1. Isolasi dan seleksi bakteri selulolitik menggunakan Media CMC (carboxymethyl cellulose)
Isolasi bakteri selulolitik dilakukan dengan metode cawan sebar pada media CMC dengan komposisi sebagai berikut:
1. 1 g CMC 2. 0,02 g MgSO4.7H2O 3. 0,075 g KNO3 4. 0,05 g K2HPO4 5. 0,002 g FeSO4.7H2O 6. 0,004 g CaCl2.2H2O 7. 0,2 g ekstrak kamir 8. 1,5 g agar-agar bakto 9. 0,1 g glukosa)
Koloni-koloni yang tumbuh dimurnikan dan diuji pertumbuhannya pada suhu 50oC dan aktivitas selulolitik dengan penentuan indeks selulolitik yang merupakan nisbah antara diameter zona bening dengan diameter koloni.
Pembuatan kurva tumbuh dan kurva aktivitas selulase.
Sebanyak dua lup penuh bakteri diinokulasikan ke dalam 100 ml media CMC 1% cair dan diinkubasi dalam inkubator bergoyang. Setiap 24 jam dilakukan pengukuran kekeruhan sel dan aktivitas selulase. Enzim selulase ekstrak kasar didapat dengan melakukan sedimentasi hasil kultur pada kecepatan 8400 g selama 10 menit pada suhu 4oC. Aktivitas selulase diukur menggunakan metode [5]. Satu unit aktivitas selulase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang menghasilkan 1 μmol glukosa dalam satu menit.
Satu unit aktivitas setara dengan 16,67 nkat (Dybkaer 2001) [6]. Kadar protein diukur menggunakan metode dengan bovin serum albumin (BSA) sebagai standar protein.
Karakterisasi selulase.
Karakterisasi enzim selulase meliputi penentuan pH dan suhu optimum serta substrat yang sesuai. Pengujian pada berbagai pH dilakukan pada pH 3 sampai dengan pH 9 dengan selang 0,5 unit menggunakan bufer sitrat fosfat 0,2 M (pH 3-5,5), bufer fosfat 0,2 M (pH 6-8) dan bufer tris-HCl 0,2 M (pH 8- 9). Suhu yang digunakan adalah 30°C sampai dengan 90°C dengan selang 10°C dalam substrat CMC 1% dalam bufer pH optimum dan inkubasi selama 30 menit. Aktivitas pada berbagai substrat dilakukan dengan cara menguji aktivitas selulase pada CMC, avisel, Whatmann filter paper No. 1 serta beberapa substrat limbah pertanian dalam bufer dengan pH optimum dan diinkubasi pada suhu optimum.
2. Medium Skim Milk Agar yang terdiri dari : 100 gr susu skim milk
14 gr agar
1000 ml air destilasi
Thioglycollate Medium yang terdiri dari : Thioglycollate 29,8 gr
1000 ml air destilasi
Nutrien Broth yang terdiridari 3 gr Beef ekstrak
10 gr pepton 5 gr NaCl 5
1000 ml air destilasi 1000 ml,
3. Medium Kaldu laktosa yangterdiri dari 5 gr Laktosa
10 gr pepton 5 gr NaCl
1000 ml air destilasi
Nutrien Agar yang terdir dari Beef ekstrak 3 gr
pepton 10 gr NaCl 5 gr agar 15 gr
air destilasi 1000 ml.
Masing - masingmedium dimasak sampai homogen dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer, setelah itu disterilisasi dalam autoclave pada suhu 1210C dengan tekanan 15 lbs selama 15 menit.Alat-alat yang digunakan adalah botol sampel, autoclave, pipet tetes, tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur, erlenmeyer, inkubator, gelas piala, batang gelas pengaduk, timbangan, tabung durhamdan
coloni counter.
Metode yang digunakan dalam penelitian iniadalah metode survei. Sampel yang digunakanadalah ikan kaleng (Sardines) kemasan expiretahun 2003, tahun 2004 dan tahun 2007 sebagai pembanding yang didapatkan dari tempat-tempat perbelanjaan yang terdapat di Pekanbaru. Sampel dianalisis secara mikrobiologi untuk mengetahui kandungan bakteri di Laboratorium.Ketiga sampel masing-masing ditimbang sebanyak 50 gr ditambah air destilasi 50 ml kemudian dihomogenkan untuk mendapatkan kelompok bakteri proteolitik, anaerobik, aerobic dan coliform.
