sebanyak 5,0 µ L, 10mM dNTP mix (konsentrasi akhir 0,3mM) 0,75µ l, 10µ M primer (konsentrasi akhir 0,3µ M) 0,75µl, Template DNA (100ng) 0,5µ l, dan 0,5µl. KAPAHifi DNA Polymerase (1U/µl).
Sekuensing DNA dan Analisis Bioinformatika
Pengurutan DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan memanfaatkan jasa perusahaan sekuensing 1st Base di Singapura. Sekuen yang diperoleh dijajarkan dengan data pada GenBank menggunakan program Blast-N, Blast-X dari situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) melalui http://www.ncbi.nlm.nih.gov. untuk mengetahui tingkat kemiripan gen nifD dari isolat yang dianalisa. Penurunan sekuen DNA menjadi protein dilakukan menggunakan Expasy translate tools. Konstruksi pohon filogenetik dilakukan dengan menggunakan program MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007), metode Neighbor Joining (NJ) dengan bootstrap 100x, sedangkan analisis protein dilakukan menggunakan Conserved Domain (CDD) dan SCAN PROSITE. Visualisasi struktur protein menggunakan program Cn3D 4.1.
HASIL DAN PEMBAHASAN
HasilIsolasi, Amplifikasi Gen nifD, dan Visualisasi Amplikon
Amplifikasi gen nifD dari kedua isolat Metanotrof dengan menggunakan primer nifHD-F dan nifD-R dapat dilakukan. Hasil visualisasi amplikon pada gel elekroforesis yang diamati di atas UV transluminator memperlihatkan adanya pita DNA berukuran ~1.9 kb (Gambar 1).
Sekuensing DNA dan Analisis Bioinformatika
Produk amplifikasi gen nifD disekuen untuk mengetahui urutan nukleotidanya. Sekuen yang diperoleh (Lampiran 1) dianalisis kemiripannya dengan data di GenBank menggunakan program BLAST-N dan Blast-X (Tabel 1, Tabel 2, dan Lampiran 2). Berdasarkan analisis program tersebut diketahui homologi nitrogenase dari isolat yang diuji.
Gambar 1 Amplifikasi gen nifD menghasilkan pita DNA berukuran ~1.9 kb (Keterangan : M= 1 kb ladder, Sumur 1=BGM 3, Sumur 2 =BGM 9).
Tabel 1 Hasil analisis sekuen gen nifD dengan menggunakan program BLAST-N Isolat Sekuen nitrogenase bakteri yang homolog %identitas No. akses BGM 3 Nitrogenase molybdenum-iron protein alpha chain (nifD) pada Xanthobacter autotrophicus Py2 92% CP000 781.1 BGM 9 Nitrogenase molybdenum-iron protein alpha chain (nifD) pada Xanthobacter autotrophicus Py2 91% CP000 781.1
M 1 2
~1,9 kb
Tabel 2 Hasil analisis sekuen gen nifD dengan menggunakan program BLAST-X Isolat Sekuen nitrogenase bakteri yang homolog %identitas No. akses BGM 3 Nitrogenase molybdenum-iron protein alpha chain (nifD) pada Xanthobacter autotrophicus Py2 72% YP_00 14150 05.1 BGM 9 Nitrogenase molybdenum-iron protein alpha chain (nifD) pada Xanthobacter autotrophicus Py2 71% YP_00 14150 05.1
Analisis sekuen gen nifD menunjukkan bahwa BGM 3 dan BGM 9 memiliki gen nifD yang homolog dengan gen nifD Xanthobacter autotrophicus Py2 (Lampiran 2). Berdasarkan analisis filogenetik, gen nifD BGM 3 dan BGM 9 berkerabat dekat dengan Xanthobacter autotrophicus Py2 dan Bradyhizobium japonicum USDA 110 (Gambar 2). Gen nifD BGM 3 dan 9 termasuk superfamili protein Oxidoreductase nitrogenase dan sub famili Nitrogenase MoFe (Gambar 3).
Pada Nitrogenase MoFe alpa BGM3 dan BGM9 memiliki gugus 4Fe-4S ferredoxin-type iron-sulfur binding region (4Fe4S_FER_1) dan gugus 2 Fe-2S ferredoxin-type iron-sulfur binding region (Tabel 3).
Gambar 2 Filogenetik gen nifD metanotrof BGM 3 dan BGM 9 yang dibandingkan dengan gen nifD beberapa spesies bakteri diazotrof menggunakan metode Neighbor Joining (NJ) dan boostrop 100x
Gambar 3 Analisis bioinformatik protein turunan sekuen gen nifD BGM 3 dan BGM 9 dengan menggunakan program CDD (Conserved Domain)
Tabel 3 Analisis bioinformatik protein hasil translasi gen nifD BGM 3 dan BGM 9 dengan menggunakan program SCAN PROSITE
Klaster pada domain
Motif sekuen Urutan sekuen No. Akses 4Fe4S_FER_1 CgGCGgCGtGCG 62-73 PS00198 2FE2S_FER_1 CTGGGCGGC, CTGATCTAC, CTGGTCGTC, CTGAACGTC, CTGGTCGGC 75-83, 159-167, 1236-1244, 1339-1347, 1792-1800 PS00197
4
4
Gambar 4 Struktur kuartener nitrogenase Fe-Mo Alpa dengan menggunakan program Cn3D 4.1 (Keterangan : Warna kuning = Interaksi Fe-Mo sub unit alpa and
beta, A = dimer protein Fe-Mo, B = residu FeMoCo terikat, C = residu kluster P sub unit alpa terikat , D = Fe-Mo sub unit alpa/ kontak protein Fe, E = helix alpa, dan F = lembar beta ).5
A
B
C
F
D
E
Pembahasan
Amplifikasi gen nifD dengan primer nifHD-F dan nifD-R menghasilkan amplikon berukuran 1,9kb untuk BGM 3 dan BGM 9 (Gambar 1). Primer tersebut didesain dari sekuen nifH ke 436 dan sekuen nifD Bradyrhzobium japonicum USDA 110 sehingga menghasilkan amplikon rata-rata sebesar 1,9 kb. Amplikon ini didapat jika nifD, nifH, dan nifK terletak dalam satu operon (Dedysh et al. 2004). Transkripsi enzim nitrogenase pada α dan γ proteobakteria dikodekan oleh operon nifHDK. Sedangkan pada diazotrof simbiotik yang tumbuh lambat enzim ini dikodekan oleh dua operon yang berbeda yaitu operon nifH dan nifDK (Choo et al. 2003).
