ii
iii
KARYA ILMIAH
TINJAUAN KEAMANANAN
EFFECTIVE MICROORGANISM-4
(EM4) YANG DIBERIKAN PADA TIKUS PUTIH (
Rattus
norvegicus
) SECARA PER ORAL
OLEH
I MADE MERDANA NIP. 197907072005011001 I WAYAN SUDIRA NIP. 196902281997031003
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS UDAYANA
iv
TINJAUAN KEAMANANAN EFFECTIVE MICROORGANISM-4 (EM4) YANG DIBERIKAN PADA TIKUS PUTIH (Rattus norvegicus)
SECARA PER ORAL
OLEH :
I MADE MERDANA NIP. 197907072005011001 I WAYAN SUDIRA NIP. 196902281997031003
MENGESAHKAN/MENGETAHUI
KEPALA LABORATORIUM FARMAKOLOGI VETERINER
v
RINGKASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aspek keamanan Effective
Microorganism-4 (EM4®) yang diberikan pada tikus putih (Rattus novergicus) secara
per oral dengan mengamati gambaran histopatologi organ usus, hati dan ginjal.
Menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 5 jenis perlakuan dan 5 kali
ulangan 25 ekor tikus dibagi menjadi 5 kelompok. Perlakuan EM4® per oral dengan
dosis bertingkat secara berurutan yaitu; kelompok kontrol (K), perlakuan (EM4A,
EM4B, EM4C dan EM4D) : 1 ml aquadest tanpa pemberian EM4®; 0,25 ml; 0,5 ml; 1
ml dan 2 ml EM4® per ekor setiap hari. Setelah 28 hari perlakuan tikus dieutanasi dan
dinekropsi. Pembuatan preparat histopatologi usus, hati dan ginjal dengan pewarnaan
HE metode Harris (Humason, 1972).
Berdasarkan pengamatan histopatologi usus, hati dan ginjal diperoleh hasil
bahwa tidak terdapat perbedaan gambaran struktur histologis antara kelompok kontrol
dengan kelompok perlakuan. Tidak ditemukan adanya perubahan yang menunjukkan
degenerasi, hiperemi, nekrosis, peradangan ataupun kejadian toksisitas. Hasil ini
menunjukkan bahwa probiotik EM4® tidak menggangu aktivitas ataupun kerja dari
organ-organ tersebut dan tidak menimbulkan toksisitas pada struktur jaringan usus, hati
dan ginjal.
Hasil penelitian ini menunjukkan kemampuan probiotik EM4® dalam
mengembalikan keseimbangan rasio antara bakteri patogen dan nonpatogen saluran
pencernaan dengan cara menekan pertumbuhan mikroorganisme patogen sehingga
jumlah bakteri non patogen meningkat dengan cepat. Mekanisme kerja probiotik dalam
kompetisi dengan membentuk koloni dan melakukan perlekatan (adhesion) pada sel-sel
enterosit, sehingga berefek pada meningkatnya barier mukosa usus. Kemampuan bakteri
asam laktat dalam EM4® untuk memproduksi senyawa bioaktif yaitu asam laktat dan
senyawa antibiotika juga mampu menekan pertumbuhan mikroorganisme patogen.
Kondisi ini membuat saluran cerna menjadi lebih sehat sehingga penyerapan sari-sari
makanan menjadi lebih baik dan performa hewan coba akan meningkat secara umum.
Kesiimpulan yang dapat dikemukakan dari penelitian ini bahwa pemberian
vi
usus, ginjal dan hati. Saran yang dapat disampaikan berdasarkan hasil penelitian ini
perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan dosis EM4® yang lebih tinggi dan dalam
waktu yang lebih lama. Hasil ini juga menunjukkan bahwa EM4® tidak berbahaya
vii
KATA PENGANTAR
Puji syukur penulis panjatkan kehadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa / Tuhan
yang Maha Esa karena atas anugrah Nya, sehingga penelitian yang berjudul Tinjauan
Keamanan Effective Microorganism-4 (EM4) Yang Diberikan Pada Tikus Putih (Rattus
norvegicus) Secara Per Oral ini dapat terselesaikan dengan baik.
Penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih yang sebesar-besarnya kepada
bapak Dr. Drh I Wayan Sudira, M.Si selaku pembimbing yang dengan penuh kesabaran
dan tidak pernah kenal lelah dalam memberikan dorongan dan sumbangan pemikiran.
Penulis sangat menyadari akan keterbatasan kemampuan yang dimiliki sehingga
menjadikan karya ilmiah ini masih jauh dari sempurna. Untuk itu penulis pada
kesempatan ini menyampaikan permohonan maaf dan mengharapkan masukan untuk
kesempurnaan penulisan berikutnya.
Akhir kata penulis mengharapkan semoga penelitian ini dapat memberikan
manfaat untuk kemajuan ilmu pengetahuan khususnya pada bidang kesehatan dan
kedokteran hewan.
Denpasar, Januari 2016 Peneliti,
viii
3.7 Lokasi dan Waktu Penelitian ... 15
3.7 Analisis Data ... 15
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 16
4.1 Pemeriksaan Histopatologi Usus ... 16
4.2 Pemeriksaan Histopatologi Hati ... 17
4.3 Pemeriksaan Histopatologi Ginjal ... 19
4.4 Pembahasan ... 20
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 25
5.1 Kesimpulan ... 25
5.2 Saran ... 25
ix
DAFTAR TABEL
x
DAFTAR GAMBAR
3.1 Kerangka Konsep Penelitian ... 19
4.1.a Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok kontrol ... 16
4.1.b Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4A ... 17
4.1.c Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4B ... 17
4.1.d Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4C ... 17
4.1.e Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4D ... 17
4.2.a Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok kontrol ... 18
4.2.b Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4A ... 18
4.2.c Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4B ... 18
4.2.d Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4C ... 18
4.2.e Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4D ... 18
4.3.a Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok kontrol ... 19
4.3.b Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4A ... 19
4.3.c Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4B ... 19
4.3.d Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4C ... 20
xi BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikroorganisme sebagai agen bioteknologi telah dikembangkan secara luas,
salah satunya sebagai probiotik (Wididana, 1996). Penggunaan probiotik atau disebut
dengan effective microorganism (EM) mampu meningkatkan performa berbagai hewan
ternak secara umum (Suwidjayana dan Bidura, 2000; Daud et al., 2007). Telah diteliti
pemberian EM yang disuplementasi pada ransum menyebabkan pertambahan berat
badan itik pedaging (Suwidjayana dan Bidura, 2000) serta meningkatkan jumlah dan
bobot telur pada itik gembala (Purnomo dan Julaeha, 2006). Pada ayam pedaging yang
diberikan kombinasi prebiotik dan probiotik selama enam minggu menunjukkan
penurunan kadar lemak karkas dan kadar kolesterol serum darah (Daud et al., 2007).
