Lampiran 1. Alur Kerja Penelitian
Isolat mikroba dan persiapan kultur bakteri
Dialisis Produksi enzim kitinase
Karakterisasi kitinase Bacillus sp. BK17 berdasarkan: 1. pH
2. Suhu
3. Kinetika enzim
4. Penentuan aktivitas enzim kitinase Bacillus sp. BK17 dengan substrat ekstrak jamur
Pengukuran aktivitas kitinase dan penentuan kadar protein dari Bacillus sp. BK17 Presipitasi enzim dengan amonium sulfat
Lampiran 2. Pembuatan Konsentrasi N-acetyl-D-glukosamin (GlcNAc) N-acetyl-D-glukosamin 1 mg + 1 ml air
Vortex
ditambahkan masing-masing 1000 l (1 ml) larutan Schales dihomogenkan
30 850 150 0,447 0,471 0,459
40 800 200 0,346 0,384 0,365
Lampiran 3. Persamaan Lineawer-Burk
Persamaan Lineawer-Burk= 0.0029X + 0.0063
1/Vmaks = 0,0063
Vmaks ( g/ml detik) = 158,7301587
Km/Vmaks = 0,0029
Km = 0,4603
Kemiringan = 0,0029 1/<s>= 0, 1/V 0, 0.0029 1/Km = 2,172413793
Lampiran 4. Penentuan Standar Bovin Serum Albumin
BSA µgram Absorbansi terkoreksi
0 0
20 0,1355
40 0,2065
60 0,302
80 0,376
100 0,4465
Lampiran 5. Komposisi Medium
5. 1 Medium Garam Minimum Kitin (MGMK) Agar
KH2PO4 0,3 g
5. 2 Medium Garam Minimum Kitin (MGMK) Cair
dicapai pH yang diinginkan, medium disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121˚C selama 15 menit.
Lampiran 6. Pembuatan Larutan Schales Potasium Ferisianida 0,25 g
Na2CO3 26,4975 g
Dilarutkan dalam 500 ml akuades
Distirer
Dituang ke dalam botol kaca
Lampiran 7. Uji Aktivitas Kitinase Modifikasi Spindler (1997)
Substrat Sampel Kontrol
Koloidal Kitin 0,3 % γ00 l γ00 l Penyangga fosfat 50 mM 200 l 200 l
Enzim 100 l 0 l
Diinkubasi pada suhu 37 ᴼC selama 30 menit
Keterangan Kontrol
Enzim yang setelah dipanaskan selama 10 menit
100 l
Dididihkan 10 menit
Disentrifuge 10.000 rpm selama 5 menit
Substrat Sampel Kontrol Blanko
Rumus :
Aktivitas enzim = ((konsentrasi sampel – konsentrasi blanko) – (Konsentrasi kontrol – konsentrasi blanko)) X 600 : Enzim Akhir X 1000 : Enzim awal X 1 : menit X 1 : BM kitinase.
Total aktivitas enzim : aktivitas enzim (Unit/mL) x volume enzim (mL) Total protein : protein (mg/mL) x volume enzim (mL)
Aktivitas spesifik
Unit/mg = Total aktivitas enzim (Unit/mL) Total protein (mg/mL)
Hasil % = Total aktivitas n X 100
Total aktivitas 0
Tingkat kemurnian (kali) = Aktivitas spesifik n
Lampiran 8. Metode Penentuan Kadar Protein (Bradford, 1976).
Pereaksi Blanko (ml) Sampel (ml)
Akuades 0,5 0
Enzim 0 0,5
Reagen Bradford 0,75 0,75
Divorteks
Lampiran 9. Komposisi Reagen Bradfrod & Pembuatan Ragen Bradford
A. Larutan Stock Bradford
Comassie Blue G-250 70 mg
Etanol 95% 20 ml
H3Po4 88% 40 ml
Distirer
Disaring dengan kertas saring
B. Pembuatan Reagen Bradford
425 ml akuades 15 ml 95% Etanol 35 ml 88% fosfat 30 ml larutan Stock Distirer
