PPT Biokimia Kelompok 4

Pemicu 1 : Kinetika

Pertumbuhan Sel

Kelompok 4 Angelina (1406533522) Mauhibah Yumna (1406577650) M Galih Utomo (1406533554) Wawan Irawan (1406544636) Woro Bismo (1406533472)

1. Bagaimana mekanisme biokimia secara

umum dalam pertumbuhan sel? Bagaimana

pula fase-fase yang dialami oleh sel dalam

masa pertumbuhannya?

Apa itu Biokimia?

Biokimia

adalah

ilmu

yang

mempelajari reaksi yang terjadi di dalam

atau berhubungan dengan makhluk hidup.

Reaksi

biokimia

umumnya

mempelajari

tentang reaksi makromolekul kehidupan

(karbohidrat, lemak, protein, asam nukleat),

dan molekul atau ion lain yang berhubungan

dengan

kehidupan

makhluk

hidup

(contohnya air).

Bagaimana

peranan

biokimia

dalam pertumbuhan sel?

Reaksi-reaksi biokimia sangat berperan dalam

siklus hidup sel,

karena tanpa reaksi-reaksi

tersebut sebuah sel tidak dapat bertahan

hidup.

Mempelajari reaksi-reaksi biokimia

dapat membuat kita mengerti lebih jauh

tentang siklus hidup dan pertumbuhan sel,

serta memanfaatkan pengetahuan itu untuk

diaplikasikan di bidang-bidang lain, seperti

medis dan pertanian.

Sasaran Biokimia

Mempelajari pertumbuhan sel baik kecepatan/produk dan waktu yang dapat direkayasa

Mempelajari jalur-jalur metabolisme dalam pertumbuhan sel & mekanisme pengendaliannya

Struktur kimia dari komponen makhluk hidup dan hubungan antara struktur kimia dengan fungsi biologis

Mempelajari metabolisme, yaitu keseluruhan reaksi kimia dalam makhluk hidup

Proses kimia dan substansi yang menyimpan dan mengirimkan informasi biologis

Kurva Pertumbuhan Sel

Fase Lag

• Terlihat mendatar pada kurva karena tingkat pertumbuhan sel sangat sedikit.

• Sel mulai beradaptasi dan mengumpulkan energi dengan memulai reaksi enzimatis untuk menguraikan substrat dan nutrien.

• Lamanya bergantung pada medium tumbuh dan jumlah awal sel yang mempengaruhi waktu adaptasi.

Fase Akselerasi

Fase dimana sel sudah selesai

melakukan masa adaptasi namun

Fase Eksponensial

• Tingkat aktivitas sel

mencapai kecepatan

maksimum yang dapat terlihat dari bentuk kurva yang eksponensial.

• Dipengaruhi oleh

beragam faktor biologis dan nonbiologis, seperti

sifat sel, asosiasi

organisme di medium

tumbuh, kandungan

Fase Pengurangan (

reduction

)

Tingkat pertumbuhan sel

mengalami penurunan,

karena nutrien yang

dibutuhkan sudah

hampir habis atau sel-sel

yang terdapat pada

medium mati karena

terpapar hasil

metabolisme yang

bersifat racun atau

persaingan dengan

Fase Stasioner

• Kurva mendatar menunjukan tingkat pertumbuhan sel sama dengan tingkat kematian sel. Pada fase ini sel mengalami resistensi yang lebih tinggi terhadap faktor eksternal seperti suhu dan zat kimia.

• Nutrisi di medium sangat berkurang • Terbentuk senyawa penghambat

Fase Kematian

• Tingkat kematian sel

sudah lebih banyak

dibandingkan tingkat pertumbuhan sel.

• Nutrien sudah habis sehingga sel tidak lagi

dapat melakukan

pertumbuhan, namun

hasil metabolisme yang bersifat toksik semakin banyak dan persaingan

antar organisme

semakin ketat sehingga sel yang mati lebih banyak dari sel yang hidup.

2. Bagaimana Anda mengukur dan

menganalisis pertumbuhan sel?

Jumlah Total Sel

Pertambahan atau pengurangan

banyaknya sel N dari sampel yang diambil

berbanding lurus dengan jumlah total

sebenarnya

di mana

• µ = laju pertumbuhan spesifik per

waktu

• X(t) = jumlah total sel per waktu

Aktivitas Populasi Mikrobial

dalam

Biakan Sistem Tertutup

di mana

• Xo: jumlah sel pada waktu nol,

• X: jumlah sel pada waktu t,

• t: waktu pertumbuhan diamati.

Doubling Time

Untuk memperkirakan kerapatan populasi

pada waktu yang akan datang dengan μ

sebagai konstanta pertumbuhan yang

berlaku. Parameter penting untuk konstanta

pertumbuhan populasi secara eksponensial

adalah waktu generasi (waktu

penggandaan). Penggandaan populasi terjadi

saat X / Xo =2, sehingga:

Laju Pertumbahan Sel

Untuk mengukur pertumbuhan sel, kita

dapat menentukannya dengan

menggunakan persamaan laju pertumbahan

sel (r

_x

)

dimana :

• μ = konstanta kecepatan pertumbuhan

• C

_X

= konsentrasi sel kering per unit volum

Cara Mengukur dan Menganalisis

Pertumbuhan Sel

Aktivitas dari pertumbuhan sel dapat diukur

secara kuantitatif, baik jumlah maupun

perubahan laju dari massa sel. Terdapat dua

kategori metode yang dapat digunakan:

Pengukuran Banyaknya

Sel

Pengukuran Mikroskopis

Langsung

Secara umum, metode yang

dilakukan adalah menghitung

sel pada slide kaca. Dengan

slide Petroff-Hauser, dapat

digunakan untuk menghitung

banyaknya sel pada setiap

kamar/kotak hemocytometer.

Massa Jenis Sel = Rata − rata sel per kotak Volume kotak

Diperlukan staining karena

jumlah sel mati dan hidup

tidak terlihat.

Plat Penghitung Sel Hidup

• Teknik yang dilakukan pada metode ini adalah dengan membuat

mikroba bertumbuh pada medium (kloning). Kemudian mikroba yang ada dihitung pada plat penghitung sel hidup dengan teknik

pengukuran koloni yang terbentuk (CFU).