Pemanfaatan EM untuk pengembangan teknologi pakan ternak dari limbah pertanian
semakin berkembang pesat. Pada ternak ruminansia, EM mampu meningkatkan daya
cerna rumen terhadap ransum berserat tinggi, secara langsung akan berpengaruh
terhadap pertambahan bobot badan sapi (Wina, 2005). Probiotik dijadikan alternatif
pengganti antibiotika sebagai growth factor. Pada budidaya perairan, penggunaan
bakteri EM strain K-7 mampu meningkatkan daya hidup larva kepiting bakau (Rusdi et
al., 2005).
Konsep probiotik dipopulerkan oleh Fuller (1992), sebagai mikroorganisme
hidup menguntungkan yang dimasukkan ke dalam tubuh manusia atau hewan secara
oral. Mikroba hidup itu diharapkan mampu memberikan pengaruh positif terhadap
xii
kesehatan manusia atau hewan dengan cara mengembalikan keseimbangan rasio antara
bakteri patogen dan nonpatogen saluran pencernaan. Salah satu probiotik yang
dipasarkan secara komersial yaitu Effective Microorganism-4 (EM4®) produksi PT.
Songgolangit Persada. Effective Microorganism-4 mengandung kombinasi bakteri
fotosintetik, bakteri asam laktat, Yeast dan Actinomyces (Wididana et al., 1996).
Effective Microorganisms-4® bekerja memanipulasi proses pencernaan di dalam
saluran pencernaan hewan ternak melalui peningkatan aktivitas enzim-enzim
pencernaan. Lactobacillus dapat memfermentasi glikosida, pati, dan hemiselulosa dalam
ransum menjadi asam laktat dan senyawa antimikroba (Oktaviani, 2004). Kedua
komponen bioaktif tersebut mampu menekan pertumbuhan bakteri patogen sehingga
memberikan kesempatan kompetisi yang maksimal bagi pertumbuhan bakteri non
pathogen (Ouwehand, 1998). Monosakarida, asam laktat, asam lemak atsiri, gliserol dan
asam amino hasil pencernaan diabsorpsi memasuki sirkulasi darah melalui mekanisme
transport aktif saluran pencernaan untuk selanjutnya dibawa ke hati. Di dalam hati asam
laktat diubah menjadi glukosa melalui proses glukoneogenesis (Susila et al., 1998). Hati
merupakan organ tubuh yang penting dalam menjaga dan menentukan derajat
kesehatan hewan. Residu dari proses biotransformasi hati dan metabolitnya akan
diekskresikan melalui ginjal. Kondisi metabolit yang mengalami perubahan menjadi
garam organik yang mudah larut berpengaruh terhadap berubahnya pH urine,
kandungan amoniak dan kerja ginjal (Harper et al., 1987 dan Mustchler, 1991).
Kendati telah banyak dilaporkan aplikasi langsung probiotik pada ternak di
lapangan dengan hasil yang positif, akan tetapi masih sangat minim informasi mengenai
organ-xiii
organ vital seperti usus, hati dan ginjal. Dengan demikian ini menjadi suatu peluang
penelitian yang menarik untuk mengetahui dinamika dari EM4® pada hewan coba
dalam keadaan sehat atau normal. Perubahan ke arah patologis pada organ usus, hati
dan ginjal dapat dilihat dari gambaran histopatologis berupa gambaran degenerasi,
hiperemi dan atau nekrosis.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang tersebut dapat dirumuskan permasalahan apakah
pemberian EM4® per oral berpengaruh terhadap gambaran histopatologi usus, hati dan
ginjal tikus putih (Rattus norvegicus) ?
1.3 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui perubahan gambaran histopatologi
usus, hati dan ginjal tikus putih (Rattus norvegicus) setelah pemberian EM4® secara per
oral.
1.4 Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat :
1. Memberikan kontribusi informasi mengenai aspek farmakodinamika dari
pemberian probiotik EM4® per oral pada tikus putih (Rattus norvegicus) dari
xiv
2. Membuktikan bahwa EM4® yang diberikan mampu meningkatkan performa
ternak juga baik terhadap organ-organ dalam dari tikus seperti usus, hati dan
xv BAB II
KAJIAN PUSTAKA
2.1 Tinjauan Umum Tentang Probiotik
Probiotik didefinisikan sebagai mikroorganisme hidup baik dalam bentuk
tunggal maupun campuran yang disuplementasikan pada bahan pangan dengan tujuan
untuk memberikan efek menguntungkan bagi kesehatan saluran pencernaan pada
manusia atau hewan. Efek kesehatan yang ditimbulkan setelah mengkonsumsi bahan
mengandung probiotik dapat diartikan sebagai efek dari probiotik. Peran penting
probiotik dalam memperbaiki keadaan saluran dan sistem pencernaan ternak dengan
menjaga kesimbangan mikroflora usus sehingga aktivitas enzim sistem pencernaan
berlangsung lebih stabil dan proses pencernaan sari-sari makanan akan berlangsung
lebih optimal (Fuller, 1992).
Konsep probiotik pertama kali berkembang berawal dari teori putrefactive yang
dikemukakan oleh Elie Metchnikoff pada tahun 1908. Menurutnya dalam kondisi sehat
keseimbangan mikroflora saluran pencernaan manusia dan hewan resisten terhadap
aktivitas bakteri patogen. Secara perlahan proses pembusukan (putrefaksi) oleh bakteri
patogen di dalam usus besar menghasilkan senyawa beracun dan bila terjadi infeksi
pada usus toksin dapat memasuki peredaran darah dan disebut sebagai proses
auotointoksikasi. Metchnikoff berhasil mengisolasi Lactobacillus dari susu fermentasi
yang dikonsumsi oleh warga suku pegunungan di Bulgaria dan diyakini meningkatkan
kesehatan tubuh dan menyebabkan umur panjang (Klaenhammer, 2001).
xvi
Komposisi probiotik dapat bentuk kultur mikroba sediaan tunggal atau
campuran, yang terdiri dari bakteri Gram positif, bakteri Gram negatif, Yeast dan
Actinomyces yang memberikan keuntungan bagi tubuh. Species bakteri yang sering
digunakan yaitu Lactobacillus sp., Leuconostoc sp., Bifidobacterium sp.dan
Streptococcus lactis dan Streptococcus thermophillus. Dari spesies Yeast yang sangat
terkenal yaitu Saccharomyces cerevissidae dan dari spesies jamur meliputi Aspergillus
niger dan Aspergillus oryzae (Fuller, 1992).
