroforesis Protein
Seperti halnya dengan elektroforesis DNA, elektroforesis protein memungkinkan kita untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya dan memperlihatkan hasilnya. Akan tetapi protein jauh lebih beragam dalam ukuran dan strukturnya, karena itu tekniknya jauh lebih rumit.
Pada dasarnya alat elektroforesis terdiri atas 2 bagian utama yaitu bagian electric
transformeryang mengubah arus AC ke DC dan bagian tanki elektroforesis yang berisi flat bed,
slab, column, dan selang.
Beberapa faktor yang mempengaruhi pemisahan komponen pada elektroforesis protein : 1. Densitas muatan molekul - berbeda diantara pH media dan pl molekul.
2. Pengaruh buffer
- pH - akan mempengaruhi densitas muatan protein dan akibatnya mempengaruhi tingkat dan arah pergerakannya
- Kekuatan ionik - mempengaruhi tingkat pemisahan
- Komposisi - bisa berinteraksi dengan protein menyebabkan perubahan dalam densitas muatan sebagai contoh ion borak dan glikoprotein.
3. Bentuk dan ukuran molekul 4. media pendukung
- Restriksi pada mobilitas - Pengaruh difusi
- Elektroendosmosis
- Mikro-heterogenitas molekuler spesies
Polyacrilamide Gel Elektroforesis (PAGE)
Sistem yang digunakan dalam PAGE - Flat Bed
- Rod atau Column - Vertical Slab - Capillary
Faktor yang mempengaruhi resolusi 1. Konsentrasi Gel Poliakrilamid
- Konsentrasi monomer - proporsional terhadap porositas gel akhir
- Persentase Cross-linker pada Monomer - mempunyai pengaruh pada porositas gel akhir - kimia alam untuk Cross-linker - dapat mempengaruhi porositas dan penangan selanjutnya pada gel akhir
- Kemurnian monomer - sering terkontaminasi dengan asam akrilat yang menyebakan efek elektroendosmosis pada gel final.
2. Buffer - pH
- Penggunaan sistem buffer kontnyu atau diskontinyu - Komposisi buffer
- Inklusi agen disosiasi : Urea, detergen non ionic, Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)
Buffer sistem
Buffer ini dapat digunakan dengan atau tanpa SDS meskipun inklusi SDS sering umum digunakan belakangan ini. Laemmli Buffer - Tris, Glycine HCl buffer - adalah buffer yang
banyak digunakan secara luas terutama dengan SDS. Resolusinya sangat jelek dengan ukuran MW dibawah 10KDa.
Schaegger & Von Jagow Buffer system - Tricine, Tris , HCl buffer - dengan komposisi gel yang benar sistem buffer ini dapat menguraikan peptida hingga 1 KDa dan umumnya memberikan memberikan reolusi yang lebih baik hingga 100 KDa.
Penggunaan agen disosiasi
1. Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) - Resolusi pemisahan tinggi - Estimasi berat molekuler
2. Urea atau Detergen Non Ionik (Tween 20)
Membantu melarutkan material yang tidak larut dalam media cair seperti protein membran sel
Struktur Protein
Di dalam sel, protein berada dalam bentuk 3 dimensional. Struktur primer protein merupakan sekuen sederhana dari asam amino. Asam amino ini dapat membentuk struktur umum seperti alpha heliks, akibat ikatan hidrogen. Struktur protein juga dapat lebih lanjut terpengaruhi oleh interaksi elektrostatik dan hidrofobik, sekaligus juga gaya yang lebih kuat seperti ikatan kovalen disulfide, ini dikenal dengan sebutan struktur tersier protein.
Teknik elektroforesis
Untuk mempelajari protein, kita perlu mengurutkan dan memvisualisasikannya. Salah satu cara paling umum untuk melakukannya dikenal dengan SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate
polyacrylamide gel electrophoresis).
Semua teknik elektroforesis membutuhkan arus listrik untuk menggerakkan molekul bermuatan melalui matriks atau gel. Pada laboratorium sederhana kita bisa menggunakan gel agarose utnuk memisahkan fragmen DNA. Dalam kasus ini, kita memerlukan matriks yang terang/bening untuk memisahkan molekul. Matriks yang bening ini terbuat dari polimer akrilamid. Sehingga PAGE diartikan sebagai proses pemisahan protein dalam sebuah gel akrilamid melalui aplikasi arus listrik. Seperti halnya pada elektroforesis DNA, molekul yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat dan karena itu akan lebih jauh pada gel.
