TUGAS
LAB DASAR
Aglutinasi, Presipitasi, dan
Immunoassay
PROGRAM S2 BIOMEDIK ILMU KESEHATAN DASAR
2018
IMMUNOASSAY
Immunoassay adalah suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau kadar antibodi dan antigen dalam cairan tubuh atau serum seseorang. Immunoassay dapat dibagi menjadi 2 kelompok menurut jenisnya, yaitu immunoassay tak berlabel dan immunoassay berlabel. Immunoassay tak berlabel terdiri dari beberapa teknik, yaitu : uji presipitasi, uji aglutinasi, uji hemaglutinasi, lisis imun dan fiksasi komplemen, serta uji netralisasi. Sedangkan immunoassay berlabel juga terdiri dari beberapa teknik yaitu : asai berlabel fluoresens (Fluorescent Immunoassay atau FIA), asai berlabel radioisotop (Radioimmunoassay atau RIA), asai berlabel luminescent (Luminescent Immunoassay atau LIA), asai berlabel enzim (Enzyme Immunoassay atau EIA), Immunochromatographic Assay atau ICA dan uji imunoperoksidase.
Enzyme immunoassay (EIA) adalah tes untuk mendeteksi antigen atau antibodi dengan penambahan enzim yang dapat mengkatalisa substrat sehingga terjadi perubahan warna. Metode EIA menggunakan sifat katalisa dari enzim untuk mendeteksi dan menghitung jumlah reaksi imunologi. Gabungan antibodi berlabel enzim atau antigen berlabel enzim digunakan pada pemeriksaan imunologi. Enzim dan substratnya mendeteksi keberadaan dan jumlah antigen atau antibodi yang terdapat pada sampel pasien.
Untuk dapat digunakan pada EIA, enzim harus memenuhi kriteria : Stabilitas tinggi
Spesifitas tinggi
Tidak mengandung antigen atau antibody
Tidak ada perubahan oleh inhibitor dalam sistem
System imunoassay dapat dilakukan (diformat) dalam dua sistem, yaitu sistem heterogen yang memerlukan pemisahan dan sistem homogen yang tidak memerlukan pemisahan reaktan setelah reaksi terjadi.
assay kompetitif dan non kompetitif, system terakhir ini prinsip dasarnya sama dengan prinsip peran substrat-inhibitor dalam reaksi enzimatik.
Immunoassay adalah tes atau uji yang digunakan untuk mengukur adanya antigen atau antibodi pada sampel (spesimen bilogikal). Immunoassay dapat digunakan mendeteksi analyte yang ingin diukur. Analyte merupakan sesuatu yg diukur dengan tes laboratorium dapat berupa Ag atau Ab dalam serum. Tujuan immunoassay adalah untuk mendiagnosa suatu penyakit, mengukur aktivitas komponen imun dalam tubuh (komplemen, fagositosis, dst)
Prinsip immunoassay adalah reaksi ikatan spesifik Ab-Ag yang membentuk kompleks Ag-Ab. Untuk deteksi Antigen digunakan Antibodi (monoklonal ataupun polikonal ) sehingga membentuk kompleks Imun (Ag-Ab). Kompleks imun dapat diukur secara kualitatif atau kuantitatif.
Serology merupakan metode untuk mendeteksi dan mengukur titer antibodi dalam serum darah dengan menambahkan Ag spesifiknya. Terdapat 2 tipe Antibodi yang digunakan dlm immunoassay: poliklonal dan monoclonal.
Sampel antibody polikonal yang diuji dapat berasal dari : Antigen sample terinfeksi oleh patogen yang dicurigai maka pada serumnya akan mengandung Ab terhadap patogen tsb. Pengujian Ab pada darah setidaknya terdeteksi 2 minggu seteah infeksi awal.