2.2 Effective Microorganisms-4 (EM4®)
Teknologi Effective Microorganism atau yang lebih dikenal teknologi EM telah
diterapkan dan dikembangkan hampir di seluruh dunia. Prof. Teruo Higa adalah orang
pertama mengembangkan teknologi EM dari University of the Ryakyus, Okinawa,
Jepang di era tahun 1980-an. Teknologi EM masuk ke Indonesia tahun 1990-an
dikembangkan oleh Indonesian Kyusei Forming Societies (IKNFS) (Wididana et al.,
1996).
Effective Microorganisms-4 (EM4®) produksi PT. Songgolangit Persada
mengandung campuran mikroorganisme fermentasi, bakteri fotosintetik
(Rhodopseudomonas sp.), bakteri asam laktat (Lactobacillus sp.), Yeast (Saccharomyces
sp.) dan Actinomyces (Wididana et al., 1996). Probiotik EM4 yang ditujukan untuk
ternak antara lain mengandung : Lactobacillae, bakteri pengurai fosfat, bakteri
fotosintetik, Yeast dan Actinomyces. Probiotik EM4 dapat berperan memanipulasi
proses pencernaan di dalam saluran pencernaan hewan dan ternak melalui peningkatan
xvii
Bakteri asam laktat (BAL) yang terkandung dalam EM4 mampu memproduksi
komponen bioaktif yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Komponen
tersebut adalah produk keasaman dan metabolit antimikroba. Keasaman ini diakibatkan
oleh produksi asam laktat yang tinggi sehingga mampu menurunkan pH dengan cepat
menjadi pH 3-5, sehingga bakteri patogen tidak mampu untuk beradaptasi. (Axelsson,
1998 dan Oktaviani, 2004). Senyawa antimikroba yang dihasilkan antara lain hidrogen
peroksida, reuterine, bakteriosin, aldehid, keton, alkohol dan diasetil. Contoh
Lactobacillus plantarum memproduksi hidrogen peroksida sebagai antiseptik juga
mempunyai kemampuan memproduksi bakteriosin sebagai antibiotika (Jenie dan Rini,
1995; Ouwehand, 1998). Dengan demikian akan memberikan peluang bagi
pertumbuhan mikroorganisme yang menguntungkan untuk berkembang lebih banyak,
sehingga dapat meningkatkan pertumbuhan hewan ternak.
Yeast yang terkandung dalam EM4 berperan sebagai sumber vitamin B
kompleks. Seperti telah diketahui bahwa vitamin B kompleks berfungsi untuk
meningkatkan nafsu makan hewan ternak (Sukaryani, 1997). Kandungan ß-D glukan
dari dinding Yeast telah banyak dilaporkan berperan sebagai imunostimulan (Ahmad,
2005). Yeast juga bekerja sebagai fermenter bahan-bahan organik di dalam saluran
pencernaan menjadi asam-asam amino serta gula-gula sederhana dalam bentuk terlarut
sehingga lebih mudah diabsorpsi (Higa dan Parr, 1994). Penambahan probiotik EM4
dalam ransum dapat menurunkan kadar kolesterol dan low density lipoprotein (LDL),
sebaliknya dapat meningkatkan high density lipoprotein (HDL) dalam darah. Low
density lipoprotein (LDL) berkaitan erat dengan sejumlah kadar kolesterol dalam
xviii
(Suwidjayana et al., 1997). Dalam proses fermentasi glikosida, pati, dan hemiselulosa
ransum dihasilkan asam laktat dan asam lemak atsiri yang kemudian memasuki sirkulasi
darah melalui proses absorpsi saluran pencernaan untuk selanjutnya dibawa ke hati
(Mustchler, 1991 dan Susila et al., 1998).
2.3 Usus
Usus atau intestine adalah bagian dari sistem pencernaan yang bermula dari
kaudal lambung hingga anus. Pada usus terdiri dua bagian yaitu : usus halus dan usus
besar (kolon). Pada usus halus terbagi lagi menjadi duodenum, jejunum dan ileum
sedangkan usus besar terbagi menjadi cecum, kolon dan rektum.
Tahap akhir dari proses pencernaan makanan terjadi di bagian usus dengan
bantuan bermacam-macam enzim. Enzim-enzim yang terdapat pada usus halus dapat
memecah karbohidrat menjadi monosakarida, lemak menjadi asam-asam lemak dan
gliserol, serta protein menjadi asam-asam amino. Setelah menjadi molekul-molekul
berukuran kecil barulah dapat diabsorbsi ke dalam peredaran darah (Travis, 2003). Pada
sistem saluran pencernaan sebenarnya berlangsung beragam fungsi metabolisme dalam
menjaga keseimbangan tubuh sehingga tetap dalam keadaan sehat. Dalam hal ini
mencakup peran mikroba yang menghuni saluran pencernaan tersebut, khususnya peran
mikroba yang menguntungkan (Travis, 2003; Hall, 2006).
Pada waktu lahir usus bersifat steril, tetapi jasad renik segera masuk bersama
dengan makanan. Pada anak hewan yang disusui, usus banyak mengandung
streptococcus asam laktat dan laktobaksil. Dengan berkembangnya pola dan kebiasaan
xix
pada duodenum terdapat 103-106 bakteri/g isi lambung; dalam jejunum dan ileum
terdapat 105-108 bakteri/g isi lambung; dan dalam sekum dan kolon terdapat 108-1010
bakteri/g. Pada usus halus bagian atas terutama terdapat laktobaksil dan enterococcus,
tetapi pada ileum bagian bawah dan sekum, floranya merupakan flora tinja (Jawetz et
al., 1995).