Tidak seperti DNA, protein yang diisolasi ini tidak akan memiliki muatan negatif yang sama. Karena itu perlu untuk melindungi semua protein dengan sesuatu untuk memberikan muatan negatif, yang memungkinkan mereka bergerak menuju ujung positif arus listrik.
Untuk memisahkan protein secara akurat berdasarkan ukurannya, akan sangat penting jika kita mendenaturasi protein sebelum mengisikannya dalam gel. Untuk melakukan hal ini, kita akan menggunakan loading buffer dengan 2 bahan penting, SDS dan DTT (ditiotreitol). DTT adalah agen pereduksi yang kuat yang memutus ikatan disulfida. Selain itu untuk mempergunakan 2 agen kimia untuk mendenaturasi protein, kita juga harus memanaskan beberapa sampel hingga 95oC untuk membantu mendenaturasi protein secara sempurna, menghasilkan molekul linier yang akan bermigrasi berdasarkan bobot molekulnya.
Saat ini, teknik pemisahan dan pemurnian DNA/RNA merupakan teknik yang tidak dapat dipisahkan dari biologi molekular. Hampir semua penelitian DNA/RNA mesti melibatkan pemisahan dan pemurnian yang tekniknya cukup beragam. Elektroforesis adalah salah satu teknik pemisahan paling populer, maka tak heran jika elektroforesis disebut sebagai pintu gerbang dari berbagai penelitian biologi molekular. Nah, sekarang ada baiknya kita telusuri dulu teknik-teknik tersebut dari masa ke masa.
Oh ya, pada prinsipnya elektroforesis itu adalah teknik pemisahan campuran molekul yang didasarkan pada perbedaan muatan listriknya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada suatu fasa diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda.
Elektroforesis dengan Kertas Saring
Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis. Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang kemudian menghasilkan nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat. Bagaimana keduanya bisa mengungkap rahasia ini?
Paper Electrophoresis. Image from www.funsci.com Paper Electrophoresis. Image from www.funsci.com
Ternyata mereka menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis tadi, salah satunya yaitu nukleotida „siklik‟ yang membawa pada kesimpulan bahwa hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu mereka namakan „elektroforesis„, yang dibuat dari kertas saring Whatmannomor 3, sebuah tangki kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis. Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida
2′-monoposfat dan nukleosida 3′-2′-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan
komponen tersebut terpisah-pisah, mereka dapat mengisolasi dan mengidentifikasi setiap komponen tersebut.
Elektroforesis Gel Kanji
Starch Gel Electrophoresis. Image from http://www.terrapub.co.jp Starch Gel Electrophoresis. Image from http://www.terrapub.co.jp
Selanjutnya teknik elektroforesis dikembangkan untuk memisahkan biomolekul yang lebih besar. Tahun 1955 Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang terbuat dari larutan kanji dapat digunakan untuk memisahkan protein-protein serum manusia. Caranya yaitu dengan menuangkan larutan kanji panas ke dalam cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin kanji tersebut akan membentuk gel yang padat namun rapuh. Gel kanji berperan sebagai fasa diam (stationary phase) menggantikan kertas saring Whatman pada teknik terdahulu.
Ternyata elektroforesis gel yang diperkenalkan Smithies memicu para ilmuwan untuk menemukan bahan kimia lain yang dapat digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik, seperti agarosa dan polimer akrilamida. Dan penemuan elektroforesis gel kanji di awal karir Smithies membawanya menerima hadiah nobel bidang kedokteran tahun 2007.
Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE)
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Image from www.siumed.edu
Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE). Image from www.siumed.edu
Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar.
Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.
Pulse-Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Skema Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) Skema Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE)
Pertengahan 1980-an, Schwartz dan Cantor membeberkan ide cerdasnya untuk memisahkan campuran DNA berukuran super besar menggunakan teknik yang dinamakanPulse-field
Gradient Gel Electrophoresis (PFGE), yang menggunakan pulsa-pulsa pendek medan listrik
tegak lurus yang arahnya berganti-ganti. Teknik PFGE kini digunakan secara luas oleh para ahli biologi dalam studi genotyping berskala masif, juga analisa epidemiologi molekular pada patogen.