• Dapat juga diaplikasikan pada mikroba pada lingkungan bebas. Namun, perlu diketahui bahwa mikroba yang terkandung pasti banyak sehingga pertumbuhan pada medium tertentu akan berbeda.

Plating and CFU Counting (Sumber: upload.wikimedia.org)

Penghitung Coulter

Penghitung yang ditemukan oleh Coulter ini menggunakan arus listrik melaui sebuah lubang. Setiap mikroba yang melewati lubang, tahanan akan bertambah dan arus menurun. Jumlah arus ini dapat terekam pada suatu alat dan dapat menunjukkan pengurangan arus sebandung dengan volume sel. Instrumen ini dapat memberikan banyaknya sel dan distribusi ukuran sel tetapi tidak memberikan info tentang bentuk sel. Partikel yang dapat dihitung adalah partikel yang berukuran 0,5-200 µm.

Aliran Cytometer (Flow

Cytometri)

Metode ini dilakukan dengan memanfaatkan sifat optis dari sel. Sampel yang telah dikultur di encerkan di aliran yang akan memisahkan sel secara membujur dari sel lain. Aliran melaui laser beam, absorption, flouresence, atau

light diffusion untuk menyampaikan perhitungan sel. Selektifitas juga dapat ditingkatkan dengan melabel

dengan flouresencent dye.

Pengurutan sel selesai dengan memasukkan muatan pada tetes

yang mengandung sel yang

diinginkan. Muatan membuat tetes tersebut terbelokkan ke detektor.

Flow Cytometer

Dry Cell Weight (Berat Sel

Kering)

Teknik ini dilakukan dengan mengeringkan sampel dengan proses sentrifugasi atau filtrasi, dicuci dengan air atau buffer, dan dikeringkan pada 80 derajat celcius. DCW sering digunakan pada fermentor. Sampel broth diambil dari fermentor kemudian ukur volumenya. Sel dipisahkan dengan sentrifugasi atau filtrasi, namum biasanya masih terdapat pengotor lain yang bukan merupakan sel sehingga perlu diperlakukan beberapa metode seperti penambahan buffer untuk menhilangkan asam. Kemudian sel dikeringkan dan ditimbang.

Packed Cell Volume

(PCV)

PCV sering digunakan pada industry plant untuk mengikuti kinerik fermentasi. PCV tergantung tidak hanya pada massa sel, tetapi juga pada kecepatan sentrifugal dan waktu, banyaknya padatan non-selular, mofologi kultur, dan

osmolaritas dari medium. Kondisi sentrifugasi biasanya di set untuk mengurangi efek dari

variabel lain. Banyaknya padatan nonselular akan berkurang seiring dengan pertambahan waktu. Padatan akan mengendap lebih dulu daripada sel sehingga dapat menghitung berat padatan yang ada.

Turbiditas (kekeruhan)

Turbiditas adalah teknik yang paling sering

digunakan pada pengukuran pertumbuhan mikroba.

Spektrofotometer

Visual method

Nephelometric method

Image Analysis

• Khusus

untuk

kasus

pertumbuhan

filamentous dan pembentukan pellet, sulit

untuk mengukur pertumbuhan dari sel

atau massa total sel.

• Analisis ini dapat menjadi alat berguna

untuk mengklasifikasi biomassa.

• Diambil gambar dari broth fermentasi dan

diproses dengan software komputer.

3. Bagaimana substrat dan pembentukan

produk dalam sel dapat menginhibisi

pertumbuhan sel? Dapatkah anda

menjelaskan faktor-faktor lainnya yang

dapat menginhibisi laju pertumbuhan sel?

Faktor-faktor yang Menginhibisi

Reaksi Pertumbuhan Sel

• Senyawa Kimia

• Pembentukan

Produk

• pH

• Suhu

• Cahaya

• Air

• Kelembaban

• Potensial Oksidasi

– Reduksi

• Keberadaan Gas

• Keberadaan

Antibiotik

• Salinitas

• Kondisi osmotik

• Logam Berat

• Inhibisi oleh substrat ini sering dianggap sebagai sifat biokimia dari substrat yang aneh dan menganggu

proses berjalannya reaksi kimia.

• Mekanisme inhibisi oleh substrat ditunjukkan pada Gambar 2. Terlihat substrat menyerang kompleks

enzim substrat sehingga membentuk kompleks enzim-substrat-substrat.

Grafik pengaruh kadar substrat terhadap kecepatan pertumbuhan spesifik Sumber: Julianti, Elisa. 2013)

• Tahap Reaksi: 𝐸 + 𝑆 𝑘1 𝐸 ∙ 𝑆 𝐸 ∙ 𝑆𝑘−1 𝐸 + 𝑆 𝐸 ∙ 𝑆 𝑘2 𝐸 + 𝑃 𝑆 + 𝐸 ∙ 𝑆 𝑘3 𝑆 ∙ 𝐸 ∙ 𝑆 (𝑖𝑛𝑎𝑘𝑡𝑖𝑓) 𝑆 ∙ 𝐸 ∙ 𝑆𝑘−3 𝑆 + 𝐸 ∙ 𝑆

Mekanisme inhibisi oleh substrat (Sumber:http://www1.lsbu.ac.uk/)

• Inhibisi oleh produk kadang disebut sebagai negative feedback

atau inhibition feedback.

• Inhibisi oleh produk adalah suatu tipe inhibisi enzim dimana produk dari suatu reaksi enzimatis menempel pada enzim dan menghambat aktivitasnya.

• Hal ini penting pada regulasi metabolisme sebagai suatu bentuk negative feedback yang mengontrol siklus metabolisme.

Gambar x.Mekanisme inhibisi oleh produk (Sumber:

http://www.csun.edu/)

Inhibisi oleh Pembentukan

Produk

• Pada dasarnya, inhibisi oleh produk adalah suatu hal yang merugikan dan dalam bioteknologi selalu berusaha dihilangkan karena dapat meningkatkan yield produksi, contohnya dalam produksi antibiotik. • Pada inhibisi ini, produk secara struktur mirip dengan

substrat sehingga akan berkompetisi dengan substrat untuk menempel pada sisi aktif enzim.

