ELEKTROFORESIS DNA
1.l Elektroforesis
Elektroforesis adalah migrasi ion-ion di bawah pengaruh medan listrik. Senyawa- senyawa yang bermuatan listrik akan bergerak ke arah elektroda yang mempunyaimuatan yang berlawanan.DNA mempunyai muatan negatif dan mempunyai rasiomuatan/massa yang konstan, sehingga kecepatan migrasi DNA selama elektroforesistergantung pada berat molekul DNA tersebut.Grafik log berat molekul DNAterhadap jarak migrasi untuk kisaran berat molekul tertentu akan menghasilkan garis lurus. Untuk pemisahan DNA berukuran kecil (< 200 pasang basa) digunakan gelpoliakrilamida sedangkan untuk pemisahan DNA berukuran besar digunakan gelagarosa. DNA dalam gel agarosa dapat terlihat dengan penambahan red gel yang akan berikatan dengan DNA dan akan bersifat fluorescens dibawah sinar UV. Penambahan loading dye dilakukan bertujuan sebagai penanda pergerakan DNA dalam gel agarose.
Log BM
mm Jarak migrasi
Gambar 1.1 Hubungan antara berat molekul DNA dengan jarak migrasi padaelektroforesis
Kisaran berat molekul DNA yang akan menghasilkan garis yang linear pada grafik logBM terhadap jarak migrasi DNA ditentukan oleh konsentrasi gel yang digunakan.
Untukelektroforesis gel agarosa, ukuran DNA yang dapat dipisahkan berkisar antara5 - 60 kilobasa untuk gel dengan konsentrasi agarosa 0,3 % dan 0,l - 3,0 kilobasauntuk gel dengan konsentrasi agarosa 2,0 %. DNA yang berukuran satu kilobasaadalah DNA yang panjangnya seribu pasang basa / nukleotida.
Perlengkapan alat elektroforesis terdiri dari:
1. Cetakan gel yang digunakan untuk membuat gel agarosa
2. Alat pencetak sumur yang digunakan untuk membuat sumur-sumur pada sisi atasdari gel agarosa, yaitu tempatmemasukkan DNA ke dalam gel.
3. Tangki elektroforesis 4. Sumber arus.
1.2 Alat dan Bahan 1. Tabung Eppendorf 2. Mikropipet dan tips 3. Alat pemanas
4. Perlengkapan alat elektroforesis
5. Sumber arus 6. Agarose 7. TAE 1X 8. Loading dye 9. Red Gel 1.3 Metode
1. Letakkan pencetak sumur pada cetakan gel.
2. Pembuatan Gel:
- Untuk DNA yang belum di PCR : agarose 2% sebanyak 2 gram + Pelarut TAE 98mL - Untuk DNA yang sudah di PCR: agarose 2% sebanyak 1,5 gram + Pelarut TAE 98,5 mL 3. Tuangkan ke dalam cetakan gel.
4. Diamkan sampai gel mengeras.
5. Letakkan cetakan gel pada alat elektroforesis, tuang bufer TAE 1 hingga mencapai tinggi 1 mm diatas gel.
6. Lepaskan pencetak sumur. Jangan melepaskan pencetak sumur sebelum gel berada dalam bufer karena konsentrasi agarosa yang digunakan sangat rendah (gel dapat menjadi kempes).
7. Dilakukan pembuatan Ruler :
- Untuk DNA yang belum di PCR: 1mikronliter loading dye (biru) + 1 mikronliter gel red diresuspensi tambah gen ruler 5 mikronliter (1KBp) diresuspensi
dimasukkan ke dalam gel.
- Untuk DNA yang sudah di PCR: 1 mikronliter gel red + 5 mikronliter gen Ruler (100 Bp) diresuspensi dimasukkan ke dalam gel
8. Larutan yang akan dielektroforesis:
- Untuk DNA yang belum di PCR: 1 mikronliter loading dye (biru) + 1 mikron liter gel red + 5 mikronliter DNA yang sudah di PCR resuspensi dimasukkan ke gel.
- Untuk DNA yang sudah di PCR (untuk masing – masing primer 005 dan 308): 1 mikronliter gel red + 5 mikronliter DNA yang sudah di PCR
9. Hubungkan alat elektroforesis dengan sumber arus dan nyalakan sumber arus pada70 Volt sampai bromofenol biru mencapai ujung gel (kurang lebih 25 menit)
10. Matikan sumber arus.
11. Keluarkan gel dari tangki gel. Dilihat di ruang gelap dengan cahaya UV 12. Amati dan dokumentasikan hasil pengamatan tadi.
Perhatian:
Jangan menyentuh gel/buffer dalain tangki elektrotoresis bila sumber arus sedang menyala.
1.4 Pustaka
1. Birren,B.. Green.E.D., Klapholz,S., Myers,R..H., Riethman.H. & Roskams.J. (1999) Genome Analysis. a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York.
Appendix 2
2. Barker,K. (1998) At the Bench: a Laboratory Navigator. Cold Spring HarborLaboratory Press. New York. Chapter 15.
3. Sambrook,J.. Fritsch.E.F. Maniatis,T. (1989) Molecular Cloning. a LaboratoryManual, Book 1. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, hal. 6.1 - 6. 15