2.4 Hati
Hati merupakan organ dalam terbesar, dan merupakan kelenjar terbesar pada
tubuh. Hati terletak di dalam rongga abdomen, terdiri dari lobus kanan dan lobus kiri
(Ressang, 1984). Setiap lobus hati dibagi menjadi struktur yang dinamakan lobulus.
Setiap lobulus merupakan bentuk heksagonal, terdiri atas Lempeng-Lempeng sel hati
berbentuk kubus yang tersusun radial mengelilingi vena centralis dan di antara sel-sel
hati tersebut terdapat kapiler-kapiler atau sinusoid. Sinusoid hati adalah saluran darah
yang berliku-liku dan melebar, dengan diameter tidak teratur dilapisi sel endotel
bertingkat tidak utuh ,yang dipisahkan dari hepatosit di bawahnya oleh ruang
perisinusoidal (Price dan Wilson, 1984).
Fungsi hati memegang peranan sangat vital yaitu fungsi sirkulasi, fungsi
metabolisme, fungsi sekresi dan ekskresi, fungsi hematologi serta fungsi proteksi dan
detoksifikasi. Fungsi sirkulsi hati berperan sebagai organ reservoir darah. Hati
mempunyai sistem peredaran darah yang amat baik, yaitu dengan adanya sinusoid
hepatik. Fungsi metabolisme dimana pada hati terjadi proses biotransformasi sari
makanan seperti karbohidrat, lemak, protein, vitamin dan mineral yang sangat penting
xx
mengsekresi dan ekskresi empedu mempunyai beberapa manfaat yang penting bagi
tubuh yaitu empedu membantu pencernaan lemak makanan dan eksresi zat-zat lain yang
tidak berguna bagi tubuh. Fungsi hematologik hati berfungsi pada produksi fibrinogen,
trombosit, heparin dan destruksi eritrosit pada orang dewasa. Pemecahan eritrosit
menjadi komponen-komponennya juga terjadi di hati. Fungsi hati sebagai proteksi dan
detoksifikasi dikerjakan oleh sel-sel Kupfer yang mempunyai kemampuan untuk
fagositosis. Sel Kupfer merupakan alat penyaring terhadap kuman-kuman atau benda
asing yang masuk ke dalam hati lewat darah vena porta.
Kerusakan hepar dapat diakibatkan konsumsi kronik alkhohol, kegemukan yang
berlebihan, diet yang tidak tepat, masuknya obat atau zat berbahaya ke dalam tubuh,
dapat juga karena infeksi. Hal tersebut mengakibatkan kerusakan pada pembuluh darah
yang berefek terhadap kerusakan sel-sel hati (Ressang, 1984).
2.5 Ginjal
Ginjal merupakan organ besar berbentuk seperti kacang, yang terletak di bagian
retroperitoneal pada dinding posterior tubuh. Ginjal sebelah kanan lebih rendah
dibandingkan ginjal kiri karena tertekan ke bawah oleh hati (Price dan Wilson, 1995).
Ginjal secara anatomis dibagi menjadi bagian korteks di sebelah luar yang mengandung
semua kapiler glomerulus dan sebagian segmen tubulus pendek dan bagian medula di
sebelah dalam tempat sebagian besar segmen berada. Berat ginjal normal 0,5 % dari
berat tubuh hewan (Harison, 2000).
Fungsi utama dari ginjal adalah berperan dalam pengaturan volume dan kimia
xxi
secara selektif. Selain itu ginjal juga berperan penting dalam mempertahankan
keseimbangan asam-basa. Sebagian besar proses metabolisme dalam tubuh
menghasilkan asam, hanya ginjal yang mampu mengeliminasi asam-asam yang tidak
mudah menguap. Yang lebih penting lagi, ginjal memiliki tugas penting untuk
menyerap ulang sejumlah besar bikarbonat basa yang difiltrasi secara bebas di
glomerulus. Tanpa fungsi ini dapat terjadi pH darah yang rendah yang berakibat
kematian (Price dan Wilson, 1995).
Hampir tiap substansi kimia berpengaruh pada kerja ginjal, sehingga jika bekerja
cukup berat maka akan mengakibatkan degenerasi parenkimatosa pada kortek ginjal.
Ginjal sedikit membesar serta kortek membengkak. Secara mikroskopis epitel pada
tubulus konvulatus bengkak dan pada tubulus ditemukan adanya eksudat albuminosa.
Penelitian lain mengatakan bahwa berbagai bahan atau substansi kimia tersebut dapat
menimbulkan degenerasi albuminosa, degenerasi melemak dan nekrosis dari sel-sel
xxii BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan 5 jenis
perlakuan dan dengan 5 kali ulangan, dimana sebanyak 25 ekor tikus secara acak dibagi
menjadi 5 kelompok. Perlakuan EM4® per oral dengan dosis bertingkat disajikan pada
skema rancangan penelitian Tabel 3.1. Perlakuan dengan menggunakan bantuan sonde,
diberikan satu kali setiap hari selama 28 hari.
Tabel 3.1. Tabel Rancangan Penelitian
dikendalikan yaitu hewan coba, umur, strain, berat badan, pakan dan minum, kandang,
peralatan yang digunakan serta lama perlakuan. Variabel tergantung yang diamati pada
penelitian ini yaitu gambaran histopatologi usus, hati dan ginjal.
xxiii 3.3 Bahan Penelitian
Bahan yang dipergunakan dalam penelitian ini yaitu Effective Microorganisme-4
(EM4®) produksi PT. Songgolangit Persada. Hewan coba yang digunakan adalah tikus
putih (Rattus novergicus) umur 3 bulan dengan berat badan rerata 200 gram. Pakan
yang diberikan produksi PT. Charoen Pokphand Indonesia dengan kode pakan 551 yang
memiliki komposisi air max 13%, protein kasar 19,5%, lemak kasar 4%, serat kasar
max 6%, abu max 8%, kalsium 0,9% dan fosfor 0,7%. Minuman diberikan air bersih
secara ad libitum. Berbagai bahan dan alat yang digunakan sebelum pemeriksaan
sampel meliputi kandang tikus, sonde dengan desain khusus, timbangan, pot plastik,
box plastik, spuite 3 ml, gunting bedah, pinset, sarung tangan, aquades, tissue, kapas,
alkohol 70% dan ether.