Contoh inhibisi oleh produk (Sumber: http://www.citruscollege.edu/)

Inhibisi oleh Pembentukan

Produk (2)

• Faktor-faktor lainnya yang dapat menginhibisi reaksi enzimatis adalah inhibitor kompetitif, non-kompetitif, dan inkompetitif, serta isomerisasi kompleks EI menjadi EI* yang inaktif.

• Inhibitor kompetitif mempunyai struktur yang mirip dengan substrat sehingga akan berkompetisi dengan substrat untuk menempel pada sisi yang sama pada enzim yaitu sisi aktifnya. • Inhibitor non-kompetitif tidak mirip secara struktural dengan

substrat sehingga akan menempel pada sisi yang berbeda dengan sisi aktif enzim, namun mengubah bentuk enzim sehingga substrat tak dapat menempel dengan enzim.

• Pada inhibisi inkompetitif, inhibitor dapat hanya dapat menempel pada enzim apabila enzim telah berikatan dengan suatu substrat atau lebih.

Inhibisi oleh

Faktor

Lainnya

Mekanisme inhibisi kompetitif (Sumber: http://www.csun.edu/)

Mekanisme inhibisi Inkompetitif (Sumber: http://www.csun.edu/)

4. Dengan adanya pertumbuhan sel ini, dapatkah anda menjelaskan mekanisme-mekanisme reaksi

yang mungkin dijalani oleh sel dalam masa pertumbuhannya? Bagaimana menentukan laju

reaksinya dari masing-masing mekanisme tersebut?

• Pertumbuhan pada sel melibatkan metabolisme energi, di mana Metabolisme adalah suatu proses komplek yang terjadi didalam sel dimana terjadi perubahan makanan menjadi energi dan panas melalui suatu proses kimia, berupa proses pembentukan dan penguraian zat.

• Metabolisme bertujuan untuk menghasilkan energi yang berguna bagi kelangsungan hidup, baik untuk pembelahan sel maupun transpor molekul ke luar dan ke dalam sel.

• Metabolisme sering disebut dengan reaksi enzimatis, karena metabolisme terjadi selalu menggunakan katalisator enzim.

Mekanisme Reaksi

Pertumbuhan Sel

• Anabolisme merupakan rangkaian reaksi kimia yang substrat awalnya adalah molekul kecil dan produk akhirnya adalah molekul besar, bertujuan untuk penyusunan atau sintesis molekul.

• Contoh : Pada reaksi fotosintesis berikut.

Fotosintesis

Gelap Terang

Proses Penyerapan Energi Cahaya

Beratus- ratus pigmen fotosintesis (fotosistem) meyerap foton

Energi eksitasi dibawa oleh pigmen ke pigmen lainnya hingga ke klorofil a

Klorofil a teraktivasi memberikan elektron ke molekul penerima elektron dalam sistem transpor elektron

Proses Penyerapan Energi Cahaya

Fotosintesis Gelap

(Calvin-Benson)

• Berlangsung dalam gelap, dan hanya dapat berlangsung jika ada ATP dan NADPH (yang dihasilkan proses terang) • Memerlukan ATP, hidrogen, dan elekton dari NADPH, karbon dan oksigen dari karbon dioksida, enzim yang

mengkatalisis setiap reaksi, dan RuBP.

Karbon dioksida diikat oleh RuBP menjadi senyawa 6 karbon, yang lalu memecah menjadi 2 fosfogliserat (PGA)

Masing masing PGA menerima gugus fosfat dari ATP dan menerima hidrogen serta

elektron dari NADPH, menghasilkan PGAL

Untuk setiap 6 molekul CO₂ yang diikat menghasilkan 12 PGAL

Dari 12 PGAL, 10 molekul kembali ke tahap awal menjadi RuBP, dan seterusnya RuBP akan mengikat CO₂ yang baru

2 PGAL lainnya akan berkondensasi menjadi glukosa 6 fosfat

𝐶

₆

𝐻

₁₂

𝑂

₆

+ 6𝑂

₂

6𝐶𝑂

₂

+ 6𝐻

₂

𝑂



Merupakan rangkaian reaksi yang bertujuan

untuk pembongkaran atau penguraian suatu

molekul.



Bersifat eksergonik.



Berfungsi menyediakan bahan baku untuk

sintesis molekul lain .



Menyediakan energi kimia yang dibutuhkan

untuk melakukan aktivitas kehidupan.

Pati Glukosa Maltosa dan polimer glukosa Glukosa dan galaktosa Glukosa dan fruktosa Sukrosa Laktosa Ptialin Amilase Sukrase Laktase Maltase dan 𝛼 − 𝑑𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑖𝑛𝑎𝑠𝑒

Pemecahan polisakarida dan

disakarida menjadi monosakarida

• Pertumbuhan sel merupakan salah satu dari rangkaian aktivitas sel yang fungsinya untuk mempertahankan kehidupannya. Setiap pertumbuhan sel mengikuti aturan-aturan berikut,

𝐶_{𝑠𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒} + 𝑁_{𝑠𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒} + 𝑝ℎ𝑜𝑠𝑝ℎ𝑎𝑡𝑒 + 𝑂₂ 𝐶𝑒𝑙𝑙 𝑚𝑎𝑠𝑠 +

𝐶𝑂₂ + 𝐻₂𝑂 + 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡 + ℎ𝑒𝑎𝑡

• Bila pertumbuhan sel terjadi saat kondisi aerob, maka

𝑐𝑒𝑙𝑙𝑠 + 𝑐𝑎𝑟𝑏𝑜𝑛 𝑠𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒 + 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛 𝑠𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒 + 𝑜𝑥𝑦𝑔𝑒𝑛 𝑠𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒 + 𝑝ℎ𝑜𝑠𝑝ℎ𝑎𝑡𝑒 𝑠𝑜𝑢𝑟𝑐𝑒 + ⋯ 𝑐𝑢𝑙𝑡𝑢𝑟𝑒 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑑𝑖𝑡𝑖𝑜𝑛 (𝑝𝐻,𝑇,𝑒𝑡𝑐.) 𝐶𝑂₂ + 𝐻₂𝑂 + 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡 + 𝑚𝑜𝑟𝑒_{𝑐𝑒𝑙𝑙𝑠}

Persamaan Monod

• Persamaan laju pertumbuhan sel mengikuti

alur mekanisme sel sebagai berikut:

