BAB II. KLASIFIKASI BIOASSAY A. Bioassay Kualitatif
Bioassay kualitatif merupakan cara pemeriksaan kualitatif obat/sediaan obat atau wadah obat (alat-alat infuse, injeksi) dengan memanfaatkan fenomena biologis yang timbul.
Termasuk dalam bioassay kualitatif diantaranya: 1. Uji pirogen
2. Uji sterilitas 3. Uji mikrobia 4. Uji toksisitas
5. Penetapan angka antigen 1. Uji Piroqenitas
- Uji pirogenitas yaitu: uji yang dilakukan untuk mengetahui apakah suatu Sediaan Uji Steril bebas pirogen atau tidak
- Cara pengujian: dengan mengukur peningkatan suhu badan kelinci yang disebabkan penyuntikan intravena sediaan uji steril
- Hewan percobaan: kelinci (syarat: seminggu sebelum pengujian tidak menunjukkan penurunan bobot badan)
Hewan percobaan tidak dapat digunakan jika:
a. Tiga hari sebelumnya dipakai untuk pengujian pirogenitas, hasil negative
b. Tiga minggu sebelumnya digunakan untuk pengujian pirogenitas sediaan uji tidak memenuhi syarat
c. Telah digunakan kapan saja untuk pengujian pirogenitas tetapi respon rata-rata kelompok kelinci melebihi 1,2°
- Alat: 1. Termometer atau termometer listrik - ketelitian skala 0,1°
- dapat dimasukkan ke dalam rektum kelinci sedalam ± 5 cm 2. Alat suntik (terbuat dan kaca atau bahan lain yang cocok,
tahan pemanasan pada suhu 25°
- Sediaan uji: dibuat dari zat uji dengan melarutkan atau mengencerkannya menggunakan larutan natrium klorida P steril
bebas pirogen atau jika zat uji berupa larutan yang sesuai dapat langsung digunakan
- Pengujian, pengujian meliputi dua tahap yaitu:
1. Pendahuluan: hewan uji disuntik dengan larutan NaCI P steril bebas pirogen (10 mlIkgBB, Lv.) 1-3 han sebelum pengujian 2. Pengujian Utama: sediaan uji (dihangatkan, ± 38,5°) Disuntikkan
perlahan ke dalam vena auricularis tiap kelinci dan dilakukan evaluasi
- Penafsiran hasil ( penafsiran hasil dilakukan menurut Farmakope Indonesia Edisi Ill atau IV). Penafsiran hasil dibedakan untuk:
1. hewan percobaan (kelinci) 2. sediaan uji
Persyaratan penafsiran hasil pembacaan suhu (respon) dibaca sesuai petunjuk dan dibandingkan dengan daftar pada tabel I.1.
Tabel I.1 Jumlah
kelinci Sediaan uji memenuhi syarat jika jumlah respon tidak melebihi
Sediaan uji tidak memenuhi syarat jika jumlah respon
melebihi 3 1,20o 2,70o 6 2,80o 4,30o 9 4,50o 6,0o 12 6,60o 6,60o 2. Uji SterilItas
- Maksud Uji: untuk menetapkan ada tidaknya bakteri, ragilyeast yang hidup dalam sediaan zat yang diperiksa
- Jumlah sampel: kecuali dinyatakan lain digunakan jumlah sampel seperti tertera dalam tabel 12.