Pengujian kelompok bakteri proteolitik, anaerobik, aerobik dan coliform
Untuk mendapatkan bakteri proteolitik sampel diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri yang sudah berisi medium Skim Milk Agar (10 ml), indikasi adanya bakteri proteolitik ditandai dengan terbentuknya areal bening disekitar bakteri.Untuk mendapatkan bakteri anaerobik sampel diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri yang sudah berisi medium Thioglycollate (15 ml), setelah itu bagian atasnya dilapisi Nutrien Agar untuk menjaga kondisi anaerobik, indikasi adanya bakteri anaerobik ditandai dengan timbulnya kekeruhan tanpa atau dengan pembentukan gas, pembentukan gas ditandai dengan terangkatnya lapisan Nutrien Agar (10 ml) ke atas. Untuk mendapatkan bakteri aerobic sampel diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi medium Nutrien broth (10 ml), indikasi adanya bakteri aerobic ditandai dengan timbulnya kekeruhan dan untuk mendapatkan bakteri coliform sampel diinokulasikan sebanyak 1 ml ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi tabung durham dan medium Kaldu laktosa (10 ml), indikasi adanya bakteri coliform ditandai dengan terbentuknya gas dan asam yang berarti hasilnya positif, gas dapat dilihat dalam tabung durham berupa gelembung udara dan asam dilihat dari kekeruhan. Semua sampel yang sudah diinokulasikan pada masing- masing medium kemudian diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 280C selama 2 x 24 jam (Fardiaz, 1993).
4. Media Cair Steril
Komposisinya terdiri dari : 1. 2 % larutan pepton 2. 0,03 % K2HPO4 3. 0,1 % MgSO4.7H2O 4. 0,5 Larutan Pati
Semua bahan di sterilkan dalam Erlenmeyer 250 ml dengan menggunakan otoklaf. Media yang mengandung unsur bakteri di inkubasikan pada suhu 65 oC
selama 48 jam di guncang dengan menggunakan shaker pada kecepatan 150 rpm.( Ajayi et, al 2007).
Setelah di inkubasi selama 48 jam kultur cair bakteri di masukkan ke dalam sentrifuge dan di putar selama 20 menit dengan kecepatan putaran 5000 rpm. Bagian yang merupakan supernatan merupakan ekstrak dari amylase kasar yang di hasilkan oleh kultur bakteri tersebut. Supernatant di ambil dengan menggunakan mikropipet.
Sebanyak 1 ml amylase kasar hasil sentrifugasi di masukkan ke dalam tabung uji, lalu di tambahkan setiap tabung uji 1 ml larutan pati 1 % dalam sitrat buffer fosfat Ph 6,5. Kemudian divorteks. Larutan pati dan enzim tersebut di inkubasi menggunakan water bath dengan suhu bervariasi mulai dari 40 oC, 50 oC, 60 oC, 65 oC, 70 oC dan 80 oC selama 20 menit.
Untuk menghentikan reaksi selama 30 menit, ke dalam tiap tabung uji di tambahkan 2 ml reagen DNS. Tabung uji dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit, didinginkan dan ditambahkan 20 ml akuades, selanjutnya tiap larutan dalam tabung uji dideterminasi intensitas warnanya dengan menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansinya diplotkan dengan kurva standart glukosa yang terbuat dari larutan glukosa mono hidrat dengan konsentrasi larutan 80 – 260 µl .
5. Media soluble-casein ( Pada Bakteri Selulolitik) Komposisinya terdiri dari:
1. 1 g soluble starch 2. 0,03 g casein 3. 0,2 g KNO3 4. 0,2 g K2HPO4 5. 0.005 gMgSO4.7H2O 6. 0,002 g CaCO3
7. 0,001 g FeSO4,7H2O.
Senyawa tersebut dilarutkan dalam 100 mL akuades sambil diaduk di atas
magnetic stirer. Setelah itu, diambil sebanyak 5 mL ke dalam tabung reaksi
untuk membuat media soluble-casein cair, sisanya di tambah dengan 2,4 g agar bacto untuk pembuatan media soluble-casein agar.Inokulan dishaker selama 3-5 hari. Inokulan diambil sebanyak 0,2 mL dan diinokulasikan ke dalam media
soluble-casein agar dengan metode cawan sebar.
Kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 3 hari atau lebih sampai koloni Actinomycetes tumbuh. Setelah tumbuh, koloni yang terpisah dan memiliki penampakan berbeda diambil sebanyak satu mata ose, diinokulasikan kedalam tabung reaksi berisi 5 mL media NA steril, kemudian di shaker selama 2 hari.
