iv
ABSTRAK
UJI SITOTOKSISITAS DAN INDUKSI APOPTOSIS FRAKSI ETIL ASETAT DAUN SIRIH (Piper betle Linn) PADA KULTUR SEL HeLa
Helena,2011, Pembimbing I : Teresa Liliana W., S.Si., M.Kes., Pembimbing II : Laella K. Liana, dr. Sp.PA, M.Kes., Pembimbing III: Tjandrawati, M.Es.Sc.
Neoplasma adalah suatu massa abnormal pada jaringan yang tumbuh tidak terkoordinasi dengan kecepatan melebihi jaringan normal dan dapat menetap walaupun rangsangan pencetus perubahan tersebut telah hilang. Sirih (Piper betle Linn) mempunyai kandungan berupa fenol serta turunannya seperti kavikol yang bersifat antiseptik dan flavonoid. Pada sejumlah tanaman, flavonoid memiliki aktivitas sitotoksik dan induksi apoptosis.
Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui aktivitas sitotoksik dan induksi apoptosis secara in vitro dari fraksi etil asetat daun sirih pada kultur sel HeLa dengan parameter kemampuan membunuh sel karsinoma dan persentase sel yang mengalami apoptosis.
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif eksperimental laboratorium sungguhan yang membentuk grafik hubungan antara konsentrasi sampel dengan presentase kematian sel dan melihat persentase sel yang mengalami apoptosis dengan menggunakan flow cytometer. Hasil pengujian sitotoksisitas fraksi etil asetat daun sirih ditentukan dengan menghitung nilai IC50 yaitu kemampuan untuk membunuh 50% populasi sel dan dari grafik hasil flow cytometer dapat diamati populasi sel HeLa yang mengalami apoptosis pada sub G0/G1.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa uji sitotoksisitas fraksi etil asetat daun sirih memiliki nilai IC50 yang tinggi yaitu 282,389 µg/ml. Hal iini menunjukkan aktivitas sitotoksik fraksi etil asetat daun sirih rendah dalam membunuh 50% populasi sel HeLa sedangkan grafik hasil flow cytometer induksi apoptosis sel HeLa, fraksi etil asetat daun sirih tidak mampu menginduksi apoptosis karena setara dengan sel HeLa yang tidak mendapatkan perlakuan.
v ABSTRACT
CYTOTOXICITY ACTIVITY AND APOPTOSIS INDUCTED
OF ETHYL ACETATE FRACTION OF BETEL LEAF (Piper betle Linn) ON THE CULTURE OF HeLa CELLS
Helena, 2011, Tutor I : Teresa Liliana W., S.Si., M. Kes Tutor I : Laella Liana K., dr. Sp.PA, M. Kes., Tutor III : Tjadrawati, M.Es.Sc
Neoplasm is an abnormal mass of tissue which is increasing in an uncoordinated growth that more than an excess of normal tissue and it may stay persevered yet the stimulus causes of tissue has been vanished. Betel leaf (Piper betle Linn) has a content of phenols and its derivatives, such as chavicol which is containing antiseptic and flavonoid substance. In some plants, flavonoids have a cytotoxic activity and an induction of apoptosis. The purpose of this study is to verify the cytotoxic activity and induction of apoptosis by in vitro of ethyl acetate fraction of betel leaf in HeLa cell culture with parameters of abilities to exterminate carcinoma cell and parameters of the percent of cells in undergoing apoptosis.
This research, by means of a real experimental descriptive laboratory observation, revises the form of making graphic on the relationship between the concentrations of sample - with the percentage of death cells - and intentions of the percent of cells which are undergoing apoptosis by the used of the cytometer’s flow. The results of cytotoxicity’s test of ethyl acetate fraction of betel leaf is firmed by calculating the value of IC50, or the ability to reduce 50% of the population of cells, and is recognized from the graphic of the cytometer’s flow which can be observed that the population of HeLa’s cell undertaking an apoptosis in the sub G0/G1.
