commit to user 29 BAB III
METODE PENELITIAN
A. RANCANGAN PENELITIAN
Penelitian ini adalah studi Cross Sectional . B. TEMPAT DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian dilakukan di rumah sakit Dr. Moewardi Surakarta, waktu penelitian bulan april 2014 sampai jumlah subjek terpenuhi.
C. POPULASI PENELITIAN
Populasi target penelitian adalah pasien TB MDR. Populasi terjangkau adalah pasien TB MDR yang menjalani perawatan di RSUD Dr. Moewardi Surakarta. Penderita bekas tuberkulosis (sudah sembuh) dan subjek kontrol sehat.
D. PEMILIHAN SAMPEL
Sampel penelitian adalah pasien TB MDR yang menjalani pengobatan di RSUD Dr. Moewardi Surakarta, penderita bekas tuberkulosis dan kontrol sehat sampai memenuhi jumlah sampel yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi. Pengambilan sampel dilakukan dengan cara purposive sampling.
E. BESAR SAMPEL
Besar sampel penelitian analitik kategorik tidak berpasangan, dengan rumus sebagai berikut (Dahlan, 2010):
(Z√2PQ +Z√P1Q1+P2Q2)2
n = n1 =
( P1-P2 )2
n = besar sampel
Z = Deviasi baku alfa, kesalahan tipe I sebesar 5%, sehingga Z= 1.64 Zβ = Deviasi baku beta, kesalahan tipe II sebesar 20%, sehingga Z= 0,84 P1 = proporsi kelompok kasus yang merupakan asumsi peneliti
P2 = Proporsi kelompok kontrol diketahui dari pustaka Q 1 = 1-P1
commit to user P1-P2 = selisih proporsi yang dianggap bermakna P = Proporsi total (P1+P2)/2
n = sampel.
Berdasarkan perhitungan diatas minimal besar sampel penelitian perkelompok adalah 28 subjek.
F. KRITERIA INKLUSI, EKSLUSI DAN DROP OUT 1. Kriteria inklusi:
Usia > 18 tahun .
Penderita TB MDR .
Bekas tuberkulosis (sembuh).
Subjek kontak erat dengan penderita tuberkulosis dalam pemeriksaan foto toraks normal.
bersedia ikut penelitian. 2. Kriteria eksklusi:
Penderita HIV
Penderita DM
Tidak bersedia ikut penelitian. 3. Kriteria drop out:
Penderita yang memutuskan untuk tidak melanjutkan prosedur penelitian.
G. VARIABEL PENELITIAN
1. Variabel bebas : polimorfisme gen HLA DQB1*0503. 2. Variabel tergantung : TB MDR dan kadar interferon gamma
H. DEFINISI OPERASIONAL
1. Polimorfisme gen HLA DQB1*0503 adalah variasi genetik gen HLA DQB1 yang dibuktikan dengan kecocokan pemeriksaan gen dibandingkan primer alel tersebut dengan teknik PCR. Alat ukur : PCR. Skala pengukuran : nominal.
2. TB MDR adalah penderita yang dinyatakan sakit tuberkulosis terbukti resisten terhadap rifampisin dan isoniazid berdasarkan hasil pemeriksaan kultur dan uji kepekaan obat. Alat ukur : catatan medis penderita yang mencakup hasil kultur dan uji kepekaan obat. Skala pengukuran : Nominal.
commit to user
3. Kadar interferon gamma adalah kadar sitokin interferon gamma dalam plasma yang diukur dengan pemeriksaan ELISA, satuan pengukuran picogram/mililiter (pg/ml). Skala pengukuran : rasio.
4. Kontrol sehat (tidak sakit tuberkulosis) : subjek penelitian berdasarkan pemeriksaan anamnesis diketahui mempunyai kontak erat dengan penderita tuberkulosis. Definisi kontak erat adalah subjek yang tinggal satu ruangan dengan penderita selama beberapa jam sehari (Kemenkes, 2013). Hasil pemeriksaan radiologis toraks normal. Skala pengukuran : nominal.
5. Bekas tuberkulosis: Penderita dengan riwayat minum OAT selama 6 bulan, dan pemeriksaan dahak BTA dinyatakan negatip, foto toraks tidak terdapat lesi aktif. Skala pengukuran : nominal.
I. PROSEDUR PENGAMBILAN DATA
1. Penderita yang datang ke RSUD Dr. Moewardi Surakarta yang telah terdiagnosis TB MDR sebagai subjek diberikan penjelasan tentang tujuan penelitian.
2. Penderita yang diketahui pernah didiagnosis tuberkulosis, mendapat pengobatan OAT 6 bulan lengkap, foto toraks tidak ada lesi aktif, hasil pemeriksaan sputum BTA sebanyak 3 kali dinyatakan negatip dicatat sebagai kasus bekas tuberkulosis. 3. Subjek kontrol sehat dilakukan anamnesis mengenai riwayat kontak dengan
penderita tuberkulosis, gejala tuberkulosis, kemudian dilakukan pemeriksaan foto toraks jika hasil dalam batas normal ditetapkan sebagai kontrol penelitian.