6. Media YPSs padat dan cair pada Bakteri Amilolitik dengan komposisi:
1. 0,2% ekstrak khamir 2. 0,5% pepton 3. 0,3% KH2PO4 4. 0,05% MgSO4.7H2O 5. 0,01% CaCl2.2H2O 6. 20 g agar
7. 2% pati terlarut sebagai sumber C (Mangunwardoyo, 1982). 8. Rose Bengal Agar dan PDA diperoleh dari Difco. Ltd.
YM agar (3 g ekstrak khamir,3 g ekstrak malt, 5 g pepton, 10 g glukosa, dan 20 g bacto agar dalam 1 L akuades). Produksi enzim amilase dilakukan dalam media YPSs cair. Isolat terseleksi dipelihara dalam PDA dan Nutrien Agar dengan komposisi 3 g ekstrak daging, 5 g pepton dan 20 g bacto agar per liter akuades.
Isolasi dan seleksi mikrobia
Isolasi dilakukan dengan cara menambahkan sejumlah tertentu masing-masing contoh kepermukaan media padat PDA, YPSs, YM agar dan Rose Bengal. Inkubasikan pada suhu kamar sekitar 2 hari, koloni tunggal masing-masing isolat yang tumbuh dimurnikan pada media yang sesuai. Di samping itu isolasi juga dilakukan dengan cara menumbuhkan satu tetes sampel pada media cair selektif, inkubasikan pada suhu kamar selama 2-3 hari. Setelah terlihat adanya pertumbuhan mikrobia baru dilakukan isolasi. Mikrobia yang terdapat pada kayu laru diisolasi dengan memasukkan 1-3 potong kayu laru ke dalam media cair yang mengandung gula sukrosa, diinkubasikan selama 2-5 hari pada suhu kamar sampai terlihat adanya tandatanda terjadi proses fermentasi (ditandai dengan timbulnya aroma khas alkohol dan terbentuk gelembung gas CO2), selanjutnya mikrobia yang ada diisolasi dengan cara menumbuhkan pada permukaan media padat yang sesuai.
Pengujian aktivitas amilase
Pengujian aktivitas amilase secara kualitatif dan semi kuantitatif dilakukan dengan cara menumbuhkan satu ose biakan khamir berumur 2-3 hari pada permukaan media agar YPSs dalam cawan petri. Inkubasikan selama 3 hari pada suhu kamar. Aktifitas amilase diuji dengan cara meneteskan larutan iodium pada media disekitar koloni. Hasil bagi antara diameter zona bening dan diameter koloni dinyatakan sebagai kekuatan enzim secara nisbi. Untuk pegujian aktifitas amilase secara kuantitatif, enzim kasar dipersiapkan dengan menumbuhkan isolatisolat terseleksi pada media YPSs cair. Sebanyak 2,5% suspensi kapang berumur 3 hari (OD 630 = 0,5 ) diinokulasikan ke dalam media produksi dan selanjutnya diinkubasikan pada suhu kamar selama 5 hari. Enzim amilase kasar diekstraksi dengan cara disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 5
menit. Aktifitas amilase dari enzim kasar ditentukan dengan cara mengukur jumlah gula pereduksi yang dihasilkan oleh aktivitas hidrolisis enzim terhadap substrat pati.
Caranya:
0,5 mL larutan enzim ditambahkan ke dalam 0,5 Ml substrat (2% pati terlarut dalam 0,05 M larutan buffer fosfat, pH 7), kemudian diinkubasikan pada suhu 40oC selama 10 menit. Produk yang terbentuk berupa gula produksi (glukosa) diukur dengan metoda Bernfeld (1955). Satu unit aktivitas amilase adalah banyaknya enzim yang dapat menghasilkan 1 μg glukosa per menit per mL larutan enzim pada kondisi pengujian yang dilakukan (Khinoshita et al., 1982 dan Gangrong et al., 1990).
DAFTAR PUSTAKA
Kanti ,Atit. 2004. Actinimycetes Selulolitik Dari Tanah Hutan Taman Nasional Bukit Dua Belas, Jambi. Bogor : LIPI.
Meryandini , Anja dkk. 2009. Isolasi Bakteri Selulolitik dan Karakteristik Enzimnya. Bogor.
Naiola , Elidar . 2008. Mikrobia Amilolitik pada Nira dan Laru dari Pulau Timor, Nusa Tenggara Timur. Cibinong : LIPI.
Wulandari , Sri dkk. 2005. Analisis Mikrobiologi Produk Ikan Kaleng (Sardines) Kemasan Dalam Limit Waktu Tertentu (Expire). Riau.
TUGAS MIKROBIOLOGI LAUT
Media Pembiakkan Bakteri
“Komposisi dan Cara Pembuatannya”
Oleh : Uswatun Chasanah
26020110130111