𝑐𝑒𝑙𝑙𝑠 + 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑒 𝑚𝑜𝑟𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑠 + 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡

• Persamaan Monod

untuk pertumbuhan

eksponensial (log phase) adalah sebagai

berikut

𝑟

_𝑔

= 𝜇 𝐶

_𝑐

dimana

𝑟

_𝑔

adalah

cell growth rate

(g/dm

3

_.s)

𝐶

_𝑐

adalah

cell concentration

(g/dm

3

₎

Laju Pertumbuhan Spesifik

• Laju

pertumbuhan

spesifik

𝜇

dapat

ditunjukkan dengan persamaan

𝜇 = 𝜇

_𝑚𝑎𝑥

𝐶

𝑠

𝑘

_𝑠

+ 𝐶

_𝑠

• 𝜇

_𝑚𝑎𝑥

adalah laju reaksi pertumbuhan

spesifik maksimum (s

-1

₎

• 𝑘

_𝑠

adalah konstanta Monod (g/dm

3

₎

• 𝐶

_𝑠

adalah konsentrasi substrat (g/dm

3

₎

• Nilai

𝜇

_𝑚𝑎𝑥

dan

𝑘

_𝑠

yang biasa digunakan,

masing-masing, adalah 1,3 h

-1

dan 2,2 x 10-5

mol/dm

3

_.

• Apabila persamaan Monod dan laju pertumbuhan spesifik digabungkan maka didapatkan persamaan

𝑟_𝑔 = 𝜇_𝑚𝑎𝑥 𝐶𝑠 𝐶𝑐 𝑘_𝑠 + 𝐶_𝑠

• Apabila konstanta 𝑘_𝑠 kecil maka 𝑟_𝑔= 𝜇_𝑚𝑎𝑥 𝐶_𝑐.

• Inhibitor produk dapat mempengaruhi

pertumbuhan sel sebagai contoh fermentasi

glukosa yang memproduksi etanol dan diinhibisi oleh etanol itu sendiri.

• Maka persamaan empirisnya adalah

𝑟_𝑔 = 𝑘𝑜𝑏𝑠 𝜇𝑚𝑎𝑥𝐶𝑠 𝐶𝑐 𝑘_𝑠 + 𝐶_𝑠

Monod + Laju Pertumbuhan

Spesifik

Persamaan-Persamaan Laju

Pertumbuhan Sel

• Persamaan lain untuk menentukan laju

pertumbuhan sel adalah persamaan Tessier, yakni

𝑟_𝑔 = 𝜇_𝑚𝑎𝑥 1 − exp − 𝐶𝑠

𝑘 𝐶𝑐

• dan Persamaan Moser

𝑟_𝑔 = 𝜇_𝑚𝑎𝑥 𝐶𝑐

1 + 𝑘𝐶_𝑠−𝜆

• dimana λ dan k adalah konstanta empiris.

• Persamaan Moser dan Tessier sering digunakan karena keduanya menemukan data eksperimen yang tepat dan lebih baik pada awal atau akhir fermentasi.

Fase Kematian Sel

• Pada fase kematian sel persamaan lajunya menjadi

𝑟_𝑑 = 𝑘_𝑑 + 𝑘_𝑡𝐶_𝑡 𝐶_𝑐

• dimana 𝐶_𝑡 adalah konsentrasi racun yang

mengenai sel

• 𝑘_𝑑 adalah kematian alami

• 𝑘_𝑡 adalah kematian yang disebabkan oleh racun • Nilai representatif 𝑘_𝑑 berada di antara 0,1 h-1

hingga di bawah dari 0,0005 h-1_{, sedangkan 𝑘}

𝑡

5. Bagaimana Anda menghitung laju

reaksi dari suatu data konsentrasi

menggunakan diferensiasi grafis?

Hukum Laju dari Grafik

Konsentrasi Terhadap Waktu

• Reaksi pada orde 0

• Terbentuk garis yang linier • Laju reaki (r) = d[A]/dt = k

[A] versus t

• Reaksi pada orde 1

• Terbentuk garis yang linier

• Laju reaki (r) = d[A]/dt = k [A]

• Reaksi pada orde 2

• Laju reaki (r) = d[A]/dt = k[A]2

1 / [A] versus t

(sumber: http://www.chem.purdue.edu/gchelp/howt osolveit/Kinetics/CalculatingRates.html#Top)

Metode untuk menentukan tingkat reaksi.

Perubahan konsentrasi pereaksi dalam selang waktu tertentu

Penggunaan persamaan laju secara langsung.

Menentukan Laju Reaksi dengan

Metode Diferensiasi Grafis

dengan mengukur laju perubahan konsentrasi reaktan terhadap waktu

a A + b B → c C + dD

perubahan konsentrasi reaktan terhadap waktu selama reaksi berlangsung

Diferensiasi grafis dari data konsentrasi dengan menggambar tangent

Menentukan Laju Reaksi dengan

Metode Diferensiasi Grafis

Langkah - Langkah

Menebak bentuk persamaan reaksi serta orde reaksinya

Menyusun neraca

massa Membuat grafik

Garis Tidak Lurus

Garis Lurus

Metode Least Square

Pada metoda diferensial, variable

dalam bentuk derivatif yang besarnya

dapat dicari dengan metoda numeris :

t C C t C C t Limit dt dC A

_t

_t

A

_t

A

_i

A

_i

A        







1

0

100 ml larutan A dengan konsentrasi A 10 gmol/L dalam reaktor bereaksi membentuk B, selama terjadi reaksi diamati konsentrasi A, diperoleh data sebagai berikut :

Contoh Soal

Waktu (menit) C_A(gmol/L)

5 6,8 10 4,9 15 4,0 20 3,2 25 2,9 30 2,5

Bagaimana bentuk persamaan kecepatan reaksinya, tentukan laju reaksi dan konstanta kecepatan reaksinya!