4. Dilakukan pencatatan meliputi umur, jenis kelamin, suku, berat badan, tinggi badan, indeks massa tubuh (IMT), kebiasaan merokok, riwayat pengobatan OAT, penyakit penyerta seperti DM, status HIV.
5. Subjek yang sesuai kriteria inklusi dan bersedia ikut dalam penelitian diminta untuk menandatangani lembar persetujuan (informed concern).
6. Semua subjek diambil darah vena sebanyak 5 cc dengan spuit steril, kemudian dikirim ke laboratorium biomedik Universitas Negeri Sebelas Maret untuk pemeriksaan PCR.
7. Pemeriksaan kadar sitokin interferon gamma hanya dilakukan pada sampel darah kelompok kasus TB MDR.
commit to user
J. TEKNIK PEMERIKSAAN
1. Pemeriksaan HLA a. Cara isolasi DNA
- 5 ml darah diambil dan dimasukkan ke dalam tabung ACD-A/B (berisi antikoagulan ACD/ajd citrate dextrose) kemudian digoyang-goyangkan sampai homogen.
- Darah dicentrifugasi dengan kecepatan 1800 rpm selama 10 menit
- Lapisan putih (bufi coat) sebanyak 500 ul dan ditambahkan dalam 1 ml larutan pelisis.
- Campuran ini dicentrifugasi pada 5000 rpm, 1 menit, dan supermatan dibuang. Langkah ini diulangi sampai semua sel darah merah lisis (tidak lebih dari 3 kali).
- Ke dalam ditambahkan berturut-turut DD2H2O, proteinase K, SDS 10 %,
Gunanidine HCL 7,5 M( divorteks setiap selesai pencampuran zat)
- Campuran diinkubasi pada suhu 68-70 0C selama 15 menit (setelah 10 menit campuran digoyang-goyang).
- Supernatan yang mengandung DNA ini diukur rapat optiknya presipitasi dengan menambahkan etanol 100 % dan menggoyang tabung bolak-balik menggunakan tangan, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan tinggi 14.000 rpm, 2 menit, supermatan dibuang.
- Diulangi dengan etanol 70 %, disentrifugasi 14.000 rpm, 2 menit, supermatan dibuang.
- Pelet DNA (ada di dasar tabung) dikeringkan dengan membalikan tabung diatas kertas tisu selama 2 menit.
- DNA disuspensi dengan 100 ml DDH2O dan diinkubasi pada suhu 0-700C selama 3-30 menit.
- Konsentrasi dan kemurnian DNA ditentukan dengan mengukur rapat optiknya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 dan 280 nm.
- DNA bisa disimpan pada refrigerator bila tes untuk diidentifikasi akan dilakukan dalam waktu yang tidak lama (dibawah 6 bulan) atau di revco (-700C) untuk penyimpanan jangka panjang (di atas 6 bulan).
commit to user
b. Amplifikasi DNA dengan teknik PCR. Amplifikasi ini didasarkan pada pengulangan suatu siklus yang terdiri dari 3 tahap yang masing-masing berhubungan dengan kondisi temperatur yang terkontrol. Tahap tersebut terdiri dari denaturasi protein, penempelan primer, dan tahap ekstensi. Hasil amplifikasi DNA pada siklus pertama dapat berfungsi sebagai cetakan bagi siklus berikutnya dan sterusnya sehingga jika dilakukan sebanyak n siklus dalam suatu reaksi PCR maka di dapat penggandaan DNA. Tenik amplifikasi DNA yaitu:
- Sampel DNA dibuat pada konsentarasi 40 ug/ml dengan pengencer DDH2O.
- Diambil 130 ul dan sampel DNA ditambahkan 3 ul kontrol positif, β-actin (termasuk dalam kit), ukuran pita DNA posisi 505 bp.
- Campuran sampel DNA ini diletakkan di atas sand block selama 5 menit pada suhu 940C dan segera diletakkan diatas es.
- Di tambahkan 2 ul taq DNA polymerase.
- Campuran ini sebanyak 5 ul ditambahkan ke setiap campuran reaksi PCR sebelumnya.
- Ditempatkan pada PCR thermal cycler selama 32 siklus dengan menggunakan parameter denaturasi 950C 1 menit, annealing 50-650C 30 detik , extension 730C 1 menit.
c. Tahap visualisai produk PCR. Tahap ini terdiri dari: Penyediaan gel agarose 3 %
- Dalam tabung erlenmeyer nusieve agrose sebanyak 3 g dilarutkan dalam 100 ml buffer TBE 1x dengan mikrowave selama 5 menit. Tabung digoyang-goyang supaya terlarut merata.