The result of cytotoxicity’s test of ethyl acetate fraction of betel leaf gained the high level of IC 50 which is 282.389 µg/ml. This result shows that the cytotoxic activity of ethyl acetate fraction of betel leaf killed less than 50% in the population of HeLa’s cell, whereas the graphic from the result of flow cytometer on the induction of apoptosis of HeLa cells demonstrated that the fraction of ethyl acetate of betel leave was not able to induce apoptosis due to the equivalency of HeLa’s cells which were not undertake.
This research concludes that from ethyl acetate fraction of betel leaf there has no effect of cytotoxic’s activity and it would not be able to induce the apoptosis on HeLa’s cells culture.
viii DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ... i
LEMBAR PERSETUJUAN... ii
SURAT PERNYATAAN... iii
ABSTRAK... iv
ABSTRACT……… v
KATA PENGANTAR……… vi
DAFTAR ISI……….. viii
DAFTAR TABEL... xii
DAFTAR GAMBAR... xiii
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1Latar belakang ... 1
1.2Identifikasi Masalah... 3
1.3Tujuan Penelitian ... 3
1.4Manfaat Penelitian... 3
1.5Kerangka Pemikiran dan Hipotesis... 3
1.5.1 Kerangka Pemikiran... 3
1.5.2 Hipotesis... 4
1.6Metodologi... 5
1.7Lokasi dan Waktu Penelitian ... 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 6
ix
2.1.1 Anatomi Serviks... 6
2.1.2 Histologi Serviks………... 6
2.2 Karsinoma Serviks... 7
2.2.1 Insidensi dan Epidemiologi Karsinoma Serviks ... 7
2.2.2 Faktor Risiko Karsinoma Serviks... 8
2.2.3 Etiologi Karsinoma Serviks…………... 8
2.2.4 Gambaran Klinik Karsinoma Serviks………….……….. 9
2.2.5 Klasifikasi Karsinoma Serviks……….. 10
2.2.6 Patogenesis Karsinoma Serviks………. 12
2.2.7 Terapi Karsinoma Serviks……….. 13
2.2.8 Prognosis Karsinoma Serviks………. 14
2.2.9 Pencegahan Karsinoma Serviks………... 14
2.3 Daun Sirih (P.betle Linn)……….. 15
2.3.1 Morfologi daun sirih……… 15
2.3.2 Komposisi Kimia Daun Sirih………... 16
2.4. Flavonoid……….. 16
2.5. Fraksionasi Daun Sirih………... 17
2.6. Kultur Sel HeLa………. 17
2.7. Uji Sitotoksisitas……… 18
2.8. Induksi Apoptosis………. 19
2.9. Doksorubisin……….. 20
BAB III METODE PENELITIAN... 22
x
3.1.1 Alat-alat yang Diperlukan……….... 22
3.1.2 Bahan yang Diperlukan... 23
3.2 Pemilihan Tanaman……... 23
3.3 Persiapan Penelitan………. 23
3.3.2 Sterilisasi alat………. 23
3.3.2 Pembuatan Medium RPMI 1640……… 24
3.3.3 Pembuatan Medium Pertumbuhan………. 24
3.3.4 Preparasi sel HeLa (24 jam sebelum perlakuan)……… 24
3.4 Metode Penelitian………... 25
3.4.1 Desain Penelitian……….... 25
3.4.2 Variabel Penelitian………. 26
3.4.3 Cara Kerja……….. 26
3.4.3.1 Uji Sitotoksisitas ………... 26
3.4.3.2 Uji Induksi Apoptosis………... 27
3.4.3.3 Cara Penghitungan Sel……….. 28
BAB IV HASIL PENELITIAN dan PEMBAHASAN... 29
4.1 Hasil Penelitian………..………. 29
4.1.1 Hasil Uji Sitotoksisitas Fraksi Etil Asetat Daun Sirih terhadap Kultur Sel HeLa………... 29