Table I.2
Jumlah wadah dalam bets Jumlah bagian sampel <100 100% atau 4, diambil yang lebih besar
100 – 500 10
>500 2% atau 20, diambil yang kecil
- Sediaan Uji: dibuat menggunakan zat uji sejumlah tertera pada table 1.3 atau sisa pada membran penyaring 450 nm yang diperoteh sebagai berikut: 1. Zat uji berupa larutan atau cairan (> 10 ml) disaring lebih dahulu dengan
2. Zat uji berupa serbuk: dilarutkan atau menggunakan pelarut steril yang cocok
3. Larutan atau suspensi minyak: dikocok dahulu yang cocok, disaring melalui penyaring membrane
Table I.3
Jumlah zat uji dalam wadah Jumlah zat yang diperlukan untuk Uji kuman Uji jamur dan ragi Cairan
kurang dan 1 ml Semua isi Semua isi
tidak kurang dari 1 ml
tidak kurang dari 4 ml Separo isi Separo isi tidak kurang dari 4 ml
tidak kurang dari 20 ml 2 ml 2 ml
lebih dari 20 ml 10% dari isi 10% dari isi Padat
kurang dari 50 mg Semua isi Semua isi
tidak kurang dari 50 mg
tidak lebih dari 200 mg Separo isi Separo isi
Lebih dari 200 mg 100 mg 100 mg
- Medium Perbenihan ( Ada dalam daftar Farmakope Edisi III) - Kuman Indikator
1. B. aerob : - Bacillus substillis DKBS - Sarcina lutea DKSL
2. B. anaerob : - Bacteoroides vulgatus DKBV - Clostridium sporogenes DKCS 3. Ragi/yeast dan jamur: Candida albicans DKCA - Uji Pendahuluan: (Fl ed. III)
- uji fertilitas medium perbenihan - uji efektifitas medium perbenihan
- Penafsiran Hasil: Zat uji dinyatakan memenuhi syarat stenlitas, jika pada masing-masing tabung tidak terdapat pertumbuhan jasad renik
3. Uji Mikrobial Uli batas jas acterioloqical test)
- Uji dilakukan untuk: menetapkan banyaknya mikroba (jasad renik) aerob hidup yang terdapat dalam zat atau untuk menyatakan zat bebas cemaran jasad renik tertentu.
a. Perhitungan banyaknya mikroba aerob: dihitung jumlah koloni pertumbuhan bakteri tiap gram atau ml sediaan yang diuji
b. Pengujian bebas jasad renik meliputi:
- uji bebas Staphyllococcus dan Pseudomonas 1. uji koagulasi (untuk Staphyllococcus aureus) 2. uji oksidase (untuk Pseudomonas aeruginosa) - uji bebas Salmonella dan Escherichia coil
Sediaan Uji dinyatakan bebas, jika tiap cawan uji tidak menunjukkan tanda-tanda seperti tertera pada persyaratan Farmakope Indonesia ed. III)
4. Uji Toksisitas
- Uji toksisitas (ketoksikan) secara umum dibedakan menjadi 2 yaitu:
1. Uji ketoksikan tak khas: uji ketoksikan akut, sub akut/sub kronis, kronis dan uji potensiasi
2. Uji ketoksikan khas, meliputi: uji keteratogenikan, kemutagenikan, kekarsinogenikan dan uji reproduksi
UJI KETOKSIKAN AKUT
- Ketoksikan akut: derajat efek toksik sesuatu senyawa yang terjadi dalam waktu singkat (24 jam)
- Takrif: uji ketoksikan sesuatu senyawa yang diberikan atau dipejankan dengan dosis tunggai pada hewan uji tertentu, dan pengamatannya dilakukan selama 24 jam
- Tujuan:
- untuk menetapkan potensi ketoksikan akut, yakni kisaran dosis letal atau dosis toksik obat terkait pada 1 jenis hewan uji atau Iebih
- untuk menilai berbagai gejala toksik yang timbul, adanya efek toksik yang khas, dan mekanisme yang memerantaral kematian
- Data:
- Tolok ukur kuantitatif : kisaran dosis Ietal/toksik,
- Tolok ukur kualitatif: gejala toksik, wujud, mekanisme efek toksik
Dosis letal tengah (LD-50) atau dosis toksik tengah (TD-50): suatu besaran yang diturunkan secara statistik, guna menyatakan dosis tunggal sesuatu