3.4 Instrumen Penelitian
Instrumen yang dipergunakan pada penelitian yaitu seperangkat alat nekropsi
yaitu pisau bedah, gunting bedah dan pinset. Seperangkat alat untuk pemeriksaan
histopatologi usus, hati dan ginjal. Pembuatan preparat histopatologi (tissue processing)
sesuai metode Humason (1972).
3.5 Prosedur Penelitian
Effective Microorganisms yang digunakan EM4® produksi PT. Songgolangit
Persada kemasan 1 liter yang mengandung kombinasi bakteri fotosintetik, bakteri asam
laktat, Yeast dan Actinomyces. Uji Viabilitas dengan menumbuhkan EM4® pada media
xxiv 3.5.1 Pemberian EM4®
Persiapan hewan coba dengan mengadaptasikan tikus pada kandang percobaan
selama 7 hari dan dilanjutkan dengan adaptasi pengenalan sonde dengan diberikan
aquadest selama 7 hari. Effective Microorganism-4 diberikan secara per oral satu kali
setiap hari selama 28 hari. Dosis bertingkat yang diberikan sebagai berikut: kelompok
kontrol = tanpa pemberian EM4® tetapi diberikan 1 ml aquadest per ekor, kelompok
EM4A = diberikan dosis 0,25 ml EM4® per ekor, kelompok EM4B = diberikan dosis
0,5 ml EM4® per ekor, kelompok EM4C = diberikan dosis 1 ml EM4® per ekor,
kelompok EM4D = diberikan dosis 2 ml EM4® per ekor. Pakan diberikan pagi dan sore
hari, 10 gram per ekor tikus setiap pemberian dan air minum diberikan ad libitum.
3.5.2 Pengambilan Sampel
Sebelum dilakukan nekropsi sesuai metode Hussein (2008), tikus terlebih dahulu
dieuthanasia dengan menggunakan ether di dalam box plastik. Nekropsi dilakukan
sesuai prosedur nekropsi pada mamalia. Setelah dilakukan nekropsi selanjutnya organ
usus, hati dan ginjal diambil dan dimasukkan ke dalam pot plastik yang telah berisi
buffer formalin 10%, selanjutnya dibuat preparat histopatologi dengan pewarnaan HE
metode Harris (Humason, 1972).
3.5.3 Pembuatan preparat histopatologi
Proses pembuatan preparat histopatologi dengan tahap tissue processing sesuai
metode Humason (1972). Sampel usus, hati dan ginjal yang telah direndam di dalam
Neutral Buffered Formalin (NBF) 10% dipindahkan direndam secara bertingkat ke
xxv
1 jam, alkohol 90% selama 2 jam dan alkohol 96% selama 2 jam. Kemudian dilanjutkan
tahap clearing dengan merendam organ ke dalam alkohol absolute I dan absolute II
masing-masing selama 2 jam. Tahap selanjutnya sampel organ tersebut dimasukkan ke
dalam paraffin I dan paraffin II masing-masing selama 2 jam (dicetak menggunakan
sepasang plat “L”). Perendaman paraffin digunakan sebagai zat penunjang untuk
mempermudah pekerjaan pada saat pemotongan jaringan menggunakan mikrotom
dengan ketebalan 4-5 µm.
Prosedur pewarnaan Harris Hematoxylin dan Eosin adalah sebagai berikut :
sampel organ yang telah menjalani Tissue Processing dan dipotong, dimasukkan ke
dalam xylol I, II, dan III masing-masing selama 5 menit bertujuan untuk melarutkan
paraffin yang masih ada di dalam jaringan (deparafinisasi). Dilanjutkan dengan
perendaman secara berurutan ke dalam alkohol 100% sebanyak 2 kali masing-masing
selama 5 menit, aquades selama 1 menit dan zat warna Harris-Hematoxylin selama 15
menit. Proses berikutnya dimasukkan ke dalam aquades selama 1 menit (digerakkan
naik turun) bertujuan untuk pencucian zat warna, alkohol 1% sebanyak 7-10 celupan
untuk melarutkan Hematoxylin yang ada di luar inti sel, aquades I selama 1 menit untuk
menghentikan reaksi acid alcohol, aquades II selama1 menit untuk mengembalikan
warna biru pada inti sel. Selanjutnya dimasukkan ke dalam alkohol 96% I, II dan
alkohol 100% I,II masing-masing selama 3 menit (untuk menarik air dari dalam sel)
serta ke dalam xylol IV dan V masing-masing selama 5 menit untuk menarik alkohol
dari dalam sel. Terakhir dilakukan penutupan dengan cover glass (mounting) yang
direkatkan dengan entellan. Preparat histologi yang sudah jadi kemudian diperiksa di
xxvi
Pemeriksaan preparat histologi dilakukan masing-masing pada 5 lapang pandang
mikroskopik, pada pembesaran 10x40. Perubahan histopatologi usus akibat pemberian
EM4®diamati berdasarkan ditemukan adanya degenerasi hidrofik, degenerasi melemak
dan nekrosis pada usus. Perubahan ini merupakan tanda adanya keracunan (intoksikasi).
3.6 Lokasi dan Waktu Penelitian
Tempat penelitian di Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Veteriner,
Laboratorium Mikrobiologi Veteriner dan Laboratorium Patologi Veteriner Fakultas
Kedokteran Hewan Universitas Udayana selama 3 bulan.
3.7 Analisis Data
Data hasil pemeriksaan histopatologi organ usus, hati dan ginjal tikus putih yang
xxvii BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pemeriksaan histopatologi usus
Pemeriksaan dilakukan terhadap preparat histopatologi dari sampel organ usus
halus, hati dan ginjal dari 25 ekor tikus putih yang dipakai penelitian. Pengamatan
dilakukan pada lima lapang pandang mikroskopik (HE. 10 x 40). Berdasarkan
pemeriksaan histopatologi usus halus tidak ditemukan adanya perubahan struktur umum
fili-fili usus, sel-sel epithel penyusun mukosa maupun lapisan-lapisan di bawahnya.
Gambar histopatologi usus halus hasil penelitian masing-masing kelompok perlakuan
dapat dilihat pada Gambar 4.1.a (K), b (EM4A), c (EM4B), d (EM4C) dan e (EM4D).
Gambar 4.1.a
Gambar 4.1.a. Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok Kontrol (tanpa diberi probiotik EM4®). Tampak struktur fili usus normal (HE. 10x40).