Analisis Filogenetik menunjukkan bahwa BGM 3, BGM 9 dan Xanthobacter autotrophicus py2 dan Bradyrhizobium japonicum USDA 110 berkerabat dekat bila dilihat dari perkembangan gen nifD nya. (Gambar 2). BGM 3, BGM 9 dan Xanthobacter autotrophicus Py2 merupakan diazotrof yang hidup bebas sedangkan Bradyrhzobium japonicum USDA 110 merupakan diazotrof yang bersimbiosis dan memiliki operon nifH yang terpisah dari nifDK. Berdasarkan analisis gen 16S- rRNA isolat BGM 3 memiliki kemiripan terdekat dengan Methylocystisparvus strain 57 (69%), sedangkan BGM 9 memiliki kemiripan dengan Methylococcus capsulatus strain texas (83% dan 85%) (Astuti 2009). Nilai kemiripan sekuen nifD BGM 3 dan BGM 9 lebih tinggi dari analsis 16S-rRNA tersebut. Sehingga kemungkinan BGM 3 dan BGM 9 memiliki nenek moyang bakteri pemfiksasi nitrogen yang sama dengan Xanthobacter autotrophicus py2 dan Bradyrhizobium japonicum USDA 110.
Penelitian yang dilakukan Dedysh et al. (2004) juga menunjukkan bahwa nilai kemiripan (identity values) dari sekuen nifH dan nifD pada Methylocapsa acidiphila B2 dan Beijerinckia lebih tinggi (98.5 % dan 96.6 %) dibandingkan dengan hubungan kekerabatannya berdasarkan 16S rRNA sehingga kemungkinan dua bakteri tersebut berasal dari nenek moyang bakteri pemfiksasi nitrogen yang sama.
Nitrogenase oxidoreduktase merupakan sekelompok famili protein yang mengkatalisis reduksi nitrogen menjadi amonium dengan menggunakan ATP.
Selain ATP, proses tersebut membutuhkan feredoksin tereduksi sebagai donor elektron, sitokrom sebagai protein pembawa elektron, dan koenzim. Proses fiksasi satu mol nitrogen ini memerlukan energi sel sebanyak 16 ATP.
Oxidoreduktase memiliki sub unit alpa dan sub unit beta dari komponen I yang secara genetik terbagi atas nitrogenase yang tergantung pada atom molibdenum (Mo-nitrogenase), nitrogenase yang tergantung pada atom vanadium (V-nitrogenase), dan nitrogenase besi (Fe-nitrogenase). Nitrogenase alternatif vanadium dan nitrogenase yang hanya mengandung besi saja masing-masing dikodekan oleh gen vnf dan anf dan mempunyai struktur heksamer yang dikodekan oleh operon vnfDGK dan anfDGK. (Caton 2007). Selain itu terdapat beberapa sub unit Protochlorophyllide (Pchlide) reductase and chlorophyllide (chlide) reductase (Gambar 3).
Nitrogenase Fe-Mo terdiri dari dua komponen protein terlarut yaitu komponen I atau alpa berupa protein Fe-Mo dan komponen II atau beta yaitu protein Fe (Gambar 3). Fe-Mo alpa mempunyai berat molekul antara 220-250 kD. Sub unit ini berbentuk tetramer dengan dua metallo-komplek heterodimer yang disebut klaster fosfat (P) dan kofaktor besi molibdenum (FeMo- co). Satu subunit memiliki sepasang α-β dan sepasang klaster P dan molekul FeMo-co. Molekul FeMo-co terdiri dari satu gugus homositrat dan MoFe3-S3 (Caton 2007). Selain klaster P pada Nitrogenase MoFe alpa BGM3 dan BGM9 ditemukan juga klaster 4Fe-4S ferredoxin-type iron-sulfur binding region (4Fe4S_FER_1) dan klaster 2 Fe-2S ferredoxin-type iron-sulfur binding region (Gambar 4). Klaster tersebut dimiliki oleh protein Fe. Protein Fe memiliki dua subunit α identik yang mempunyai gugus 4Fe-4S ditengah. Protein tersebut juga memiliki dua situs pengikatan Mg-ATP yang terletak di setiap subunit, dimana 4Fe-4S adalah donor elektron untuk komplek Fe-Mo. Oleh karena itu, protein ini sangat esensial untuk proses fiksasi nitrogen (Caton 2007). 2Fe2S feredoksin berperan dalam proses katabolisme NAD+ pada kondisi mikroaerofilik dengan mereduksi 6-hydroxynicotinate menjadi 1,4,5,6-tetrahydroxy-6-oxonicotinate. Metabolisme NAD+ dilakukan untuk memenuhi kebutuhan akan nitrogen, karbon, dan energi sel (Alhapel 2006) (Tabel 3).
