BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Sintesis Kitosan – Tripolifosfat
Sintesis kitosan – tripolifosfat dilakukan melalui metode gelasi ionik dengan kitosan dilarutkan pada asam asetat 1% yang akan memprotonasi gugus amino menjadi gugus NH3+. Terbentuknya ion tersebut menyebabkan kitosan menjadi terlarut (Gambar 1). Sementara, larutan Na-TPP sebagai sumber tripolifosfat (TPP). Tripolifosfat dengan konsentrasi 0,1% larut dalam air menghasilkan ion OH- (hidroksil) dan ion – ion tripolifosfat (-P3O105-). Reaksi dissosiasi natrium tripolifosfat (Alauhdin & Widiarti, 2014).
Na5P3O10 + 5H2O 5Na+ + H5P3O10 + 5OH- H5P3O10 + OH- H4P3O10- + H2O
H4P3O10-
+ OH- H3P3O102-
+ H2O H3P3O102-
+ OH- H2P3O103-
+ H2O H2P3O103-
+ OH- HP3O104-
+ H2O P3O105- + OH- P3O105- + H2O
Metode gelasi ionik melibatkan interaksi ionik antara muatan positif kitosan dengan muatan negatif TPP yaitu antara gugus amino (positif) pada kitosan dengan polianion yang bersifat negatif yaitu Na-TPP (Wintari, 2017; Bangun dkk, 2018). Polikationik kitosan terbentuk pada pH asam, sedangkan polianionik TPP terbentuk akibat terdisosiasinya dalam air yang selanjutnya akan bereaksi dengan NH3+ dari kitosan (Husniati, 2014; Alauhdin & Widiarti, 2014).
O
NH2 H H H H
H
O O
H
OH O
H
CH3 O
NH3+ H H H H
H
O O
H
OH O
H
CH3
+
H+Gambar 2. Protonasi Kitosan (Lusiana & Pranotoningtyas, 2018)
Khabibi, 2016). Ion – ion OH– (hidroksil) dan ion – ion tripolifosfat (-P3O105-) yang bermuatan negatif akan bereaksi secara ionik melalui pembentukan ionik cross-linking (Antoniou et al, 2015; Alauhdin & Widiarti, 2014; Bangun dkk, 2018). Tripolifosfat (TPP) dipilih sebagai pengikat silang karena TPP memiliki muatan negatif yang lebih banyak, sehingga dapat berinteraksi lebih kuat dengan kitosan yang bermuatan positif, yaitu NH3+.
Pembentukan butiran partikel dilakukan dengan penetesan larutan natrium tripolifosfat 0,1% pada larutan kitosan sambil diaduk dengan magnetic stirrer pada kecepatan 800 rpm selama 1 jam (Agarwal dkk., 2018). Kecepatan pengadukan menyebabkan berkurangnya algomerasi yang menyebabkan ukuran partikel meningkat, hal ini juga ditambahkan oleh Jayanudin, dkk (2018) bahwa faktor untuk menetukan ukuran droplet dan stabilitas emulsi adalah pada kecepatan pengadukan, karena semakin cepat pengadukan menyababkan tegangan antar muka karena semakin semakin kecil dan semakin banyak partikel yang terpecah sehingga ukuran droplet emulsi akan semakin kecil. Dari hasil sintesa kitosan - tripolifosfat didapat rendemen sebesar 60%, apabila dibandingkan dengan penelitian Suptijah dkk (2011) rendemen kitosan nanopartikel yang dihasilkan 81,30% dengan menggunakan metode pengecilan ukuran dengan alat magnetic stirrer. Menurut Suptijah dkk (2011) rendahnya rendemen kitosan tripolifosfat disebabkan karena algomerisasi partikel bahkan polimerisasi, dimana nanopartikel yang terbentuk selama pengeringan menggunakan spray drying hanya partikel yang stabil, sedangkan partikel yang mengalami algomerisasi menempel pada dinding tabung spray drying. Suhu inlet kitosan - tripolifosfat berkisar antara 25 – 35°C dan suhu oprasional alat berkisar 120 – 180 °C namun hingga suhu 180°C kitosan – tripolifosfat tidak rusak (Liu dkk., 2011).