A
B
C
D
xxviii
Gambar 4.1.b Gambar 4.1.c
Gambar 4.1.b. Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4A (pemberian probiotik EM4® dosis 0,25 ml) . Tampak struktur fili usus normal (HE. 10x40).
Gambar 4.1.c. Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4A (pemberian probiotik EM4® dosis 0,50 ml) . Tampak struktur fili usus normal (HE. 10x40).
Gambar 4.1.d Gambar 4.1.e
Gambar 4.1.d. Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4C (pemberian probiotik EM4® dosis 1 ml) . Tampak struktur fili usus normal (HE. 10x40).
Gambar 4.1.e. Gambaran histopatologi usus tikus putih kelompok EM4D (pemberian probiotik EM4® dosis 2 ml). Tampak struktur fili usus normal (HE. 10x40).
4.2 Pemeriksaan histopatologi hati
Berdasarkan pemeriksaan histopatologi jaringan hati tidak ditemukan adanya
perubahan patologik baik berupa degenerasi hidrofik, degenerasi melemak maupun
nekrosis. Gambar histopatologi hati masing-masing kelompok perlakuan dapat dilihat
pada Gambar 4.2.a (K), b (EM4A), c (EM4B), d (EM4C) dan e (EM4D). Pengamatan
xxix Gambar 4.2.a
Keterangan gambar : A = Vena Portae B = Sinusoid C = Hepatosit
Tanda panah menunjukkan vena porta pada Gambar 4.2.b, c, d dan e
Gambar 4.2.a. Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok Kontrol (tanpa diberi probiotik EM4®). Struktur histopatologi hati tampak normal (HE. 10x40).
Gambar 4.2.b Gambar 4.2.c
Gambar 4.2.b. Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4A (pemberian probiotik EM4® dosis 0,25 ml). Struktur histopatologi hati tampak normal. (HE.10x40). Gambar 4.2.c. Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4B (pemberian probiotik EM4® dosis 0,5 ml). Struktur histopatologi hati tampak normal. (HE.10x40).
Gambar 4.2.d Gambar 4.2.e
Gambar 4.2.d. Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4C (pemberian probiotik EM4® dosis 1 ml). Struktur histopatologi hati tampak normal (HE. 10x40).
C
A
xxx
Gambar 4.2.e. Gambaran histopatologi hati tikus putih kelompok EM4D (pemberian probiotik EM4® dosis 2 ml). Struktur histopatologi hati tampak normal (HE. 10x40). 4.3 Pemeriksaan histopatologi ginjal
Berdasarkan pemeriksaan histopatologi jaringan ginjal tidak ditemukan adanya
perubahan patologik berupa degenerasi hidrofik, degenerasi melemak maupun nekrosis.
Gambar histopatologi ginjal masing-masing kelompok perlakuan dapat dilihat pada
Gambar 4.3.a (K), b (EM4A), c (EM4B), d (EM4C) dan e (EM4D). Pengamatan
dilakukan pada lima lapang pandang mikroskopik (HE.10 x40)
Gambar 4.3.a
Keterangan gambar :
Tanda panah menunjukkan Glomerulus (Gambar 4.3.a, b, c, d dan e)
Gambar 4.3.a. Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok Kontrol (tanpa diberi EM4®). Tampak struktur Glomerulus dan Tubulus normal (HE. 10x40).
Gambar 4.3.b Gambar 4.3.c
Gambar 4.3.b. Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4A (pemberian probiotik EM4® dosis 0,25 ml). Tampak struktur normal (HE. 10x40).
xxxi
Gambar 4.3.d Gambar 4.3.e
Gambar 4.3.d. Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4C (pemberian probiotik EM4® dosis 1 ml). Tampak struktur normal (HE. 10x40).
Gambar 4.3.e. Gambaran histopatologi ginjal tikus putih kelompok EM4D (pemberian probiotik EM4® dosis 2 ml). Tampak struktur normal (HE. 10x40).
4.4 Pembahasan
Seperti yang telah diketahui bahwa organ tubuh seperti usus, hati dan ginjal
memegang peran yang sangat vital dalam proses metabolisme tubuh. Fungsi yang
dimiliki berbeda-beda dari masing-masing organ akan tetapi saling terkait dalam proses
pemenuhan kebutuhan hidup. Pada usus halus berlangsung proses pencernaan tahap
akhir dengan bantuan bermacam-macam enzim memecah karbohidrat menjadi
monosakarida, lemak menjadi asam-asam lemak dan gliserol, serta protein menjadi
asam-asam amino. Setelah menjadi molekul-molekul berukuran kecil barulah dapat
diabsorbsi ke dalam peredaran darah (Travis, 2003; Hall 2006). Nutrisi berupa molekul
monosakarida, asam-asam lemak, gliserol dan asam-asam amino yang terabsorbsi
bersama peredaran darah dibawa ke hati (Mustchler, 1991). Di dalam hati asam laktat
diubah menjadi glukosa melalui proses glukoneogenesis (Susila et al., 1998). Residu
dari proses biotransformasi hati dan metabolitnya akan diekskresikan melalui ginjal,
khususnya metabolit yang tidak mudah menguap. Reabsorpsi tubulus untuk kebanyakan
xxxii
sehingga merperberat kerja ginjal. Hampir tiap substansi kimia berpengaruh pada kerja
ginjal, sehingga besar kemungkinan potensi terjadinya degenerasi (Harper et al., 1987
dan Mustchler, 1991).
Fakta pemberian EM4 sudah banyak dilaporkan mampu meningkatkan performa
hewan ternak, akan tetapi pada penelitian ini ingin di tinjau apakah efek pemberian
EM4 tersebut juga berpengaruh tidak baik terhadap organ-organ yang terlibat seperti
usus, hati dan ginjal serta kemungkinan terjadinya toksisitas.