1. Menentukan orde reaksi

Untuk menentukan, dilakukan percobaan

terhadap orde reaksi, percobaan pertama

terhadap reaksi orde 1 dengan persamaan kecepatan reaksi :

2. Menyusun neraca massa

Kecepatan bahan masuk − Kecepatan bahan Keluar − Kecepatan bahan bereaksi = Kecepatan akumulasi

dt

V

dC

V

kC

_A



A





0

0

Volume dianggap konstan, maka :

dt dC kC_A  A   0 0 Persamaan Derivatif linier

Untuk membuat grafik tersebut diperlukan

pengolahan data konsentrasi A dan waktu menjadi sehingga dihasilkan data sebagai berikut :

3. Membuat grafik

Waktu

(menit) CA (gmol/L) ĉA(gmol/L)

-5 6,8 5,85 0,38 10 4,9 4,45 0,18 15 4,0 3,60 0,16 20 3,2 3,05 0,06 25 2,9 2,70 0,008 30 2,5 dt dCA

3. Membuat grafik

y = 0.1114x - 0.2802 R² = 0.963 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 -d CA /dt CA Grafik - dCA/dt vs CA

Kesimpulan

• Dari grafik tersebut , hubungan

mendekati garis lurus maka bisa

disimpulkan bahwa reaksi tersebut

merupakan reaksi orde satu dengan

persaman kecepatan reaksi r

_A

=kC

_A.

Nilai konstanta kecepatan reaksi (k)

adalah slope dari garis tersebut

k =

0,118 (

1/menit).

6. Bagaimana anda menjelaskan

hubungan kinetik untuk reaksi-reaksi

berorde nol, satu, dan

Kinetika Orde Nol

• Reaksi dalam kinetika orde nol,

mempunyai laju reaksi yang tidak

dipengaruhi oleh konsentrasi

reaktan. Berikut adalah

persamaannya.

r

A

= k

₀

• Kita dapat menuliskan :

Kinetika Orde Satu

• Laju reaksi dalam reaksi kinetika

orde satu dipengaruhi oleh

konsentrasi reaktan, berikut adalah

hubungan antara laju reaksi dan

konsentrasi reaktan :

Kita asumsikan suatu reaksi dalam

suatu sistem tertutup, dan berada

dalam volume konstan, dan kita akan

mengukur

konsentrasi

reaktan

A

sebagai fungsi waktu. Dibawah kondisi

tersebut,

𝑟

_A

=

−

d

𝐶

A

_d

_𝑡

• Untuk menentukan apakah reaksi

tersebut merupakan kinetika orde

satu,

pertama-tama

kita

mengintegrasi persamaan diatas dan

𝑟

_A

=

−

d

𝐶

A

_d

_𝑡

lalu

melakukan

pengecekan

terhadap

data

konsentrasi

terhadap

persamaan

yang dihasilkan.

Memisahkan variabel dan mengintegrasi

persamaan diatas dengan kondisi awal

𝐶

_A

=

𝐶

_A

₀

dengan t = 0 :

𝐶

_A

= 𝐶

_A

₀

𝑒

−𝑘1 𝑡

ln 𝐶

_A

= ln 𝐶

_𝐴0

− 𝑘

₁

𝑡

Jadi, untuk reaksi orde satu, plot grafik dari

ln 𝐶

_{A terhadap waktu memberikan garis}

lurus dengan gradien

−𝑘

₁

.

• Kinetika Michaelis-Menten

Kinetika dari sebagian besar reaksi enzimatik

menggunakan persamaan Michaelis Menten:

𝑟

_A

=

𝑣

max

𝐶

A

𝐾

_m

+ 𝐶

_A

• Mekanisme

Michaelis

Menten

biasanya

digunakan untuk reaksi katalis enzim dengan

persamaan sebagai berikut :

Pada saat

kecepatannya

menjadi

maksimum sehingga:

Enzyme Source Substrate Km (mM) Alcohol dehydrogenase Saccharomyces cerevisiae Ethanol 13,0 α-Amylase Bacillus stearothermophilus Starch 1,0

Porcine pancreas Starch 0,4

β-Amylase Sweet potato Amylose 0,07

Aspartase Bacillus cadaveris L-Aspartate 30,0

β-Galactosidase Escherichia coli Lactose 3,85

Glucose oxidase Aspergillus niger D-Glucose 33,0

Penicillium notatum D-Glucose 9,6

Histidase Pseudomonas fluorescens L-Histidine 8,9

Invertase Saccharomyces

cerevisiae

Sucrose 9,1

Neurospora crassa Sucrose 6,1

Lactate

dehydrogenase

Bacillus subtilis Lactate 30,0

Penicillinase Bacillus licheniformis Benzylpenicillin 0,049

Urease Jack bean Urea 10,5

Konstanta Michaelis untuk enzim tertentu. Sumber : B. Atkinson andF.

Mavituna, 1991, Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook, 2nd edn, Macmillan, Basingstoke

• Michaelis-Menten,

yang

akan

dibahasi

disini

adalah

reaksi

sederhana yang dari sifat kinetik dari

banyak enzim adalah :

Michaelis-Menten (laju reaksi kimia

penguraian substrat saat dipengaruhi

oleh katalis enzim)

• Persamaan Michaelis-Menten adalah persamaan paling baik yang dapat mendeskripsikan kinetika dari berbagai enzim yang dipakai di industri, walaupun ada pengecualian terhadap enzim seperti glucose isomerase dan amyloglucosidase. • Saat konsentrasi substrat [S] jauh lebih kecil

daripada konstanta Michaelis-Menten K_m, laju

reaksi berbanding lurus dengan konsentrasi

substrat. Ini merupakan laju reaksi orde satu

sehubungan dengan substrat.

• Saat konsentrasi substrat [S] jauh lebih besar daripada konstanta Michaelis-Menten Km, laju

reaksinya konstan dan sama dengan laju

maksimum (V_max). Laju reaksi tidak bergantung pada konsentrasi substrat. Ini merupakan laju reaksi orde nol terhadap substrat.

Grafik laju reaksi orde 0 dan 1 (Richard A. Harvey : Biochemistry)

7. Bagaimana anda menentukan

parameter kinetika enzimatik,

V

_max

dan Km dari suatu data

konsentrasi? Berikan contoh!

Reaksi Enzimatik

• Reaksi enzimatik merupakan suatu reaksi

yang melibatkan enzim sebagai katalis.

• Enzim berfungsi sebagai katalis yang akan

membuat reaksi berlangsung lebih cepat

untuk menghasilkan produk.

• Peneliti yang bernama Leoner Michaelis

dan Maud Menten mengajukan suatu

model untuk suatu reaksi enzimatik.

Berikut ini adalah reaksi yang

digambarkan oleh Michaelis-Menten:

P

E

ES

S

E









k 1 k₂ k_1'

Peneliti yang bernama Leoner Michaelis dan Maud Menten mengajukan suatu model untuk suatu raksi

enzimatik. Berikut ini adalah reaksi yang

digambarkan oleh Michaelis-Menten:

P

E

ES

S

E





k1



k2



k_1'

] [ ] [ 2 ES k v dt P d _{ } ] [ ] ][ [ ] ][ [ ] [ 2 ' 1 1 E S k E S k ES k dt ES d _{  }

Laju Pembentukan Produk

]

[

]

[

]

[

]

[

]

[

]

[

E

tot



E



ES



E



E

tot



ES

Enzim berperan sebagai katalis, sehingga konsentrasi enzim itu tetap atau dapat dikatakan tidak terkonsumsi maka persamaan konsentrasi enzim dapat dituliskan menjadi sebagai

berikut:

Dari reaksi diatas, kita dapat mendapatkan persamaan laju pembentukan produk dan kompleks substrat-enzim sebagai berikut:

Laju Pembentukan Kompleks Substrat-Enzim

P

E

ES

S

E





k1



k2



k_1'

Reaksi yang menggunakan enzim sebagai katalis, akan menghasilkan grafik seperti berikut ini jika kita lakukan plot antara laju pembentukan produk terhadap konsentrasi substrat:

Keterangan : Km adalah konstanta Michaelis Menten (Konsentrasi substrat dimana kecepatan sudah mencapai ½ kecepatan maksimal.

Plot Michaelis - Menten

• V

_max

dan K

_m

dapat ditentukan dari grafik, V

_max

adalah sebagai laju s



~ dan K

_m

nilai dari s saat

V=V

_max

/2. Pengakurasian metode ini memiliki

kelemahan karena sulit untuk menentukan t

_mx

.

Plot Lineweaver - Burk

• Metode ini digunakan untuk langkah linearisasi untuk menghasilkan plot garis lurus yang bisa menentukan V_max dan K_m dengan persamaan:

1 𝑉 = 𝐾_𝑚 𝑉_𝑚𝑎𝑥𝑆 + 1 𝑉_𝑚𝑎𝑥

• Sehingga plot dari 1/v vs 1/s harus menghasilkan garis lurus dengan slop K_m/V_max dan intercept 1/V_max. Plot ini dikenal sebagai Lineweaver-Burk plot. Bagaimanapun juga, proses linearisasi yang

digunakan pada data eksperimen error pada v,

sehingga kesalahan ini diperkuat pada

Plot Eadie - Hofstee

• Jika persamaan 1 𝑉 = 𝐾_𝑚 𝑉_𝑚𝑎𝑥𝑆 + 1 𝑉_𝑚𝑎𝑥 dikalikan dengan 𝑉(𝑉𝑚𝑎𝑥

𝐾_𝑚 ), dan kemudian disusun, bentuk linearisasi

lainnya dari persamaan Michaelis-Menten adalah

𝑉 𝑆 = 𝑉_𝑚𝑎𝑥 𝐾_𝑚 − 𝑉 𝐾_𝑚

• Pada persamaan di atas, plot v/s versus V_max/K_m akan menghasilkan garis lurus dengan slop -1/K_m dan intercept V_max/K_m yang dikenal dengan Hofstee plot. Seperti plot Lineweaver-burk, Eadie-Hofstee linearisasi mendistorsi kesalahan dalam data, sehingga metode ini telah mengurangi akurasi.

Plot Langmuir

• Dengan mengalikan persamaan 1

𝑉 =

𝐾_𝑚

𝑉_𝑚𝑎𝑥𝑆 + 1

𝑉_𝑚𝑎𝑥 dengan S, maka bentuk linearisasi

persamaan Michaelis-Menten menjadi Langmuir adalah: 𝑆 𝑉 = 𝐾_𝑚 𝑉_𝑚𝑎𝑥 + 𝑆 𝑉_𝑚𝑎𝑥

• Sehingga sebuah plot Langmuir pada S/V versus S harus menghasilkan garis lurus dengan slop 1/V_max dan intercept K_m/V_max. Linearisasi dari metode ini menghasilkan kesalahan yang kecil, sehingga metode Langmuir direkomendasikan metode untuk menentukan K_m dan V_max.

Direct Linear Plot

Garis lurus dihasilkan pada (-s,v) akan mendapatkan titik yang unik (K_m dan V_max), yaitu dimana semua hasil garis lurus dari –S dan V akan menghasilkan titik potong yang banyak di suatu titik. Ketika data yang diplot mengandung kesalahan, maka akan diperoleh titik persimpangan. Setiap persimpangan akan memberikan suatu nilai perkiraan V_max dan K_m, kemudian median V_max dan K_m yang dijadikan sebagai parameter kinetik reaksi.

Contoh soal

Laktosa yang juga dikenal sebagai β-galactosidase, yang mengkatalis hidrolisis laktosa untuk memproduksi glukosa dan galaktosa dari susu. Eksperimen dilakukan

untuk menentukan parameter kinetik untuk enzim.

Konsentrasi Laktosa (mol/L)

Initial reaction velocity (mol-1 _min-1 _{x 10}3₎ 0,0250 1,94 0,0227 1,91 0,0184 1,85 0,0135 1,80 0,0125 1,78 0,00730 1,46 0,00460 1,17 0,00204 0,779

• Untuk menentukan parameter kinetika enzim dengan metode Langmuir, Langmuir Plot dengan

mengalikan persamaan 1 𝑉 = 𝐾_𝑚 𝑉_𝑚𝑎𝑥𝑆 + 1 𝑉_𝑚𝑎𝑥 dengan

s, maka bentuk linearisasi persamaan Michaelis-Menten menjadi Langmuir adalah :

𝑆 𝑉 = 𝐾_𝑚 𝑉_𝑚𝑎𝑥 + 𝑆 𝑉_𝑚𝑎𝑥

• Sehingga sebuah plot Langmuir pada s/v versus s harus menghasilkan garis lurus dengan slop 1/vmax dan intercept K_m/V_max. Linearisasi dari metode ini menghasilkan kesalahan yang kecil, sehingga metode Langmuir direkomendasikan sebagai metode untuk menentukan K_m dan V_max.