Gambar 3. Mekanisme Cross-Linking antara Kitosan dan Tripolifosfat (Lusiana & Pranotoningtyas, 2018)
4.2 Karakterisasi Kitosan Tripolifosfat
4.2.1 Analisis FTIR (Fourier Transform Infa Red)
Berdasarkan Gambar 4, spektra FT-IR kitosan hasil sintesis tidak berbeda jauh dengan kitosan standard (komersial). Pada kitosan hasil sintesis menunjukkan adanya serapan pada bilangan gelombang 3429,58 cm-1 yang menunjukkan gugus –OH dan gugus NH2 (stretching) (Rampino dkk, 2013). Serapan pada bilangan gelombang 2881,77 cm-1 menunjukkan ikatan C-H (Banerjee dkk., 2002), bilangan gelombang 1655,00 cm-1 menunjukkan ikatan C=O dari gugus amida, bilangan gelombang 1592,31 cm-1 menandakan adanya gugus amina –NH (Iswandana dkk, 2013), dan bilangan gelombang 1327,08 cm-1 menunjukkan C-H (stretching vibration)
O
NH3 H + H H H
H
O O
H
OH
O
NH3 H + H H H
H
O O
H
OH
O
NH3 H + H H H
H O H
OH O
H
OH
2 +
OH O O- O
P
O O
P
OH O- O
P O 2 H
n Kitosan n
Tripolifosfat
O
NH3+ H H H H
H
O O
H
OH
O
NH3 H + H H H
H
O O
H
OH
O
NH3 H + H H H
H O H
OH
OH
OH O O-
O P
O O
P
OH O- O
P O H OH
O O-
O P
O O
P
OH O- O
P O H
O H NH3+
H H
H H
O
OH
O H O
NH3 +
H H
H O
OH
O H O
NH3+
H H
H OH
O H O
H H
OH
H H
n n
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
%Transmitansi
Bilangan Gelombang (cm-1)
a b c
Gambar 4. Spektra FTIR: a) kitosan standard (komersial); b) kitosan hasil sintesa; dan c) kitosan tripolifosfat
Tabel 2. Gugus fungsional kitosan hasil sintesis
Gugus Fungsi
Bilangan Gelombang (cm-1)
Kitosan Kitosan tripolyphosphate Standard Sintesis
O-H 3420,90 3429,58 3384,25
N-H 1608,70 1592,31 1568,16
C=O 1608,70 1655,00 1645,35
P-OH - - 1031,00
P-O-P - - 923,94
P=O N-O-P
- -
- -
1151,55 1568,16
Pada spektra kitosan hasil sintesa dengan bilangan gelombang 3429,58 cm-1 menunjukkan gugus -OH dan -NH2 (stretching). Namun, pada sampel kitosan tripolifosfat pita serapan menjadi lebar dan bergeser ke bilangan gelombang yang lebih rendah yaitu 3384,25 cm-1. Hal ini menunjukkan adanya peningkatan interaksi ikatan hidrogen (Rampino dkk, 2013). Pada bilangan gelombang 1151,55 cm-1 menunjukkan P=O (stretching) yang merupakan hasil cross-linking antara kitosan dengan TPP (Antoniou dkk, 2015). Pada spektra FTIR kitosan puncak –NH gugus amina (bending vibration) pada bilangan gelombang 1592,31 cm-1 dan ikatan C=O dari gugus amida pada bilangan gelombang 1655,00 cm-1 mengalami pergeseran menjadi 1568,16 cm-1 dan 1645,35 cm-1, berturut-turut.
Terbentuknya cross-linking N-O-P (bending vibration) muncul pada bilangan gelombang 1568,16 cm-1 menggantikan H pada –NH yang
merupakan gugus pergi yang baik, sehingga mengalami peningkatan energi vibrasi yang ditandai dengan munculnya satu peak tunggal. Pergeseran yang terjadi menandakan adanya interaksi cross-linking antara ion ammonium dari kitosan dan ion fosfat dari TPP (Zeng dkk, 2009).
4.2.2 Analisis XRD (X-Ray Diffraction)
Pola difraksi Sinar-X kitosan standard (komersial) dan kitosan - tripolifosfat ditunjukkan pada Gambar 5. XRD dari kitosan komersial menunjukkan karakteristik puncak difraksi pada 2θ = 20,062º yang sedikit bergeser ke sudut difraksi yang lebih tinggi yang berarti menunjukkan kristalinitas yang tinggi. Puncak difraksi kitosan tripolifosfat (Gambar 5b) terlihat pada 2θ = 20,357º yang merupakan karakteristik struktur armof.
Kitosan – tripolifosfat terdiri dari struktur jaringan padat rantai polimer interpenetrasi yang saling berikatan silang (cross-linking) oleh ion lawan TPP (Manikandan & Sathiyabama, 2016)
20 40 60
Intensitas (a.u.)
2Theta)
b
a
Gambar 5. Difragtogram sinar-X: (a) XRD kitosan standard (komersial) dan (b) kitosan tripolifosfat
4.2.3 Analisis TEM (Transmission Electron Microscope)
Transmission Electron Microscope digunakan untuk konfirmasi
yang paling penting dalam sistem nanopartikel karena dapat menentukan distribusi in vivo, toksisitas, pelepasan obat, dan kemampuan untuk targetting dari sistem nanopartikel. Nilai ini sudah memenuhi standard nanopartikel menurut Jonassen dkk., (2012) yaitu ukuran sifat fisikokimia kitosan nanopartikel berukuran 1 – 1000 nm. Hal ini juga ditambahkan oleh Jeevanandam dkk., (2018) untuk nanopartikel dari fibril selulosa yang mengandung segmen kristal dan amorf memiliki ukuran partikel 100 – 1000 nm.
Metode preparasi dalam pembuatan nanopartikel dengan magnetic stirrer dapat menghasilkan partikel yang stabil dengan ukuran yang lebih seragam yaitu kurang dari 1000 nm (Al-Remawi, 2021)
Gambar 6. Citra TEM nano kitosan tripolifosfat perbesaran 10.000x
Pada penelitian ini, sintesis nano kitosan tripolifosfat menggunakan magnetic stirrer dengan kecepatan 800 rpm selama 1 jam menghasilkan ukuran nanopartikel dibawah 1000 nm. Penelitian Fàbregas dkk (2013) memperoleh ukuran partikel untuk kitosan tripolifosfat sebesar 105 nm dan 201 nm dengan menggunakan magnetic stirrer dengan kecepatan 800 rpm.
Penelitian Suptijah dkk (2011) nano kitosan tripolifosfat dari cangkang udang yang dihasilkan dengan perlakuan magnetic stirrer rata – rata berukuran 400 - 450 nm. Semakin cepat putaran maka akan memperbesar intensitas molekul pelarut untuk bersentuhan dengan kitosan, sehingga semakin besar intensitas kecepatan putaran pada magnetic stirrer partikel
yang dihasilkan semakin kecil. Jika di bandingan dengan penelitian Talu’mu (2016) proses preparasi nano kitosan tripolifosfat menggunakan sonokimia, gelasi ionotropik dan kompleks polielektrolit menghasilkan ukuran kitosan nanopartikel yang berbeda – beda yaitu 800 nm, 500 nm dan 600 nm. Dalam penelitiannya juga Tala’mu (2016) menyatakan bahwa besarnya ukuran partikel nano kitosan - tripolifosfat disebabkan karena kitosan memiliki bobot molekul yang cukup besar, sehingga ukuran partikel nano kitosan – tripolifosfat yang dihasilkan cukup besar tetapi masih berada dalam kisaran nanometer (nm)
4.3 Uji Aktivitas Antibakteri
Bentuk fisik kitosan dimodifikasi menjadi nanopartikel untuk meningkatkan aktivitas antibakteri pada kitosan, karena semakin kecil ukuran partikel kitosan, maka semakin tinggi aktivitas antibakteri dari kitosan tersebut (Komariah, 2014).