4.1.2 Hasil Uji Apoptosis Fraksi Etil Asetat Daun Sirih terhadap Kultur Sel HeLa……….. 33
4.2 Pembahasan……….... 34
BAB V SIMPULAN dan SARAN……….. 36
5.1 Simpulan……... 36
xi
DAFTAR PUSTAKA ………. 37
LAMPIRAN………. 40
xii
DAFTAR TABEL
xiii
DAFTAR GAMBAR
40
Lampiran
Lampiran 1. Data Uji Sitoktosisitas Fraksi Etil Asetat Daun Sirih terhadap Kultur
[image:9.595.164.461.196.374.2]Sel HeLa
Tabel Absorbansi Standar Kultur Sel HeLa
Jumlah sel Absorbansi Rata-rata Absorbansi-Blanko
Blanko 0.19 0.196
0.201
5x104 1.422 1.399 1.203
1.378
2,5x104 1.135 1.147 0.951
1.159
0,5x104 0.471 0.466 0.27
0.461
0,25x104 0.378 0.3605 0.1645
0.343
0,05x104 0.29 0.2465 0.0505
41
42
Lampiran 3. Tabel Absorbansi Kultur Sel HeLa setelah Pemberian Fraksi Etil Asetat Daun Sirih
Jumlah sel Absorbansi Rata-rata
Sampel-Blanko
Jumlah sel x100
Rata-rata Jumlah sel
% sel hidup
Blank 0.19
0,165 0.178
0,178
Kontrol 1.311 1.121 4.1778 100
1.223 1.058 1.075 3.9104 3.994 100
1.223 1.045 3.8553 100
FEDS 1000 µg/mL 0.263 0.073 0.2704 6.472
0.174 0.009 0.022 0.5420 -0.485 13.861 0.162 0.016 0.5123 13.289
FEDS 500 µg/mL 0.637 0.447 1.3171 31.525
0.328 0.163 0.436 0.1116 1.275 2.855 0.875 0.697 2.3782 61.687
FEDS 250 µg/mL 0.339 0.149 0.0522 1.250
1.042 0.877 0.683 3.1422 2.326 80.354
1.2 1.022 3.7576 97.468
FEDS 125 µg/mL 1.443 1.253 4.7381 113.411
43
Lampiran 4. Data Uji Apoptosis Fraksi Etil Asetat Daun Sirih
Normal (I)
Normal (II)
44
Fraksi Etil Asetat Daun Sirih (I)
45
Doxorubisin (I)
46
Lampiran 5. Tabel Hasil Uji Induksi Apoptosis sel HeLa Dibandingkan dengan
Doxorubisin dan Fraksi Etil Asetat Daun Sirih
Tidak diberi perlakuan
Doxorubisin F etil asetat
3.31 35.18 3.52
3.15 34.59 4.1
47
RIWAYAT HIDUP
Nama : Helena
Nomor Pokok Mahasiswa : 0810051
Tempat/ Tanggal Lahir : Bandung, 05 Mei 1989
Agama : Katholik
Alamat : Jl. Setia no 8 Bandung
Riwayat Pendidikan:
SD Santo Yusuf I, Bandung, Lulus Tahun 2002.
SMP Santo Aloysius Sultan Agung, Bandung, Lulus Tahun 2005. SMA Santo Aloysius Sultan Agung, Bandung, Lulus Tahun 2008.
1 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Neoplasma adalah suatu massa abnormal pada jaringan yang tumbuh secara cepat dan tidak terkoordinasi melebihi jaringan normal dan dapat menetap walaupun rangsangan pencetus perubahan tersebut telah hilang (Kumar, 2005). Di dunia, terdapat 500.000 kasus baru kanker serviks dan 250.000 penderita kanker serviks yang meninggal setiap tahunnya. Hampir 80% kasus yang terjadi saat ini, lebih berdampak pada negara-negara miskin yang sulit dalam mendeteksi dini terjadinya kanker serviks (WHO, 2010), sedangkan di Indonesia, hingga saat ini 50 dari 100.000 perempuan terkena kanker serviks (Moh. Joeharno, 2008). Karsinoma serviks menduduki peringkat kedua penyebab kematian pada wanita setelah karsinoma payudara.