s (mol/L) s/v (min) 0,0250 12,89 0,0227 11,88 0,0184 9,95 0,0135 7,50 0,0125 7,02 0,00730 5,00 0,00460 3,93 0,00204 2,62 y = 444,8x + 1,702 R² = 0.9984 0 2 4 6 8 10 0.00204 0.0046 0.0073 0.0125 0.0135 S/ V ( min ) S (mol/L)

Hubungan S/V vs S dalam Reaksi Hidrolisis Laktosa

Data Plot Langmuir

Gambar Grafik Plot Data Perhitungan Langmuir

Persamaan garis pada grafik adalah

y = 444,8x + 1,702

•

1

𝑉_𝑚𝑎𝑥

= 445 mol

-1

_min

• V

_max

= 2,25

×

10

-3

_{mol min}

-1

•

𝐾𝑚

𝑉_𝑚𝑎𝑥

= 1,70

• K

_m

= 1,70

×

2,25

×

10

-3

_{= 3,83}

_×

₁₀

-3

_mol

-1

• Jadi K

_m

bernilai 3,83

×

10

-3

_mol

-1

_{dan V}

max

=

8. Bagaimana pengaruh suhu

terhadap laju reaksi enzimatik?

• Enzim umumnya merupakan protein globular. Aktivitas enzim ditentukan oleh

struktur tiga dimensinya (struktur

kuaterner). Walaupun struktur enzim

menentukan fungsinya, prediksi aktivitas enzim baru yang hanya dilihat dari strukturnya adalah hal yang sangat sulit.

• Kebanyakan enzim berukuran lebih besar daripada substratnya. Enzim terdiri dari sisi aktif dan inaktif.

• Enzim merupakan rantai asam amino

yang melipat. Tiap-tiap urutan asam amino menghasilkan struktur pelipatan dan sifat-sifat kimiawi yang khas.

Enzim

adalah biomolekul berupa protein

yang berfungsi sebagai katalis (senyawa

yang mempercepat proses reaksi tanpa

habis

bereaksi)

dalam

suatu

reaksi

biokimia. Hal ini akan menyebabkan

zat awal yang disebut substrat akan

dipercepat

perubahannya

menjadi

molekul lain yang disebut produk.

E + S



ES



E + P

• Pada reaksi antara substrat dan enzim, saat terjadi pemanasan, aktivitas enzim meningkat, sehingga terjadi gerakan termodinamik atau tumbukan antara substrat dan enzim.

• Pada suhu rendah, aktivitas enzim rendah, bahkan bisa berhenti sama sekali.

• Pada suhu diatas suhu optimum, aktivitas enzim menurun karena terjadi denaturasi pada enzim.

• Karena enzim tersusun dari protein maka enzim sangat peka terhadap temperatur. Temperatur terlalu tinggi dapat menyebabkan denaturasi protein.

KIRI

Molekul enzim & substrat bergerak lambat. Dengan naiknya suhu, energi kinetik mereka meningkat dan gerakan yang terjadi lebih cepat . Semakin tinggi suhu, semakin cepat gerakan dan lebih sering terjadi tabrakan dan menyebabkan reaksi berlangsung lebih cepat.

TENGAH

Suhu terbaik untuk reaksi, disebut suhu optimum.

KANAN

Setelah mencapai suhu optimum, laju reaksi mulai melambat. Hal ini karena enzim molekul mulai didenaturasi dan tidak lagi cocok menjadi situs aktif, sampai akhirnya tidak ada reaksi terjadi sama sekali.

Hampir semua enzim memiliki aktivitas optimum pada suhu sekitar

30o_{C & denaturasi dimulai pada}

temperatur 45o_{C (Winarno,1986).}

Hubungan antara suhu dan laju reaksi secara

empiris dinyatakan dengan ketetapan

Arrhenius

k : Laju Reaksi

A : Tetapan Arrhenius

R : Konstanta gas (1,987 kal / g-mole K)

T : Temperatur K

E

_A

: Energi Aktivasi ( J mol

-1

₎

Perubahan nilai k terhadap perubahan suhu (T) yang dinyatakan dalam hubungan

Arrhenius

Contoh

• Dari data tabel di bawah ini terlihat bahwa

beberapa enzim memiliki suhu optimal

yang

berbeda-beda

dan

bervariasi

tergantung pada jenis enzim itu sendiri.

• Dari tabel Hasil Pengamatan Pegaruh Suhu

Terhadap Aktivitas Enzim Amilase yang

diambil dari hasil praktikum Biokimia Gizi

(IPB 2013) di bawah ini, dapat terlihat

bahwa enzim amylase memiliki suhu

optimum dan bekerja efektif pada suhu

25

o

_C.

Tabel Hasil Pengamatan Pegaruh Suhu

Terhadap Aktivitas Enzim Amilase (IPB, 2013)

Suhu (o_{C) ∆A / menit (V)} 0 0,106 25 0,146 Suhu Ruang 0,043 37 0,047 60 0,038 100 0,031

9. Bagaimana menghitung yields pada

kultur sel dan peran pentingnya

sebagai salah satu parameter kinetika

reaksi?

Konsep Dasar

Yield

(theoritical

yield)

Faktor Yield

Nutrisi yang dibutuhkan Karakteristik produksi

Biaya

Definisi

• Yield merupakan suatu koefisien yang

berguna untuk menghubungkan substrat

terkonsumsi, sel-sel baru yang dihasilkan,

dan produk yang dihasilkan.

• Ketika

kita

mengikutsertakan

proses

pertumbuhan

sel

pada

perhitungan

maka

akan menggunakan banyak enzim

dan konversi kimia. Meskipun kompleks,

prinsip-prinsip yield dapat diterapkan untuk

metabolisme yang berkaitan dengan aliran

substrat untuk pembentukan biomassa.

Yield terkespresikan dengan menggunakan

koefisien yield atau faktor yield

Y

_FG

= faktor yield

ΔF = massa yang diproduksi

ΔG = massa yang dikonsumsi

Pada kultur sel, nilai ΔF dan ΔG dihitung sebagai perbedaan antara nilai awal dan nilai akhir. Nilai ini merepresentasikan sebagai nilai rata-rata seluruh yield dari keseluruhan langkah.