- Setelah agak dingin ditambahkan 10 ul ethidium bromide (10 mg/ml) dituangkan ke gel-casting tray yang telah diletakkan sisir yang mempunyai 26 sumur di atasnya. Gel dibiarkan dingin selama 1 jam
- Sisir diangkat dan gel ditempatkan pada tank elektroforesis.
Loading buffer
commit to user
- Dua sumur diisi dengan 10 ul penanda DNA (Phi-X 174 hae fragment posisi 72-310 bp sedangkan sisa sumur (24 sumur) diisi dengan10 ul sampel (produk PCR)
- Pada posisi bagian bawah ditambahkan 5 ul ethidium bromide DNA bergerak ke kutub positif karena DNA itu sendiri bermuatan negatif. Power supply dinyalakan dan voltase di set 150 V selama 30 menit.
d. Tahap interpretasi data. Tahap ini terdiri dari:
Gel yang telah selesai dijalankan dipindahkan dari casting-tray ke transilluminator
lampu UV akan melapor secara komputerisasi. DNA yang terikat dengan ethidium bromide dengan bantuan sinar UV akan terlihat, kemudian diambil fotonya untuk dokumentasi. Hasil dinyatakan positif jika terjadi amplifikasi pada sampel tertentu dan negatip jika tidak terjadi amplifikasi.
2. Pemeriksaan interferon gamma plasma.
Plasma akan dilakukan pemeriksaan interferon gamma dengan metode berbasis ELISA, direncanakan menggunakan Human INF-γ Quantikine ELISA Kit (RdanD System), sesuai protokol kit, sebagai berikut:
a. Siapkan semua bahan dan reagen sesuai protokol kit.
b. Tambahkan 100 µL Assay Diluent RD1-51 ke masing-masing sumuran. c. Tambahkan 100 µL Standar, sampel atau kontrol ke masing-masing sumuran. d. Tutup microplate dan inkubasi 2 jam dalam suhu ruang
e. Aspirasi dan cuci masing-masing sumuran dengan Wash Buffer (400 µL) sebanyak tiga kali.
f. Tambahkan 200 µL INF-γ Conjugate ke masing-masing sumuran. Tutup microplate dan inkubasi dalam suhu ruangan.
g. Aspirasi dan cuci masing-masing sumuran dengan Wash Buffer (400 µL) sebanyak tiga kali.
h. Tambahkan 200 µL Subtrate Solution ke masing-masing sumuran. Inkubasi 30 menit dalam suhu ruangan. Lindungi microplate dari cahaya.
commit to user
j. Periksa optical density dari masing-masing sumuran dalam 30 menit, menggunakan ELISA Reader pada panjang gelombang 540 nm-570 nm.
K. ETIKA PENELITIAN
Penulis mengajukan persetujuan penelitian ke Panitia Kelaikan Etik Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta sebelum dilakukan penelitian. Setiap subjek penelitian diberikan penjelasan yang benar dan terperinci tentang tujuan dan manfaat penelitian sebelum dilakukan prosedur penelitian, setelah subjek mengerti dan setuju mengikuti penelitian, subjek diminta menandatangani lembar persetujuan dan isian data penderita.
L. ANALISIS DATA
Data yang didapatkan dilakukan analisis dengan program SPSS Statistic 22.0 . Data numerik penelitian dinilai apakah distribusinya normal atau tidak dengan uji
Kolmogorov-Smirnov (>50 sampel) atau Saphiro Wilk (<50 sampel). Uji beda variabel kategorik antar kelompok dilakukan dengan uji Chi Square, jika syarat uji Chi Square
tidak terpenuhi bisa dilakukan uji alternatif memakai uji Fisher (Dahlan, 2010). Untuk menilai kerentanan faktor risiko terhadap kasus tuberkulosis dan TB MDR dilakukan perhitungan Odd ratio (OR) dengan tabel 2x2. Uji beda kadar interferon gamma TB MDR antara polimorfisme HLA DQB1*0503 dan tidak polimorfisme menggunakan uji
indepent t jika tidak memenuhi syarat dianalisis dengan uji Mann Whittney. Batas kemaknaan:
- nilai p > 0,05: tidak bermakna.
commit to user M. ALUR PENELITIAN
Uji beda Uji beda
Penjelasan, penawaran persetujuan
(informed concern) Tb MDR
Hasil DST resisten Rdan H
Tidak setuju ikut
penelitian Eksklusi Setuju ikut penelitian Pemeriksaan polimorfisme HLA DQB1*0503 Kontrol sehat Foto toraks normal, kontak (+)
Data dasar (Umur, kebiasaan merokok, IMT, riwayat OAT dll)
Analisis statistik
Pemeriksaan kadar IFN-γ plasma
Bekas Tb Riw OAT (+),foto lesi
aktif (-), BTA (-)
Memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi
