BAB I PENDAHULUAN
I.1. Latar Belakang
Mikroorganisme merupakan makhluk hidup yang sangat kecil dan penting untuk menjaga keseimbangan ekologi dan ekosistem di bumi. Terdapat berbagai mikroorganisme yang menguntungkan dan merugikan bagi manusia. Mikroorganisme yang menguntungkan bagi manusia seperti yeast atau ragi adalah contoh sederhana yang berasal dari mikroorganisme yang dapat di olah dalam bidang makanan, namun banyak pula berbagai mikroorganisme yang merugikan bahkan menimbulkan penyakit bagi manusia atau bersifat patogen seperti contohnya Mycobacterium tuberculosis yang menyebabkan penyakit TBC pada manusia. Oleh karena itu penting sekali untuk mengetahui berbagai peranan mikroorganisme bagi kehidupan dengan cara meneliti tentang perbiakan mikroorganisme tersebut seperti contohnya mengambil sampel mikroba lalu menguji dan meneliti mikroba tersebut di laboratorium untuk mengetahui sifat-sifatnya.
Setiap mikroba yang akan di teliti di laboratorium memerlukan wadah atau media (perbenihan) untuk meletakkan mikroba tersebut, selanjutnya mikroba di isolasi dan dilakukan pengujian sifat-sifat fisiologi dan biokimia mikroba tersebut. Media yang diperlukan ini harus sesuai dengan kebutuhan metabolisme mikroba agar mikroba tetap hidup dan dapat di amati. Kebutuhan mikroba yang paling mendasar adalah nutrisi, nutrisi baik mikroelemen maupun makroelemen ini harus terkandung dalam media, selain itu pengaruh lingkungan pula harus sesuai baik suhu, tekanan, dan pH.
Dalam membiakkan mikroba di suatu media, terlebih dahulu media tersebut harus steril, yaitu tidak ada nya organisme lain selain mikroba yang akan di isolasi dengan cara memusnahkannya terlebih dahulu. Hal ini dilakukan supaya media terbebas dari mikroba pengganggu (mikroba kontaminan) yang dapat mengganggu kelangsungan hidup mikroba yang akan di isolasi. Proses untuk mensterilkan media ini disebut dengan sterilisasi yang dapat dilakukan dengan berbagai macam cara.
I.2. Tujuan Praktikum
1. Memilih dan menentukan jenis perbenihan yang sesuai untuk suatu uji.
2. Membuat beberapa perbenihan dasar yang digunakan dalam praktek mikrobiologi berupa media padat, cair dan semisolid.
3. Melakukan sterilisasi alat dan media dengan sterilisasi panas lembab menggunakan autoklaf dan panas kering menggunakan oven.
4. Melakukan uji sterilitas terhadap media-media yang telah disterilkan untuk memastikan bahwa media tersebut telah steril.
I.3. Manfaat Praktikum
BAB II STUDI PUSTAKA
II.1. Media Perbenihan
Media perbenihan adalah media nutrisi yang disiapkan untuk menumbuhkan bakteri di dalam skala laboratorium. Beberapa bakteri dapat tumbuh dengan baik pada setiap media perbenihan, sedangkan yang lain membutuhkan media khusus. Media perbenihan yang cukup baik harus dapat menyediakan dan menjadi sumber energi yang dibutuhkan oleh mikroorganisme dengan mengandung berbagai senyawa seperti karbon, nitrogen, sulfur, fosfor, dan faktor pertumbuhan organik.
Media perbenihan harus memenuhi persyaratan sebagai berikut :
1. Harus mengandung nutrisi yang tepat untuk bakteri spesifik yang akan dibiakkan 2. Kelembapan harus cukup, pH sesuai, dan kadar oksigen yang cukup baik.
3. Media perbenihan harus steril dan tidak mengandung mikroorganisme lain yang dapat mengganggu kondisi pada saat pembiakkan, mikroorganisme ini di sebut sebagia mikroorganisme kontaminan.