Y

_FG

Y

_xs

Sebagai contoh, Y_XS pada suatu waktu tertentu:

Yield akan bervariasi pada setiap periode, oleh karena itu selain harus menghitung nilai keseluruhan yield kita juga harus menghitung nilai yield pada titik waktu tertentu.

Massa atau mol produk yang terbentuk per satuan massa atau mol substrat dikonsumsi.

Y_PS

Massa atau mol biomassa yang dihasilkan per satuan massa atau mol substrat dikonsumsi.

Y_XS

X = biomassa S = substrat

P = produk

C = karbon dioksida (carbon dioxyde)

O = oksigen

Massa atau mol karbon dioksida yang terbentuk per satuan massa atau mol substrat

dikonsumsi.

Y_CS Y_PX

Massa atau mol produk yang terbentuk per satuan massa atau mol biomasa terbentuk.

Massa atau mol biomasa yang terbentuk per satuan massa atau mol oksigen yang dikonsumsi.

Y_XO

RQ

Respiratory Quotient. Mol karbon dioksida yang terbentuk per mol dikonsumsi oksigen. Hasil ini disebut hasil bagi pernafasan.

Massa atau mol biomassa terbentuk per mol ATP

terbentuk.

Massa atau mol biomassa yang terbentuk per kilo kalori panas yang berkembang selama fermentasi.

Y_CAL Y_ATP

Biomass Yield

Biomass yield dipengaruhi oleh banyak faktor, seperti: - komposisi medium

- sumber karbon dan nitrogen

- pH

- temperatur

MW cell = biomass formula-weight ditambah residu catatan: tidak terdapat extracellular product

10. Bagaimana anda mengevaluasi

proses kultivasi sel, mulai dari

pertumbuhan sel, serapan substrat

hingga laju produksinya?

Kultivasi Sel

• Kultivasi adalah menumbuhkan sel/

bakteri dalam biakan murni

• Hal yang perlu diperhatikan untuk

mengevaluasi proses kultivasi sel:

Laju Pertumbuhan Serapan Substrat

Laju Pertumbuhan Sel



Hal yang perlu diketahui:

konsentrasi sel



_{Metode pengukuran konsentrasi sel:}

 Metode pengukuran langsung jumlah sel

 Metode pengukuran berat kering sel

 Metode turbidity (tingkat kekeruhan kultur)

 Metode pengukuran produk yang terbentuk



_{Terlepas dari metode di atas, terdapat}

suatu teknik pengukuran konsentrasi sel,

yaitu

diferensiasi grafik konsentrasi

.

Diferensiasi Grafik Konsentrasi

• Berguna untuk -> menyatakan laju pertumbuhan

volumetrik (r_x) dalam kultur batch.

 Ketika r_x diketahui, maka laju pertumbuhan spesifik (μ) dapat dihitung dengan membagi r_x terhadap konsentrasi sel.

μ = r_x/x

• Laju volumetrik serapan substrat dan pembentukan produk, r_S dan r_P, juga dapat dievaluasi dengan metode diferensiasi grafik konsentrasi substrat dan produk.

 Ketika r_S dan r_P diketahui, laju pembentukan produk spesifik q_P dan laju serapan substrat spesifik q_S dapat diperoleh dengan membagi laju volumetriknya masing-masing terhadap konsentrasi sel.

Diferensiasi Grafik Konsentrasi

(Sumber: Pauline M. Doran, 2002) Diferensiasi

grafik pada sistem kultur

Kinetika Serapan Substrat Sel

• Tidak hanya untuk pertumbuhan serta

pembentukan (sintesis) produk, penambahan substrat juga ditujukan untuk mengenerasi energi untuk menjaga aktivitas selnya.

• Laju spesifik serapan substrat untuk menjaga

aktivitas sel dikenal sebagai maintenance

coefficient (m_S).

• Dimensi untuk m_S adalah T-1 _{dengan satuan (kg}

biomassa)-1_s-1_{. Nilai koefisien ini berbeda pada}

Maintenance coefficient

beberapa

organisme dengan glukosa sebagai energi

Kinetika Serapan Substrat Sel

• Persamaan laju serapan substrat sebagai

fungsi dari konsentrasi biomassa:

Keterangan:

r_s = laju volumetrik konsumsi substrat (kgm-3_s-1₎ q_S = laju spesifik serapan substrat

x = konsentrasi biomassa.

Kinetika Serapan Substrat Sel

• Pada kondisi dimana tidak terjadi pembentukan

produk, diasumsikan jika seluruh substrat

digunakan untuk pertumbuhan dan fungsi

pemeliharaan (maintenance), persamaan laju

aktivitas selnya adalah:

 Keterangan:

r_X = laju volumetrik pembentukan biomassa Y_XS = yield biomassa dari substrat

m_S = maintenance coefficient x = konsentrasi biomassa

Kinetika Serapan Substrat Sel

• Untuk kondisi dimana terjadi pembentukan substrat yang disertai dengan metabolisme energi, laju konsumsi substrat merupakan fungsi dari 3 faktor, yaitu laju pertumbuhan, laju pembentukan produk, dan laju serapan substrat

untuk pemeliharaan (maintenance).

Persamaannya, yaitu:

Keterangan:

r_S =laju volumetrik konsumsi substrat r_P =laju volumetrik pembentukan produk Y_PS = yield produk dari substrat.

Daftar Pustaka

• Anonim. Inhibition of Enzyme Activity [pdf]. Terdapat pada <http://www.csun.edu/~hcchm001/5enzyme.pdf> diakses pada 17 April 2016.

• Anonim.2009. Teknik Fermentasi. <akademik.che.itb.ac.id/ /fer-teknik-fermentasi.pdf>. [ONLINE]. Diakses pada

tanggal 18 April 2016.

• Doran, Pauline M., 1995. Bioprocess Engineering Principles. Elsevier Science & Technology Books

• Fogler, H. Scott. 2006. Elements of Chemical Reaction Engineering 4th edition. USA: Pearson Education, Inc.

• Julianti, Elisa., 2013. Kinetika Pertumbuhan Mikroba [pdf] Terdapat pada

<http://elisajulianti.files.wordpress.com/2013/03/kinetika-pertumbuhan-mikroba.pdf> diakses pada 17 April 2016