Human Papiloma Virus (HPV) dapat menjadi salah satu etiologi dari terjadinya karsinoma serviks pada seorang wanita. Faktor risiko lainnya yang dapat mengakibatkan terjadinya kanker serviks adalah rokok, kontrasepsi oral, imunosupresi pada wanita yang terkena HIV, diet (rendah serat), infeksi Chlamydia, multiparitas, hamil usia muda, obat-obat hormonal seperti
diethylstilbestrol (DES), dan genetik (American Cancer Society, 2010).
2
gejala bahkan menyembuhkan dari kanker dan memberikan efek samping sesedikit mungkin.
Sejak dahulu, masyarakat Indonesia terbiasa menggunakan bahan-bahan dari alam untuk menyembuhkan penyakit. Daun sirih (Piper betle Linn) merupakan salah satu tanaman yang biasa digunakan sebagai pembersih pada alat genitalia eksterna dari wanita (Ike Yuni Sundayarwati, 2005).
Sirih (Piper betle Linn) mempunyai kandungan berupa fenol serta turunannya seperti kavikol yang bersifat antiseptik yang lima kali lebih baik daripada fenol biasa. Sifat antiseptik ini dapat membunuh bakteri sehingga sering digunakan sebagai antibakteri dan antifungi. Eugenol yang juga terdapat pada daun sirih, dapat berperan sebagai antiinflamasi, dimana eugenol dapat menghambat lipoksigenase (LOX), suatu jalur yang akan membuat respons proinflamasi pada suatu peradangan (Pin et al., 2010). Menurut Chang et al., 2002, Rathee et al., 2006 dalam Pin et al., 2010, kandungan hidroksikavikol (HC) yang terkandung dalam daun sirih berperan sebagai antioksidan. Selain HC, sirih juga mengandung beta karoten yang berperan sebagai antioksidan (Nuri Andarwulan, 1996).
Arya Sri Sadono (2008), mengungkapkan bahwa flavonoid yang terdapat pada daun sirih memiliki aktivitas sitotoksik, sehingga dapat digunakan juga sebagai antikanker. Senyawa flavonoid merupakan senyawa polifenol yang dapat digunakan sebagai kemopreventif dan pengobatan untuk kanker, selain itu juga dapat menjadi antioksidan yang menghambat oksidasi LDL, efek anti inflamasi, anti alergi, pemerangkap peroksil, hidroksil, dan radikal bebas superoksida. Selain itu, flavonoid juga dapat menginduksi apoptosis dari beberapa cancer cell line. Tetapi mekanisme induksi apoptosis dari senyawa flavonoid ini masih belum diketahui (Ren, 2003).
3
1.2 Identifikasi masalah
Berdasarkan latar belakang tersebut, maka dapat dirumuskan beberapa pertanyaan sebagai berikut:
Apakah fraksi etil asetat daun sirih memiliki aktivitas sitotoksik secara in vitro pada kultur sel HeLa
Apakah fraksi etil asetat daun sirih memiliki aktivitas induksi apoptosis secara in vitro pada kultur sel HeLa
1.3 Tujuan Penelitian
Mengetahui aktivitas sitotoksik secara in vitro dari fraksi etil asetat daun sirih pada kultur sel HeLa dengan parameter kemampuan membunuh sel karsinoma (Inhibitory Concentration (IC50)).
Mengetahui aktivitas induksi apoptosis secara in vitro dari fraksi etil asetat daun sirih pada kultur sel HeLa dengan parameter persentase (%) sel yang mengalami apoptosis dibandingkan dengan doksorubisin.
1.4 Manfaat Penelitian
Mengetahui potensi daun sirih dalam menghambat karsinogenesis karsinoma serviks.
1.5 Kerangka Pemikiran dan Hipotesis
1.5.1 Kerangka Pemikiran
4
pertumbuhan sel kanker berbeda dengan sel normal. Saat sel normal mati, sel kanker akan tetap tumbuh dan akan terus membentuk sel kanker yang baru. Sel kanker yang tumbuh dapat menginvasi ke jaringan dan bersifat sulit dikendalikan (America Cancer Society, 2010).