Spesifisitas Antibodi Valensi Antibodi Aviditas Antibodi Ukuran Kuantitas reaksi Ag-Ab: a. Spesifisitas Antibodi
Ikatan Ag-Ab -- spesifik -- key-lock
Namun terkadang terjadi reaksi silang Ab berikatan dengan Ag lain yg memiliki struktur mirip, itu terjadi jika kemurnian Ag rendah dan Ab yang sangat spesifik yang memiliki binding site yang hanya dimiliki oleh Ag dg struktur molekul yang unik. Spesifisitas Ag-Ab dipengaruhi :
1. Spesifisitas Ab yang ditambahkan pd sampel
2. Kemurnian Ag (tidak ada Ag lain yg mengkontaminasi) b. Valensi Antibodi
Jumlah binding site yang potensial dari Ab terhadap Ag yang spesifik. c. Aviditas Antibodi
Ukuran kekuatan Ab untuk mengikat Ag. Ab dengan Aviditas besar mempunyai kecenderungan mengikat Ag yang banyak. Aviditas merupakan refleksi afinitas (besarnya daya ikat) dan jumlah binding site(valensi).
d. Ukuran Kuantitas Reaksi Ag-Ab
Derajat imunitas, kadar Antibodi atau bahan tertentu dalam serum harus dapat diukur dan dinyatakan dalam suatu satuan/ unit tertentu.
Beberapa cara penentuan : 1. Kualitatif :
ada atau tidak adanya suatu bahan, baik Ab atau Ag dalam serum (uji + atau - ). Contoh : presipitasi pada uji VDRL, perubahan warna pada penentuan Hbs Ag 2. Semikuantitatif :
kadar Ab atau Ag pada serum yaitu dengan cara pengenceran serum secara progresif. Kuantitas Ab dinyatakan dalam titer.
3. Kuantitatif :
kadar Ab ditentukan dengan membuat kurva baku standar terlebih dahulu terhadap kekeruhan (OD) sehingga didapat nilai korelasi.
Contoh: ELISA Macam-macam Immunoassay
Terdapat beberapa metode yang digunakan utk mendeteksi Ag-Ab, antara lain :
Immunoassay tak berlabel : a. Uji Presipitasi
Berlabel Flouresens Berlabel Radioisotop Luminescent Assay (LIA) Berlabel Enzim Immunoasay tak berlabel
a. Uji presipitasi
Bila suatu Ag terlarut bereaksi dengan Abnya. Beberapa macam cara/ uji presipitas yang sering dipakai :
1. Uji presipitasi lempeng/ slide contoh : uji VDRL mikro 2. Uji presipitasi tabung
3. Uji presipitasi tabung kapiler. Contoh : uji CRP
4. Uji presipitasi cincin -- terbentuk cincin presipitasi (uji +) 5.Imunoelektroforesis prinsip sama dengan elektroforesis. b. Uji Aglutinasi
Reaksi antara Ab-Ag seluler atau Ag permukaan sel. Macam-macam uji Aglutinasi :
2. Uji Aglutinasi tabung - Dipakai jika aglutinasi berlangsung lambat
3. Uji Hambatan Aglutinasi – digunakan utk menentukan Ag larut yg tidak diketahui identitasnya.
Contoh : uji konfirmasi RPHA (Reverse Passive Hemagglutination Test) utk penentuan HBs Ag.
c. Uji Hemaglutinasi
Merupakan Uji Aglutinasi dari sel darah merah. Sel darah diaglutinasikan karena antigen yang ada pada darah dapat mendeteksi Ab terhadap antigen sel darah merah. Sel darah merah yang diuji merupakan Ag pada tes aglutinasi.
Contoh : uji penentuan golongan darah. Jika darah memiliki Ag bergolongan A, aglutinasi jika dengan keberadaan Ab terhadap Ag golongan A.
d. Lisis imun dan Fiksasi Komponen
Kompleks imun tidak selalu terjadi antara Abx terhadap Ag pada permukaan sel. Kompleks imun baru terbentuk jika ditambahkan antiimunoglobulin/ Ab terhadap Abx. Sebagai ganti anti-imunoglobulin yaitu komplemen menyebabkan terjadinya lisis sel.
Macam uji lisis imun : Uji Fiksasi Komplemen
Immunoassay berlabel 1. Berlabel fluorescent
Uji immunoflourescent (IFA) merupakan ikatan/ kompleks Ag-Ab divisualisasikan dengan adanya perpendaran flouresen dibawah mikroskop.