Nano kitosan – tripolifosfat hasil sintesis dilakukan pengujian antibakteri terhadap bakteri bau badan yakni P.aeruginosa.
Tabel 3. Daerah Daya Hambat Kitosan dan Nano Kitosan Tripolifosfat Rata – rata DDH ( ±SE) (mm)
Bakteri Nano Kitosan – Tripolifosfat K (+)
Gel 0,5% 1% 1,5% 2%
P.
aeruginosa
13,3 ± 0,38
10,16 ± 0,17
10,36 ± 0,18
10,4± 0,2 10,4 ± 0,2
+
Pada Tabel 3. dapat dilihat bahwa adanya perbedaan daerah daya hambat yang terjadi pada masing – masing konsentrasi nano kitosan tripolifosfat. Hal ini dipengaruhi oleh konsentrasi nano kitosan tripolifosfat yang digunakan semakin besar sehingga meningkatkan daya hambat pertumbuhan bakteri. Kitosan memiliki daya antibakteri yang kuat karena memiliki gugus polikationik yang aktif berinteraksi sehingga menyebabkan gangguan kesetimbangan ionik pada membran sel bakteri. Jika interaksi gugus polikation (NH3+) dan membran
kitosan menjadi monomer glukosa karena memiliki ikatan glikosida 1,4β sehingga kemungkinan masa hidup sel bakteri telah habis namun ikatan glikosida antarmonomer pada kitosan belum terurai (Yudhasasmita & Nugroho., 2017).
Nano kitosan tripolifosfat memiliki afinitas yang tinggi terhadap sel bakteri, karena luas permukaan nano kitosan tripolifosfat yang lebih besar, nanopartikel dapat teradsorpsi erat ke permukaan sel bakteri sehingga menyebabkan ketidakstabilan membran sel yang akan menyebabkan kebocoran komponen intraseluler sehingga membunuh sel bakteri (Qi dkk., 2004).
Tabel 4. Kategori penghambatan antimikroba berdasarkan diameter zona hambat (Ambarwati., 2007)
Diameter (mm) Respon Hambatan Pertumbuhan
5 mm Lemah
5 – 10 mm Sedang
10 – 20 mm Kuat
20 mm Sangat Kuat
Dalam ukuran nano, interaksi tersebut diharapkan mengalami peningkatan intensitas sehingga menghasilkan daya antibakteri yang mengalami peningkatan kekuatan. Pada penelitian ini, dihasilkan daya antibakteri nano kitosan tripolifosfat pada kisaran sedang hingga kuat terhadap bakteri Pseudomonas aeruginosa. Hal ini disebabkan dinding sel bakteri P. aeruginosa memiliki tingkat sensitifitas yang tinggi terhadap perlakuan fisik, enzim dan antibiotik. Dinding sel yang dimiliki oleh P. aeruginosa lebih komplek dan mengandung senyawa komponen lipid yang lebih banyak. Lapisan ini pada bakteri ini melindungi sitoplasma dari lingkungannya dan mempunyai sistem selektif terhadap zat – zat asing pada lapisan lipopolisakarida. Sifat selektif dari bakteri Gram-negatif memberikan manfaat dalam sistem pertahanannya (Widyana dkk., 2014). Menurut Ambarwati (2007) aktivitas antibakteri yang kuat menghasilkan diameter zona hambat 10 – 20 mm, jika dibandingkan dengan hasil yang diperoleh maka aktivitas antibakteri memiliki antibakteri yang kuat terhadap bakteri bau badan.