Sel HeLa merupakan continous cell line yang diturunkan dari sel epitel kanker serviks seorang wanita penderita kanker serviks bernama Henrietta Lacks yang meninggal pada tahun 1951. Sel HeLa berasal dari sel serviks yang terinfeksi oleh HPV tipe 18. Sel ini mengekspresikan onkogen, yaitu protein E6 dan E7 yang terbukti dapat menyebabkan sifat imortal pada kultur primer keratinosit manusia (Andrea Thea Rosita, 2009).
Daun sirih (Piper betle Linn) memiliki berbagai macam kandungan seperti fenol, kavikol, eugenol, hidroksikavikol, beta karoten dan flavonoid yang bersifat sebagai antiseptik dan antioksidan. Beberapa penelitian mengatakan bahwa senyawa flavanoid dapat berefek sitotoksik yang dapat digunakan sebagai antikanker (Setiawan Dalimartha, 2008). Oleh sebab itu, peneliti ingin meneliti apakah senyawa dalam daun sirih (Piper betle Linn) dapat memberikan efek antikanker pada karsinoma serviks .
1.5.2 Hipotesis
Fraksi etil asetat daun sirih memiliki aktivitas sitotoksik secara in vitro pada kultur sel HeLa.
5
1.6 Metodologi
Metodologi penelitian ini adalah deskriptif eksperimental laboratorium. Untuk mengetahui aktivitas sitotoksik dan induksi apoptosis fraksi etil asetat daun sirih (Piper betle Linn) pada sel HeLa, maka dilakukan uji dengan parameter kemampuan membunuh sel karsinoma (IC50) dan persentase (%) sel yang mengalami apoptosis.
1.7 Lokasi dan Waktu Penelitian
36 BAB V
SIMPULAN DAN SARAN
5.1Simpulan
Fraksi etil asetat daun sirih tidak memiliki aktivitas sitotoksik pada kultur sel HeLa.
Fraksi etil asetat daun sirih tidak menginduksi apoptosis pada kultur sel HeLa.
5.2Saran
Perlu penelitian uji sitotoksisitas membunuh sel kanker IC50 dengan menggunakan ekstrak etanol dan fraksi –fraksi lain selain etil asetat.
37
DAFTAR PUSTAKA
American Cancer Society. 2010. What is Cancer?
http://www.cancer.org/Cancer/CervicalCancer/OverviewGuide/cervical-cancer-overview-what-is-cancer. 8 Januari 2011.
Andrea Thea Rosita, Titi Ratna Wijayanti, Esti Widayanti dan Adam Hermawan. 2009. Sel HeLa.
http://ccrcfarmasiugm.wordpress.com/ensiklopedia/ensiklopedia-kanker/sel-hela/ 12 januari 2011
Arya Srisadono. 2008. Skrining awal ekstrak etanol daun sirih (Piper betle Linn) sebagai antikanker dengan metolde Brine Shrimp Lethality Test (BLT). Fakultas Kedokteran Diponegoro. Semarang.
http://www.linkpdf.com/ebookviewer.php?url=http://eprints.undip.ac.id/241 78/1/Arya.pdf 5 Januari 2011
Bidus, M.A, Elkas, J.C. 2007. Cervical and Vaginal Cancer In JS Berek:
Berek&Novak’s Gynecology 14th
ed.Lippincot Williams & Wilkins
Brawley, Otis W. 2008. Prevention and Early Detection of Cancer in Harrison’s Principles of Internal Medicine.17th ed. United States : McGraw Hill.
Cha et all . 2003. Cervical Cancer and Microchimerism.
Drake, Richard L, Vogl, W, Mitchell, Adam W.M. 2005. Gray’s Anatomy for Students. Philadelphia : Saunders Elsevier.
Freshney, R.I. 2000. Cell line.In:Cultures of Animal Cells a Manual of Basic Technique. 4th .Canada:Wiley Liss, Inc.p177-182, 309-312, 329, 325.