4. Media diinkubasi pada suhu tertentu. (Pratiwi T., Sylvia. 2008)
A. Media pertumbuhan mikroorganisme berdasarkan konsistensinya
Berdasarkan konsistensinya, media dikelompokkan menjadi dua macam yaitu media cair (liquid media) dan media padat (solid media). Apabila media cair yang merupakan ekstrak kompleks material biologis, maka media tersebut disebut rich media atau broth, sedangkan media padat adalah media yang menggunakan bahan pembeku (solidifying agent), contohnya Agar. Agar merupakan agen pengeras yang sangat bagus karena tidak dapt didegadrasi oleh mikroorganisme. (Pratiwi T., Sylvia. 2008)
B. Media berdasarkan komposisi bahan media atau kandungannya
Menurut kandungan nutrisinya, media dapat dibedakan menjadi beberapa macam. 1. Defined media (synthetic media)
Defined media merupakan media yang komponen penyusunnya sudah diketahui atau ditentukan dan digunakan dalam penelitian untuk mengetahui kebutuhan nutrisi mikroorganisme. (Pratiwi T., Sylvia. 2008)
2. Media kompleks (complex media)
Media kompleks merupakan media yang tersusun dari komponen yang secara kimia tidak diketahui dan umumnya diperlukan karena kebutuhan nutrisi mikroorganisme tertentu tidak diketahui. Contoh: Nutrient Broth/Agar, Tryptic Soya Broth (TSB)/Trypic Soya Agar (TSA). (Pratiwi T., Sylvia. 2008)
3. Media umum (general media)
4. Media penyubur (enrichment media)
Media penyubur merupakan media yang berguna untuk mempercepat pertumbuhan mikroorganisme tertentu. Media ini menggunakan bahan atau zat serupa dengan habitat tempat mengisolasi mikrooganisme tersebut. (Pratiwi T., Sylvia. 2008)
5. Media selektif (selective media)
Media selektif merupakan media yang mendukung pertumbuhan oraginsme tertentu (seleksi) dengan menghambat pertumbuhan mikrooganisme yang lain (mikroorganisme kontaminan). Contoh penghambat bile salt dan dye (fuchsin, crystal violet, brilliant green) yang menghambat bakteri Gram-positif dan tidak memberi efek pada bakteri Gram-negatif. (Pratiwi T., Sylvia. 2008)
6. Media diferensial (differintial media)
Media diferensial digunakan untuk membedakan kelompok mikroorganisme dan bahkan dapat digunakan untuk identifikasi. Contoh media Agar Darah, membedakan antara bakteri hemolitik (Steptococcus dan Staphylococcus saluran napas) dan bakterik nonhemolitik (Pratiwi T., Sylvia. 2008)
7. Media khusus
Contoh media khusus adalah media untuk bakteri anaerob.. Contoh bahan-bahan itu adalah natioglikolat, sistein, asam askorbat. (Pratiwi T., Sylvia. 2008) II.2. Teknik Sterilisasi
Sterilisasi merupakan salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk memusnahkan mikroorganisme yang terdapat dalam suatu alat. Agen kimia untuk sterilisasi disebut stetilant. Istilah lain yang umum dikenal adalah desinfeksi, yang merupakan proses pembunuhan mikroorganisme yang dapat menyebabkan penyakit. Agen desinfeksi disebut desinfektan, yang biasanya berupa zat kimiawi. Beberapa faktor yang mempengaruhi efektivitas sterilisasi adalah sebagi berikut.
a) Jumlah mikroorganisme. Semakin banyak jumlah mikroorganisme maka semakin lama waktu yang dibutuhkan dalam proses sterilisasi.
b) Konsentrasi senyawa antimikroba. Makin tinggi konsentrasi agen penghilang mikroba, makin banyak mikroorganisme yang dimatikan.
c) Temperatur. Peningkatan temperatur dapat meningkatkan aktivitas gen antimikroba. (J. Pelczar, Micheal. 1988)
Teknik sterilisasi di bagi menjadi dua, yaitu metode fisik dan metode kimia. Metode sterilisasi fisik dapat dilakukan dengan cara panas maupun panas basah, radiasi, dan filtrasi, sedangkan metode sterilisasi kimia dilakukan dengan menggunakan bahan-bahan kimia. Berikut beberapa penjelasan mengenai teknik sterilisasi yang dilakukan dalam praktikum mikrobiologi.
A. Metode sterilisasi fisik
Metode sterilisasi yang paling banyak dilakukan adalah metode sterilisasi panas. Metode ini digunakan untuk bahan yang tahan panas. Metode dengan penggunaan uap air disebut metode sterilisasi panas kering atau sterilisasi basah, sedangkan metode sterilisasi panas tanpa uap air disebut metode sterilisasi panas kering atau sterilisasi panas kering.