Immunoflourecent :
1. Direct immunoflourescent : Ab dilabel dg marker fluorescent. Ab secara langsung diberikan pada jaringan yg diinginkan
2. In-direct immunofluorescent: Menggunakan Ab yg tidak berlabel terhadap Ag yg diuji dengan Ab sekunder yang berlabel (yang berikatan spesifik dengan Ab pertama). Semakin banyak ikatan Ab sekunder maka sinyal floresen semakin meningkat.
uji laboratoris yang sensitive yang digunakan untuk penentuan kadar beberapa bahan (hormon). Diperlukan sampel dengan bahan yang sedikit sudah dapat terdeteksi. Contoh : Uji RIA (Radioimmunoassay). Pelabelan dengan Radioisotop yg dipakai pada uji RIA : 3H, 14C, 57Co, 75Se, 125I, 131I
3. Berlabel luminescent
Uji immunoluminescent (LIA) prinsip sama dengan RIA dan IFA, hanya pada LIA label pada reaksi Ag-Ab menggunakan luminescent
4. Berlabel enzim
Pemberian label enzim pada Ag (ELISA). Menggunakan enzim (ligan) yang membuat produk reaksi berwarna (chromogen) – intensitas warna menunjukkan jumlah Ag yang ada dalam sampel. Enzyme : horseradish peroxidase, phosphatase.
PRESIPITASI
Presipitasi adalah hasil kombinasi antara antigen terlarut dengan antibodi terlarut menghasilkan suatu komplek yang terlihat. Pada prinsipnya reaksi presipitasi adalah reaksi antara antigen (larut) dengan antibodi (pasti larut), menghasilkan suatu agregat yang terlihat dengan mata telanjang.
Presipitation merupakan salah satu metode sederhana yang mendeteksi reaksi antigen-antibodi. kebanyakan antigen multivalent sehingga mampu membentuk satu aggregat dengan adanya antibodi yang seuai. Jika antigen terlarut bergabung dengan antibodinya dalam lingkungan yang mengandung elektrolit ( NaCl ) pada suhu dan pH yang cocok, maka gabungan antigen antibodi ini menjadi presipitat yang tidak dapat larut.
sehingga akan terjadi pengendapan. Jika grafik diplotkan, perbandingan antara jumlah antigen dengan antibodi akan menghasilkan grafik sebagai berikut:
Tujuan uji presipitasi
Penggunaan reaksi presipitasi yaitu: 1. Menentukan jenis kuman
2. Identifikasi unsur antigenik pada kuman di dalam jaringan binatang yang terinfeksi 3. Pembakuan toksin dan antitoksin
4. Mencari antibodi di dalam serum
5. Uji serologis medikolegal untuk mendeteksi darah, serum dll
Faktor – faktor yang mempengaruhi reaksi presipitasi 1. Sifat antigen (Ag)
2. Elektrolit dan pH 3. Waktu dan suhu
4. Ratio antigen-antibody (Ag-Ab)
Reaksi Presipitasi
berbagai pengenceran. Dengan mengingat bahwa konsentrasi antibodi itu konstan, maka dapat kita lihat bahwa hanya terbentuk sejumlah kecil presipitat bila antibodinya berlebihan. Dengan ditambahnya konsentrasi antigen, maka jumlah presipitat meningkat dan mencapai maksimum bila perbandingan antara antigen dan antibodinya optimum. Sesudah zone ini, dengan bertambahnya konsentrasi antigen, maka jumlah presipitat menurun lagi. Jadi ada tiga zone reaksi antigen-antibodi pada uji presipitin : zone kelebihan antibodi, zone setara, dan zone kelebihan antigen.
Presipitasi terjadi antara molekul Ab dan Ag pada bentuk solubel. Pada pengujian ini antigen berbentuk koloidal. Laju presipitasi sangat tergantung pada proporsi antigen dan antibodi pada campuran. Terdapat beberapa cara pengujian pada metode presipitasi, yakni:
a. Uji tabung
Dengan mencampur pada tabung, masukkan dilusi antigen atau antibodi dengan jumlah tertentu. Dilusi dilakukan dari konsentrasi tinggi (tabung pertama) sampai konsentrasi terendah (tabung terakhir). Presipitat timbul pada tabung yang mengandung Ag dan Ab secara proporsional.
b. Presipitasi Cincin
Antigen dilapiskan pada serum (antibodi), terjadi difusi setelah mencapai ikatan proporsional dengan antibodi akan menghasilkan presipitasi berbentuk cincin.
c. Difusi Gel
Pada pengujian ini memungkinkan antigen dan antubodi berdifusi perlahan dari arah tertentu melalui gel. Pada cara ini homogenitas dan derajat kemurnian dari berbagai antigen dapat diuji. Pita presipitasi terbentuk pada setiap antigen dapat saling bertemu, atau bersilangan menunjukkan:
- bersambungan, antigen identik secara imunologik (terhadap serum uji) - bercabang, antigen berhubungan sebagian
- bersilangan, menunjukkan antigen tidak berhubungan
Zone of antibody excess adalah kondisi ketika konsentrasi antigen sangat rendah dibandingkan jumlah antibodi. Dalam kondisi ini, proses pembentukan kompleks tetap terjadi, tetapi endapan tetap dalam jumlah sedikit dan terdapat pada supernatant.