senyawa yang diperkirakan dapat mematikan atau menimbulkan efek toksik yang berarti pada 50% hewan uji
Beberapa metode yang digunakan untuk menghitung harga LD-50: 1. metode grafik Lithfield dan Wilcoxon
2. metode kertas garfik probit ogaritma (Miller -Tainter) 3. metode rata-rata bergerak Thompson-Weil
4. menurut Farmakope Indonesia
Dasar: kekerabatan antara dosis dan % hewan yang menunjukkan respon Perhitungan harqa LD-50 menurut F. I:
Log LD-50 = a-b( pi - 0,5)
a = logaritma dosis terendah yang menyebabkan jumlah kematian I 00% tiap kelompok
b = beda logaritma dosis yang berurutan
pi = jumlah hewan yang mati menerima dosis i dibagi dengan jumlah hewan seluruhnya yang menerima dosis i
Syarat:
1. Menggunakan sen dosis dengan pengenceran berkelipatan tetap 2. Jumlah hewan uji / biakan jaringan tiap kelompok harus sama
3. Dosis diatur sedemikian rupa sehingga memberikan efek 0-100%, perhitungan dibatasi pada kelompok percobaan yang memberi efek 0-100% 5. Penetapan Hayati Antigen dan Zat Anti
Antigen : senyawa asing yang masuk/dimasukkan ke dalam tubuh dan menyebabkan timbulnya respon
Hewan percobaan : Kecuali dinyatakan lain, digunakan marmut atau mencit yang memenuhi persyaratan berikut:
Marmut : Sehat, bobot tidak kurang dr 250 g; untuk perc. kutit, digunakan marmut putih atau berwarna muda; untuk percobaan. Bebas keracunan, bobot tidak lebih dr 350 g. Mencit : Sehat, bobot tidak kurang dan 17 g dan tidak lebih dan 20
g, umur dan galur seragam
Syarat umum : hewan belum pernah diberi zat yang dapat mengganggu percobaan
Sediaan baku : Kecuali dinyatakan lain, digunakan baku yang tertera pada baku hayati dan satuan aktivitas
Penetapan hayati (PM.) antigen (Farmakope Indonesia ed. II) meliputi: 1. P. H. serum antitoksin difteri
2. P.R serum antirabies
3. P. H. serum antitoksin tetanus 4. P. H. serum antibisa ular monovalen 5. P.H. vaksin cholera
6. P.H. vaksin pertusis 7. P.H. vaksin polio
8. P.R toksin percobaan Schick B. Bioassay Kuantitatif
Bioassay kuantitatif merupakan cara penetapan potensi obat dengan mengamati efek biologis. Efek bIogis mi digolongkan dalam dua bagian besar yaitu respon farmakotogis (respon yang terjadi atau mempengaruhi satu system tertentu pada tubuh organisme) dan respon biologis (respon terjadi atau mempengaruhi pada seluruh tubuh organisme). Contoh respon farmakotogis misatnya: efek hpoglikemik insulin, efek isoproterenol pada denyut jantung, efek norepinefrin pada tekanan darah dan efek oksitosin pada kontraksi otot uterus. Contoh untuk respon biologis adalah stimutasi pertumbuhan mikro-organisme karena pemberian vitamin.
Pada bab ini akan dijelaskan tentang: 1. Hubungan dosis - respon secara kuantitatif 2. Efek quantal
3. Efek gradual
1. Hubungan Dosis-Respon
Yaitu: hubungan antara jumlah obat dan besarnya efek (respon) yang ditimbulkan
Syarat agar dapat dilakukan eveluasi hubungan dosis respon, efek obat harus memiliki 2 sifat yaitu:
a. Harus dapat diukur (bila berupa data kualitatif harus diubah ke data kuantitatif)
b. Harus mempunyai nilai Nol dapat diamati perubahan efeknya Penggambaran kurva:
- Dosis: digambar pada bagian absis (independent variable) - Efek: digambar pada sisi ordinat (dependent variable) Setelah pemberian obat:
Efek tergantung keduanya.