Berdasarkan pengamatan histopatologi usus, hati dan ginjal diperoleh hasil
bahwa tidak terdapat perbedaan gambaran struktur histologis antara kelompok kontrol
(K) dengan kelompok perlakuan (EM4A, EM4B, EM4C dan EM4D) (seperti pada
gambar 4.1. a, b, c, d, e; gambar 4.2. a, b, c, d, e dan gambar 4.3. a, b, c, d, e). Dari
pengamatan histopatologi usus secara umum fili-fili usus dalam keadaan normal, tidak
ditemukan adanya perubahan degenerasi melemak, degenerasi hidrofik maupun nekrosis
sebagai tanda-tanda dari kejadian toksisitas. Tanda peradangan maupun infeksi juga
tidak ada dengan tidak ditemukannya infiltrasi sel-sel radang maupun kerusakan pada
fili-fili dan mukosa usus. Hasil pengamatan histopatologi hati tampak struktur hati
dalam keadaan normal. Tidak ditemukan gambaran degenerasi, nekrosis, hiperemi
maupun keberadaan sel-sel Kupfer di sekitar vena porta dan sinusoid hati sebagai tanda
adanya peradangan atau infeksi. Pada pengamatan histopatologi ginjal juga tidak
ditemukan perubahan yang menunjukkan degenerasi melemak, degenerasi hidrofik
maupun nekrosis. Tidak ditemukan hiperemi maupun keberadaan infiltrasi sel radang
xxxiii
epithel tidak mengalami nekrosis fibrinoid seperti halnya pada kejadian infeksi atau
terinduksi zat kimia.
Hasil ini menunjukkan bahwa probiotik EM4® tidak menggangu aktivitas
ataupun kerja dari organ-organ vital tersebut dan tidak menimbulkan toksisitas pada
struktur jaringan usus, hati dan ginjal. EM4® mampu memberikan pengaruh positif
terhadap kesehatan hewan dengan cara memperbaiki sifat-sifat yang dimiliki mikroba
alami yang ada di dalam tubuh manusia atau hewan tersebut sehingga dapat
mengembalikan keseimbangan rasio antara bakteri patogen dan nonpatogen saluran
pencernaan, sehingga jumlah bakteri non patogen meningkat dengan cepat. Hasil ini
sejalan dengan hasil penelitian yang dilaporkan oleh Zhou et al. (2000), bahwa
pemberian probiotik strain Lactobacillus rhanosus HN001 (DR20TM), Lactobacillus
acidiphilus HN017 dan Bifidobacterium lactis HN019 (DR10TM) pada mencit Balb/c
selama delapan hari secara oral tidak menimbulkan efek pada kondisi kesehatan mencit.
Tidak menimbulkan perubahan struktur morfologi sel-sel lymfonodus, hati, usus dan
ginjal. Selain itu juga tidak ditemukan adanya bakteri yang tumbuh dari isolat darah
yang ditanam pada media agar. Hasil ini ditunjang pula oleh penelitian Lara et al
(2007), yang melaporkan bahwa pemberian probiotik Lactobacillus salivarius strain
CECT5713 pada mencit Balb/c selama 28 hari secara intraperitoneal, didapatkan hasil
bahwa tidak ditemukannya bakteri pada jaringan tymus, ginjal, jantung, hati dan usus.
Secara patologi anatomi juga tidak ditemukan adanya perubahan pada organ-organ
tersebut.
Mekanisme kerja probiotik pada saluran pencernaan berkoloni dengan sel-sel
xxxiv
menguntungkan akan semakin banyak membentuk koloni dan memungkinkan lebih
banyak melakukan perlekatan (adhesion) pada sel-sel enterosit, sehingga berefek pada
meningkatnya barier mukosa usus. Kolonisasi ini juga memperkecil peluang bakteri
patogen untuk melakukan perlekatan dengan sel enterosit. Bakteri yang memperlihatkan
kemampuan berkolonisasi kuat dengan sel-sel epithel usus manusia seperti L. casei, L.
acidophillus, L. plantarum dan sejumlah besar Bifidobacteria (Ouwehand, 1998). Sesuai
dengan hasil penelitian Sukrama (2009), bahwa protein adesin Bifidobacterium sp.
dengan berat 51,74 kDa dapat menghambat adesi Salmonella typhi pada sel enterosit
mencit tidak terjadi invasi oleh Salmonella typhi. Interaksi ini juga menginduksi
pelepasan IL-6 dan IL-10, juga merangsang peningkatan aktivitas sel-sel penghasil
IgA. Peran probiotik lainnya mampu memodulasi respon kekebalan tubuh dengan
merangsang sekresi imunoglobulin A (IgA) pada mukosa usus sehingga berefek pada
peningkatan kekebalan tubuh terhadap infeksi bakteri patogen dalam gastrointestinal
(Klaenhammer, 2001).
Kemampuan lain bakteri asam laktat seperti genus Lactobacillus dalam EM4®
untuk memproduksi senyawa bioaktif yaitu asam laktat dan senyawa antibiotika akan
menekan pertumbuhan mikroorganisme patogen. Sejalan dengan penelitian yang
mengungkapkan asam laktat dengan cepat menyebabkan keasaman yang tinggi dengan
menurunkan pH sampai pH 3-5 sehingga mampu menekan perkembangan bakteri
patogen (Oktaviani, 2004). Senyawa antimikroba yang dihasilkan antara lain hidrogen
peroksida, reuterine, bakteriosin, aldehid, keton, alkohol dan diasetil (Jenie dan Rini,
xxxv
Secara normal di dalam saluran pencernaan dihuni oleh mikroflora normal
yang sering disebut dengan mikroorganisme komensal yang menguntungkan bagi
kesehatan. Mikroflora di dalam saluran pencernaan secara umum dibedakan menjadi
dua yaitu mikroflora transien dan mikroflora residen. Mikroflora transien terdiri atas
organisme yang sangat beragam, bersifat patogen dan non patogen serta tidak mampu
mempertahankan diri dari tekanan-tekanan kompetisi mikroorganisme lainnya.
Sedangkan mikroflora residen adalah mikroorganisme yang bersifat non patogen dan
mampu beraktivitas mempertahankan dirinya dari tekanan-tekanan kompetisi
mikroflora lain (Klaehammer, 2001), dan probiotik EM4® termasuk dalam mikroflora
residen. Peningkatan jumlah bakteri non patogen yang menguntungkan akan
memberikan suasana gastrointestinal lebih sehat sehingga mampu meningkatkan
xxxvi BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Pemberian probiotik EM4® secara oral tidak berpengaruh terhadap gambaran
histopatologi usus, hati dan ginjal tikus putih (Rattus norvegicus).
5.2 Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut penggunaan probiotik EM4® dengan
dosis lebih tinggi dan waktu yang lebih lama dari 28 hari.