Keempat teknik di atas merupakan pintu masuk bagi penelitian-penelitian lainnya dalam bidang biologi molekular yang kini berkembang sangat pesat. Sulit dibayangkan sebuah laboratorium biologi molekular dapat menghasilkan sesuatu tanpa teknik elektroforesis. Tanpa elektroforesis, DNA/RNA yang sedang kita teliti akan bercampur dengan kontaminan yang tidak kita inginkan, sulit pula membayangkan cara mengetahui ukuran DNA/RNA/protein yang lebih praktis selain dengan elektroforesis, bahkan teknik DNA sequencing modern sekalipun sangat bergantung pada teknik elektroforesis ini. Terima kasih kepada Markham dan Smithyang telah mencoba meneteskan RNA hidrolisat pada selembar kertas saring dan memisahkannya dengan arus listrik.
Sumber:
Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group.
http://dukeresearch.blogspot.com/2009/04/flipping-through-chronicles-of-nobel.html http://sciencebiotech.net/elektroforesis-pintu-gerbang-penelitian-biologi-molekular/
Elektroforesis
Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug & Cummings 1994: A-6). Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Hasil elektroforesis yang terlihat
adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya (Klug & Cummings 1994: 397).
Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut (Brown 1992: 19).
Di dalam elektroforesis digunakan sumber arus listrik searah (DC), ruang untuk elektroforesis (Comb, Well, platform dan cetakan wadah gel), larutan buffer (buffer ionik dan loading buffer), matriks elektroforesis, marker dan gel (Klug & Cummings 1994: A-6).
Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan (Klug & Cummings 1994: A-6). Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu (Klug & Cummings 1994: A-7).
PCR
Polymerase chain reaction (PCR) adalah suatu proses pembentukan cetakan DNA secara berulang kali dengan menggunakan prosedur dan waktu yang tertentu (Wolfe 1993: 137). PCR menggunakan teknik amplifikasi (perbanyakan) secara spesifik pada suatu segmen DNA secara in vitro dengan menggunakan DNA polimerase, cetakan (template), DNA genom, dan primer oligonukleotida yang akan menempel pada segmen yang akan diamplifikasi (Davis et al. 1994: 114). Prinsip dasar dari teknik PCR tersebut merupakan adanya enzim DNA polimerase yang digunakan untuk membuat cetakan dari segmen DNA yang diinginkan (Wolfe 1993: 137).
Proses PCR terdiri dari 3 tahapan, yaitu: 1. Denaturasi
adalah proses penguraian materi genetik (DNA/RNA) dari bentuk heliksnya yang dipisahkan dengan suhu 90-96oC.
2. Annealing (pelekatan) atau hibridisasi
adalah suatu proses penempelan primer ke DNA template yang sekarang hanya dalam satu untai. 3. Polimerisasi (sintesis)
adalah suatu proses pemanjangan rantai DNA baru yang dimulai dari primer. Aplikasi dari PCR yaitu:
1. Mendeteksi penyakit yang dapat menginfeksi, variasi dan mutasi dari gen (Powledge 2001: ?). 2. Untuk mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk mengetahui dari mana spesies tersebut berasal (Powledge 2001: ?).
3. DNA atau RNA yahg telah dianalisis dengan menggunakan teknik PCR digunakan untuk meneliti penerapannya dalam bidang klinik dan obat-obatan forensik, mengembangkan teknik-teknik dalam bidang genetika dan untuk mendiagnosa (Davis et al. 1994: 114).
4. Untuk membuat cDNA library, yaitu sebuah set dari hasil kloning yang mewakili sebanyak mungkin mRNA dari suatu tipe sel tertentu dengan waktu tertentu. Pembuatan cDNA library tersebut menggunakan teknik Transverse Replication PCR (Weaver 1999: 80).
Klug, W. S. & M. R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. 4th ed. Prentice Hall, Englewood cliffs: xvi + 779 hlm.
Brown, T. A. 1992. Genetics: A molecular approach. 2nd ed. Chapman & Hall, London: xxii + 467 hlm.
Wolfe, S.L. 1993. Molecular and cellular biology. Wadsworth Publishing Company, Belmont: xviii + 1145 hlm.
Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994. Basic methods: Molecular biology. 2nd ed. Appleton & Lange, Norwola: xii + 777 hlm.
Powledge, T.M. 2001. The polymerase chain reaction. 7 September: ? hlm.http://www.faseb.org/opa/bloodsupply/pcr.html, 30 November 2005, pk. 17. 43.