Gartner, Leslie P ,Hiatt, James L. 2007. Color Textbook of Histology. Third Edition. Philadelphia : Saunders Elsevier.
Ike Yuni Sundayarwati. 2005. Daya Antiseptik Berbagai Merek dan Konsentrasi Sabun Cair Sirih terhadap Candida albicans secara in vitro. http://student-research.umm.ac.id/index.php/dept_of_biology/article/view/5854. 8 Januari 2011.
Kuang TH, Yen HC, Walker AM. 2004. Inaccuracies in MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids.
BioTechniques 37:406-412.
38
Mackenzie. G. G., Carrasquedo. F., Delfino. J. M., Keen. C. L., Fraga. C. G., Oteiza. P. I. 2003. Epicatechin, Catechin, and Dimeric Procyanidins Inhibit PMA-Induced NF-κB Activation at Multiple Steps in Jurkat T Cells. The FASEB Journal express article
Mans, D.R , Rocha, A.B, and Schwartsmann,G. 2000. Anti-cancer drug discovery and development in Brazil: Targeted plant collection as a national strategy to acquire candidate anti-cancer. compounds, Oncologist, 5, 185-198. Moh. Joeharno. 2008.Analisis Faktor Risiko Kejadian Kanker Serviks.
http://blogjoeharno.blogspot.com/2008/04/analisis-faktor-risiko-kejadian-kanker.html . 4 Januari 2011.
Nafrialdi, Sulistia Gan. 1995. Antikanker dan Imunosupresan dalam Farmakologi dan Terapi FK UI. Edisi 4. Jakarta : Gaya Baru.
Nuri Andarwulan. 1996. Karaterisasi Antioksidan Alami dari Daun sirih(Piper bettle L): Pemisahan Komponen dalam Oleoresin Daun Sirih dengan Kromatografi Lapis Tipis.BuL Tek dan Industri Pangan Vol.VII.No.I.hal 75-8http://jurnal.pdii.lipi.go.id/admin/jurnal/71967578.pdf. 15 April 2011 Pin KY, Chuah AL, Rashih AA, Mazura MP, Fadzureena J, Vimalai S , Rasadah
MA. 2010. Antioxidant and Anti Inflammatory Activities of Extracts of Betel Leaves (Piper betle) Form Solvents with Different Polarities. Journal of Tropical Forest Science 22(4): 448-55.
http://info.frim.gov.my/cfdocs/infocenter/Korporat/2003Publications/Links/ JTFS22(4)/15.%20KY%20Pin.pdf .16 Januari 2011
Rabinovicth P. 2010. Introduction To Cell Cycle Analysis. San Diego:Phoenix Flow Systems, Inc.
Reichman, Richard C. 2008. Human Papilloma Virus Infections in Harrison’s Principles of Internal Medicine.17th ed. United States : McGraw Hill.
Rini Damayanti Moeljanto. 2003. Khasiat & Manfaat Daun Sirih. Jakarta : PT Agromedia Pustaka. Hlm 7-16.
Schorge, J.O. 2008. Section 4 Gynecologic Oncology Chapter 30 Cervical Cancer In Williams Gynecology.Mc Graw Hill-Companies.p1285-322
Setiawan Dalimartha. 2008. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia. Jilid 4. Jakarta : Puspa Swara. Hlm 86-90.
39
Sukardiman, Wiwied Ekasari, Pharmasinta Putri Hapsari.2006. Aktivitas Antikanker dan Induksi Apoptosis Fraksi Kloroform Daun Pepaya (Carica papaya L) terhadap Kultur Sel Kanker Mieloma : Media Kedokteran Hewan.Volume 22.Media Kedokteran Hewan.hal 104-111.
Williamson. G., Manach. C. 2005. Dietary Polyphenols and Health: Proceedings of the 1st International Conference on Pholyphenols and Healt. Vol. 81. American Society for Clinical Nutrition.No. 1,pp 243S-255S
World Health Organization. 2010. Global Health Observatory.
http://www.who.int/gho/women_and_health/diseases_risk_factors/situation _trends_cancer/en/index.html. 8 Januari 2011.