2. Probiotik EM4® tidak berbahaya diberikan pada hewan ternak untuk
meningkatkan performa dan kesehatan hewan ternak.
xxxvii
DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, R.Z. 2005. Pemanfaatan Khamir Saccharomyces cerevisae untuk Ternak. Wartazoa Vol. 15 No. I. Hal : 49-55.
Axelson, L.T. 1998. Lactic Acid Bacteria: Classification and Phisiology. In: S. Salminen and A. von Wright (Eds.) Lactic Acid Bacteria. Marcel Decker Inc., New York.
Chiang, S.H. and Hsieh. 1995. Effect of Direct Feed Microorganisms on Broiler Growth Performance and Litter Ammonia Level. Asian-Aus.J.Anim.Sci. 8: 159-162.
Daud, M., W.G. Pilliang dan I.P. Kompiang. 2007. Persentase dan Kualitaskas ayam Pedaging yang diberi Prebiotik dan Probiotik ke dalam Ransum. JITV. Vol. 12 No. 3. Hal: 167-174.
Fuller, R. 1992. Probiotics: The scientific Basis. Chapman and Hall. London
Hall, J.E. 2006. Commensal Bacteria of the GI Tract: Benefits of Probiotic Supplementation. The Nutrition Science. USA. Manatech.
Harper, H.A., V.W. Rodewell, P.A. Moyes and D.K. Granner. 1987. Biokimia (Review Of Biochemistry). Edisi 20. Penrbit Buku Kedokteran EGC Jakarta.
Higa, T and J.F. Parr. 1994. Beneficial and effective Microorganisms for Sustainable Agriculture and Enviroment. International Nature Farming Reseach Centre, Atami, Japan.
Harison. W. G. 2000. Pengantar Patologi Umum. Edisi Ketiga. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta.
Humason, GL. 1972. Animal Tissue Techniques. 3rd. WH. Freeman and Co.
Hussein, FN. 2008. Anesthesia and Euthanasia in Laboratory Animals. Workshop on the Care and Use of Lab An Res. Collaboration Fac. Vet. Med. Airlangga University and Fac. Vet. Med. UPM. Malaysia.
Jawetz, Melnick and Adelberg. 1995. Medical Microbiology. 20/E.
Jenie, S.L., dan S.E. Rini. 1995. Aktivitas Antimikroba dari Beberapa Species Lactobacillus terhadap Mikroba Patogen dan Perusak Makanan. Bul. Teknologi dan Industri Pangan. 7(2):46-51.
Jubb, K. V. F., P. Carletonm., Kennedy. Dan N. V. Palmer. 1985. Pathology of The Domestic Animals. Academic Press INC. Orlando. Florida.
Klaenhammer, T.R. 2001. Probiotics and Prebiotics. In : M. P. Doyle et al. Food Microbiology: Fundamental and Frontiers, 2nd Ed. ASM Press. Washington D.C.
xxxviii
Lara, V., S. Sierra, M.P.D. Ropero, M. Olivares and J. Xaus. 2007. Safety Assesment of the Isolated Probiotic Lactobacillus salivarius CECT5713. Journal of Diary Science. http:jds.fass.org/cgi/content/full/90/8/3583. Tgl akses 22 September 2010.
Mitsuoka, T. 1990. A Profile of Intestinal Bacteria. Yakult Honsha. Co. Ltd. Japan.
Mustchler, E. 1991. Dinamika Obat. Terjemahan: M.B. Widianto dan A.S. Ranti. Penerbit ITB. Bandung.
Oktaviani, D. 2004. Effektivitas Bakteriosin dari Lactobacillus plantarum terhadap Masa Simpan Filet Nila Merah pada Suhu Rendah. Skripsi. Unpad. Jatinangor.
Ouwehand, A.C. 1998. Antimicrobial Component from Lactic Acid Bacteria. In: S. Salminen and A. von Wright (Eds.) Lactic Acid Bacteria. Marcel Decker Inc., New York.
Purnomo, W. dan J. Julaeha. 2006. Pengaruh Pemberian EM Jamu Untuk Itik Gembala Terhadap Produksi dan Bobot Telur. Jurnal Penyuluhan Veteriner. Vol. 1, No. 2.
Price, S. A. dan L. M. C. Wilson. 1995. Pathofisiology : Clinical Concept of Pemeliharaan Kepiting Bakau (Scylla paramamosain). Prosiding Seminar Iptek Kelautan, Hal: IKN 57-60.
Sukaryani, S. 1997. Ragi, Bahan Makanan Ternak Alternatif Berprotein Tinggi. Poultry Indonesia. Nomor 205/Maret 1997, Hal. 15-16.
Sukrama, I D.M. 2009. Protein Adesin Dinding Sel Bifidibacteria sp Berat 57,41 kDa Menghambat Adesi Salmonella typhi Pada Sel Mencit. Disertasi. Universitas Udayana.
Susila, T.G.O., T.J. Putri., N.N.C. Kusumawati dan N.N. Siti. 1998. Penggunaan EM4 (Effective Microorganisms) sebagai Sumber Probiotik pada Ternak Babi yang diberi ransum Mengandung Limbah Hotel. Laporan Penelitian Berbagai Bidang Ilmu. Ditbinlitabmas. Dirjen Dikti, Fapet, Unud, Denpasar.
xxxix
Lingkungan. Laporan Penelitian BBI, Ditbinlitabmas, Dirjen Dikti, Fapet, Unud, Denpasar.
Suwidjayana, I.N. dan I.G.N.G. Bidura. 2000. Khasiat Ragi Tape dan Effective Microorganism Menurunkan Kolesterol dan Lemak Karkas Itik. Laporan Penelitian: Proyek Pengkajian dan Penelitian Ilmu Pengetahuan Terapan, Dirjen Dikti, Departemen P dan K. Univ. Udayana.
Travis, J. 2003. Gut Check : The Bacteria In Your Intestines are Wellcome Guest. Science News. 163(22):344-352.
Wididana, G.N., S.K. Riyatmo, T. Higa. 1996. Teknologi Effective Microorganism. Koperasi Karyawan Departemen Kehutanan. Jakarta.
Wina, E. 2005. Teknologi Pemanfaatan Mikroorganisme Dalam Pakan untuk Meningkatkan Produktivitas Ternak Rumunansia di Indonesia: Sebuah Review. Wartazoa Vol. 15, N0. 4, Hal: 173-186.