Zone of equivalent adalah kondisi ketika konsentrasi antigen mulai meningkat dan mulai terbentuk endapan akibat terbentuknya Kristal oleh reaksi antigen dengan antibodi.
Zone of excess antigen adalah ketika jumlah antigen banyak tetapi antibodi sedikit. Akibatnya proses presipitasi tidak berjalan dengan sempurna. Pada kondisi tertentu, ini dapat menyebabkan penyakit pada manusia yang disebut dengan serum sickness.
digunakan untuk memisahkan antigen dengan menggunakan presipitasi, sehingga memebentuk seperti lapisan cincin. Immune electrophoresis adalah pemisahan antigen yang tercampur secara kompleks dengan menggunakan elektroforesis. Radial immunodfiffusion merupakan variasi dari uji immunodiffusion yang dapat menghasilkan penghitungan jumlah antigen.
AGLUTINASI
Aglutinasi adalah uji serologi dimana virus atau bakteri yang tersuspensi dalam larutan bersatu menjadi gumpalan apabila suspense tersebut diperlakukan dengan antiserum yang mengandung antibody spesifik terhadap virus atau bakteri tersebut. Aglutinasi merupakan salah satu cara di mana antibodi menandai antigen untuk dihancurkan.
Peristiwa aglutinasi timbul karena antibodi bersifat bivalen. Antibodi tersebut memiliki dua daerah penggabungan dengan antigen. Dua daerah perikatan antara antibodi dengan daerah ikatan yang banyak pada antigen akan menimbulkan kristalisasi, yang dapat mengakibatkan ukuran kompleks menjadi semakin membesar.
Pengamatan proses aglutinasi suatu antigen oleh antibodi dengan melihatnya menggunakan slide mikroskop. Slide yang mengandung bakteri dan serum antibodi akan terlihat seperti terdapat gumpalan-gumpalan.
Reaksi aglutinasi adalah reaksi antara antigen yang tidak larut dengan antibody yang larut. Dapat juga antigen yang bereaksi adalah antigen larut, tetapi diikat oleh suatu pembawa (carrier) yang tidak larut, misalnya: sel darah merah, butiran latex dll.
Menurut sifat partikelnya aglutinasi dibagi menjadi 2 : 1. Aglutinasi langsung (Direct agglutination)
Antigen yang digunakan adalah antigen yang dalam bentuk aslinya berupa partikel, misalnya suspensi bakteri.
2. Aglutinasi pasif (Indirect agglutination)
Antigen dilekatkan pada suatu pembawa (carrier) berupa partikel (partikel inert), seperti: latex, gelatin, silikat dll., agar hasil reaksi dapat terlihat dengan mata.
Contoh reaksi aglutinasi : 1. Uji Comb
a. Indirect coombs test ( tidak langsung ) : untuk mencegah terjadinya ketidak cocokan golongan darah dalam tranfusi.
b. Direct coombs test ( langsung ) : untuk mendiagnosis auto imun heolitic anemia. 2. Test Widal
Untuk mendiagnosis enyakit typhus yang disebabkan oleh kuman Salmonella thyposa. 3. Uji Kehamilan
Untuk mengetahui adanya hormon hcg yang diproduksi oleh trophoblast janin. Terdapat 2 metode yaitu :
a. Metode biologi
Menggunakan katak jantan buffo vulgris. HCG dapat merangsang pengeluaran spermatozoa pada katak jantan sehingga katak jantan akan mengeluarkan sperma dalam waktu 2 jam.
b. Metode Imunologi
Metode aglutinasi direct : menggunakan satu reagen anti hcg lateks.
Metode aglutinasi indirect : menggunakan dua reagen anti hcg.
4. Uji ASO / ASTO