Respon farmakologi dapat dibedakan men 1. Graded respon (respon bertingkat) 2. Quantal respon
Respon Bertingkat
- Kenaikan dosis akan menyebabkan kenaikan respon individu secara teratur (pada satu sistem hayati)
- D1 E1 - D2 E2 - Di Ei - Dn Emax
Harus mempunyai nilai Nol pada saat Dosis = 0, sehingga perubahan dosis dapat diamati perubahan efeknya
Penggambaran kurva:
digambar pada bagian absis (independent variable) Efek: digambar pada sisi ordinat (dependent variable) Setelah pemberian obat:
Efek tergantung waktu dan dosis sehingga efek merupakan fungsi
Respon farmakologi dapat dibedakan menjadi 2: (respon bertingkat)
Kenaikan dosis akan menyebabkan kenaikan respon individu secara teratur (pada satu sistem hayati)
pada saat Dosis = 0, sehingga perubahan dosis
sehingga efek merupakan fungsi dari
Emax = 50% respon 2
ED-50 = dosis yang memberikan efek separo dan Emax
Efficacy obat : ukuran kemampuan intrinsik obat untuk menghasilkan efek (kemanjuran obat), penting dalam terapi
Potency obat :
- menunjukkan besaran dosis - kurang penting dalam terapi
- dipengaruh oleh proses absorbsi, distribusi, metabolisme dan ekskresi Suatu obat kadang memiliki efikasi lebih besar dibanding obat lain tetapi potensinya Iebih kecil, namun bisa juga memiliki efikasi dan potensi yang besar dibanding obat lain
50 = dosis yang memberikan efek separo dan Emax
ukuran kemampuan intrinsik obat untuk menghasilkan efek (kemanjuran obat), penting dalam terapi
menunjukkan besaran dosis
kurang penting dalam terapi (lebih penting efek)
dipengaruh oleh proses absorbsi, distribusi, metabolisme dan ekskresi Suatu obat kadang memiliki efikasi lebih besar dibanding obat lain tetapi
, namun bisa juga memiliki efikasi dan potensi yang nding obat lain.
ukuran kemampuan intrinsik obat untuk menghasilkan efek
dipengaruh oleh proses absorbsi, distribusi, metabolisme dan ekskresi Suatu obat kadang memiliki efikasi lebih besar dibanding obat lain tetapi
Misal : obat B (obat obat A (obat
Metode pembuatan kurva dosis Abs is
1. Linier 2. Linier 3. Log Gambar 1.
obat B (obat-obat basa lemah: morfin, digoxin, diazepam) obat A (obat-obat asam lemah: asaa salisilat, parasetamol) Metode pembuatan kurva dosis-respon
Ordinat Bentuk kurva % Emax Hiperbola Absolute Hiperbola Absolut Sigmoid
Gambar 2
Gambar 3.
C. Respon Quantal
Pada respon quantal disebut juga All or None effect
kelompok bukan perindMdu. Contoh: uji efek tidur untuk obat golongan Barbiturat, maka yang diperhatikan adalah efek bisa menidurkan atau tidak bisa, intensitas tidurnya tidak diperhatikan, sehingga data yang di
hewan uji (berapa jumlah hew
Pada respon quantal ada dua kemungkinan: yaitu ada atau tidak ada efek, All or None effect dan sistem hayati yang digunakan adalah satu kelompok bukan perindMdu. Contoh: uji efek tidur untuk obat golongan Barbiturat, maka yang diperhatikan adalah efek bisa menidurkan atau tidak bisa, intensitas tidurnya tidak diperhatikan, sehingga data yang diperoteh berupa frequensi tidur hewan uji (berapa jumlah hewan uji yang tidur dalam tiap kelompoknya).
ada dua kemungkinan: yaitu ada atau tidak ada efek, dan sistem hayati yang digunakan adalah satu kelompok bukan perindMdu. Contoh: uji efek tidur untuk obat golongan Barbiturat, maka yang diperhatikan adalah efek bisa menidurkan atau tidak bisa, intensitas peroteh berupa frequensi tidur