Metode ini tidak menggunakan air dalam prosesnya, hanya berupa suhu tinggi, hal ini berfungsi untuk mematikan organisme dengan cara mengoksidasi komponen sel atau dengan mendenaturasi (merusak) enzim mikroorganisme tersebut. Metode ini hanya dapat digunakan untuk bahan yang terbuat selain dari karet atau plastik. Ada dua metode sterilisasi panas kering yaitu insinerasi, yaitu dengan pembakaran dengan menggunakan api dari Bunsen dengan temperatur sekitar 350°C, dan dengan udara panas oven yang lebih sederhana dengan pemanasan temperatur sekitar 160-170°C selama 2 jam. (Pratiwi T., Sylvia. 2008)
2. Sterilisasi panas basah
Metode ini dilakukan dengan perebusan menggunakan air mendidih 100°C selama 10 menit, efektif untuk sel-sel vegetatif dan spora eukariot, namun tidak untuk endospora bakteri. Sterilisasi panas basah menggunakan temperatur di atas 100°C dilakukan dengan menggunakan autoklaf. Prinsip autoklaf adalah terjadinya koagulasi yang lebih cepat dalam keadaan basah dibandingkan dalam keadaan kering. Proses ini dapat membunuh mikroorganisme dengan cara mendenaturasi atau mengkoagulasi protein pada enzim dan membran sel mikroorganisme. Proses ini dapat pula membunuh endospora bakteri. (Pratiwi T., Sylvia. 2008)
B. Metode sterilisasi kimia
BAB III
METODE PENELITIAN
III.1. Alat dan Bahan
Alat yang digunakan untuk membuat media pertumbuhan (perbenihan) antara lain adalah tabung-tabung reaksi bersih, cawan Petri bersih, gelas ukur, labu Erlenmeyer, gelas kimia, pipet volume, pembakar spiritus, rak tabung, kapas, kertas kraft, benang kasur, autoklaf, dan oven. Bahan yang digunakan adalah air suling (aquadest), perbenihan kaldu pepton, dan perbenihan Nutrien Agar (NA) sebagai media dasar.
III.2. Cara Kerja
A. Membuat Perbenihan
Untuk membuat perbenihan, baik perbenihan padat maupun cair dapat dilakukan dengan menempatkan serbuk Nutrien Agar merk Difco sebanyak 50 gram ke dalam wadah yang sesuai, kemudian ditambahkan 25 mL air suling dari 50 mL dan dicampurkan. Jika perlu, perbenihan yang telah mengandung Agar didiamkan terlebih dahulu kira-kira selama 5 menit lalu dimasukkan sisa air suling 25 mL. Setelah itu dipanaskan hingga mendidih selama 1-2 menit. Di ukur pH media tersebut sampai pH yang diperlukan tercapai lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer atau botol dan di tutup dengan kapas, setelah itu disterilkan.
Setelah masing-masing media dilarutkan dalam pelarut yang sesuai dengan jumlah yang diperlukan lalu di buat beberapa perbenihan sebagai berikut:
a. Perbenihan cair (Kaldu Pepton), dengan cara memasukkan kaldu pepton sebanyak mL ke dalam tabung reaksi yang bersih dan tabung di tutup menggunakan kapas, kemudian dilakukan sterilisasi akhir dengan menggunakan autoklaf. b. Perbenihan Agar tegak, dengan cara memasukkan Nutrien Agar cair hangat sebanyak
5 mL ke dalam tabung reaksi bersih dan di beri sumbat kapas, kemudian dilakukan sterilisasi akhir dengan menggunakan autoklaf. Setelah steril tabung Agar di keluarkan dari autoklaf dan tabung diletakkan pada rak tabung dengan posisi tegak hingga Agar memadat.
c. Perbenihan Agar miring, dengan cara memasukkan Nutrien Agar cair hangat sebanyak 5 mL ke dalam tabung reaksi bersih dan di beri sumbat kapas, kemudian dilakukan sterilisasi akhir dengan menggunakan autoklaf. Setelah steril tabung Agar di keluarkan dari autoklaf dan tabung diletakkan pada suatu penyangga dengan posisi miring sekitar 30° hingga Agar memadat.
d. Perbenihan Agar lempeng, dengan cara aseptik dipindahkan Nutrien Agar cair yang telah disterilkan sebelumnya sebanyak 15-20 mL dan dituangkan ke dalam cawan petri yang juga telah disterilkan sebelumnya. Cawan petri di tutup dan dibiarkan Agar hingga memadat.
B. Sterilisasi
Teknik sterilisasi yang dilakukan adalah sterilisasi dengan menggunakan autoklaf dan menggunakan oven.
keranjang untuk disterilisasi. Tabung yang berisi media cair serta media agar (untuk agar tegak dan agar miring) di tutup dengan kapas dan di lapisi dengan kertas lalu di ikat dengan benang, kemudian ditempatkan pada rak tabung atau bejana yang sesuai. Alat-alat gelas non-volumetrik seperti cawan petri dan tabung reaksi yang telah di cuci bersih di beri sumbat kapas lalu di bungkus dengan kertas dan di ikat dengan benang kasur kemudian ditempatkan dalam keranjang untuk disterilisasi menggunakan autoklaf bersamaan dengan media yang kan disterilisasi. Dinyalakan autoklaf yang telah berisi media dan alat kemudian disterilisasi selama 15-20 menit pada kisaran suhu 121°C dengan tekanan 15 lb/inci2.
BAB IV
HASIL dan PEMBAHASAN
Hasil pengamatan secara fisik pada pembuatan beberapa media dan sterilisasi terdapat pada tabel di bawah ini.
Nama Media Bentuk Sifat Fisik Hasil Uji Sterilitas
media (+/-) Kaldu Pepton Perbenihan cair Jernih, berwarna kuning
muda
-Agar tegak Jernih berwarna krem
-Nutrien Agar Agar miring Jernih berwarna krem
-Agar lempeng Jernih berwarna krem
-Keterangan:
a. Tanda (+) berarti terdapat mikroba, tanda (-) berarti tidak terdapat mikroba. b. Adanya pertumbuhan mikroba pada media cair ditandai dengan terbentuknya
kekeruhan ataupun partikel yang mengendap dan mengapung.
c. Adanya pertumbuhan mikroba pada media Agar ditandai dengan tumbuhnya koloni mikrba pada permukaan Agar.
d. Gambar berbagai media tercantum pada halaman lampiran.
Kaldu pepton, Nutrien Agar dengan bentuk tegak, miring dan lempeng merupakan beberapa contoh dari media perbenihan mikroorganisme. Pada percobaan ini media yang berdasarkan konsistensinya berupa media cair (liquid media) adalah kaldu pepton sedangkan berupa media padat (solid media) adalah Nutrien Agar dengan bentuk tegak, miring, dan lempeng. Berdasarkan kandungan nutrisinya media Nutrien Agar dan kaldu pepton termasuk ke dalam media kompleks karena tersusun dari komponen kimia yang diperlukan sebagai bahan dasar nutrisi mikroorganisme.
Berdasarkan hasil pengamatan terlihat bahwa perbenihan cair kaldu pepton berwarna kuning jernih dan tidak ada partikel yang keruh ataupun endapan, hal ini membuktikan bahwa media telah steril dari mikroba. Demikian pula dengan Nutrien Agar bentuk tegak, miring, dan lempeng yang menunjukkan warna asli dari media tersebut dan tidak ada keruhan atau gumpalan, membuktikan bahwa media telah steril dan tidak mengandung mikroba. Proses sterilisasi berbagai media perbenihan ini adalah dengan metode sterilisasi fisik panas kering, yaitu menggunakan autoklaf karena dengan teknik ini tidak merusak kandungan atau komposisi dalam media perbenihan sehingga nutrisi dalam media tidak berkurang. Media-media yang ingin disterilkan harus di bungkus terlebih dahulu dinding permukaannya dengan kertas dan di tutup dengan kapas untuk mulut tabung reaksi, hal ini dilakukan agar mencegah terbentuknya uap air pada dinding luar dan bagian dalam media. Rongga-rongga dalam autoklaf sebaiknya tidak di isi terlalu penuh dengan wadah-wadah media supaya uap dapat mengalir dengan baik.
BAB V KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
