BIOTEKNOLOGI PERIKANAN
BIOTEKNOLOGI PERIKANAN
PRAKTIKUM
PRAKTIKUM
Diajukan Untuk Memenuhi Sebagai Persyaratan Menyelesaikan Praktikum Diajukan Untuk Memenuhi Sebagai Persyaratan Menyelesaikan Praktikum
Bioteknologi Perikanan Tentang PCR Bioteknologi Perikanan Tentang PCR
Oleh : Oleh :
SYAFITRI SIREGAR
SYAFITRI SIREGAR
NIM.201710260312085 NIM.201710260312085LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI
LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI
FAKULTAS PERTANIAN PERTERNAKAN
FAKULTAS PERTANIAN PERTERNAKAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG
2017
2017
BAB I
PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
PCR salah satu teknik dalam biologi molekuler untuk mengamplifikasikan sejumlah kecil DNA secara in vitro menggunakan sistem enzimatik dan suhu. Teknik ini menggunakan enzim yang dapat mensintesi DNA untuk memproduksi jutaan copy DNA yang identik dengan template. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum target disebut primer forward dan primer yang berada setelah target disebut primer reverse.
Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Proses PCR ini terdiri dari 3 tahapan yang berulang dalam 30 – 40
siklus. Tahapan 3 langkah yaitu, denaturasi, annealing dan ekstensi oleh enzim polimerase. Denaturasi dari DNA yang berlangsung pada suhu 94 - 98C, selama
tahap ini rantai ganda DNA akan terpisah menjadi rantai t unggal.
Tahap kedua annealing dari primer, yang berlangsung pada suhu 50 - 65C.
Tahap ketiga perpanjangan atau ekstension dari primer oleh DNA polymerase pada suhu 72C. Pada tahap yang ketiga ini taq polimerase mengamplifikasikan
DNA asal sampai jutaan kali. Adapun larutan PCR terdiri dari : DNA polimerase (enzim taq polimerase) yang tahan terhadap suhu tinggi, buffer PF+CR mengandung Tris – HCl, KCl dan MgCl2, Empat nukleotida (dNTPs; dATP, dCTP, dGTP, dTTP), dua oligonukleotida dan DNA template. ( Ikhwan Ali , 2014) Sementara itu, beberapa faktor yang mempengaruhi spesifitas PCR adalah temperatur annealing, aktifitas dan jumlah polimerase, konsentrasi primer, DNA template dan Mg2+. Pada perkembangannya keseluruhan bahan yang diperlukan dalam proses PCR tersebut seringkali tercampur dalam bentuk PCR mix.
PCR merupakan metode yang sangat dapat diandalkan, khususnya untuk mendeteksi atau mendiagnosis penyakit, baik itu yang disebabkan karena bakteri atau virus. Diagnosis dapat dilakukan dalam jumlah sampel yang banyak dan waktu yang cepat.
1.2 Tujuan
1. Untuk mengetahui dan memahami yang dimaksud dengan PCR. 2. Untuk mengetahui prinsip kerja atau cara kerja dari PCR.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA 2.1 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik memperbanyak DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh sepasang primer. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi DNA target dalam jumlah jutaaan kali hanya dalam beberapa jam. Setiap urutan basa nukleotida yang
diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya.
Pada dasarnya reaksi PCR adalah tiruan dari proses replikasi DNA in vivo, yaitu adanya pembukaan rantai DNA (denaturasi) utas ganda, penempelan primer (annealing) dan perpanjangan rantai DNA baru (extension) oleh DNA polimerase dari arah terminal 5’ ke 3’. Hanya saja pada teknik PCR tidak menggunakan enzim ligase dan primer RNA. Secra singkat, teknik PCR dilakukan engan cara mencampurkan sampel DNA dengan primer oligonukleotida, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), taq DNA polimerase dalam larutan DNA yang sesuai, kemudian menaikkan dan menurunkan suhu campuran secara berulang beberapa puluh siklus sampai diperoleh jumlah sekuens DNA yang
diinginkan. ( Ikhwan Ali, 2014)
Adapun larutan PCR terdiri dari : DNA polimerase (enzim taq polimerase) yang tahan terhadap suhu tinggi, buffer PF+CR mengandung Tris – HCl, KCl dan MgCl2, Empat nukleotida (dNTPs; dATP, dCTP, dGTP, dTTP), dua oligonukleotida dan DNA template. Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu:
1) Pra – Denaturasi DNA template 2) Denaturasi
3) Penempelan primer (Annealing) 4) Pemanjangan (Ekstension)
5) Pemantapan (Post – Ekstension)
Tahap kedua sampai ke empat merupakan tahap yang selalu berulang atau siklusnya berulang, dimana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA. Tahap pra – denaturasi merupakan tahap yang dilakukan selama 1 – 9 menit dia awal reaksi yang berfungsi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktifkan DNA polimerasi. (Rahayu & Nugroho, 2015)
Denaturasi dari DNA yang berlangsung pada suhu 94 - 98C, selama tahap
ini rantai ganda DNA akan terpisah menjadi rantai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap akan menyebabkan denaturasi secara cepat, seangkan waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mempengaruhi kerja enzim tag polimerasi.
Tahap penempelan (annealing) merupakan proses penempelan primer pada bagian DNA template yang komplemen urutan basanya dan berlangsung pada suhu 50 - 65C. tahap annealing berlangsung selama 1 – 2 menit. Pada tahap
extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target yang akan
bergerak dari ujung 5’ menuju 3’ dari untai tunggal DNA. Proses pemanjangan atau pembacaan informasi DNA yang diinginkan sesuai dengan panjang urutan basa nukleotida yang akan ditargetkan. Pada setiap 1000bp yang akan
diamplifikasi memerlukan waktu 1 menit. Jika kuran dari 500bp dibutuhkan waktu 30 detik dan pada kisaran 500 tetapi kurang dar 1kb memerlukan waktu 45 detik, namun apabila lebih dari 1kb membutuhkan waktu 2 menit disetiap siklusnya.
Suhu yang dibutuhkan untuk proses extension adalah berkisar 70 -72C.
Tahap post extension, biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim 70 - 72C
selama 5 – 15 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna dengan penempelan dNTP’s, dan proses ini dilakukan setelah proses PCR terakhir. (Rahayu & Nugroho, 2015)
Primer merupakan sepotong untai DNA pendek utas tunggal (oligonukleotida). Panjang primer berkisar 10 sampai 40 basa. Pemilihan primer merupakan poin terpenting dalam menentukan keberhasilan proses amplifikasi (PCR). Primer berfungsi untuk menginisiasi reaksi polimerasi DNA secara in vitro, mengenali dan menandai fragmen sampel DNA (template) yang akan diamplifikasi. Pemilihan primer yang kurang tepat dapat mengakibatkan terjadinya kesalahan segmen yang diamplifikasi.
2.2 Elektroforesis Hasil PCR
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Gel yang digunakan antara lai agarosa. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada jumlah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.
Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel. Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak melalui matriks tersebut.
Elektroforesis digunakan dengan tujuan untuk mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel baik DNA, RNA dan protein. Selain itu, elektroforesis juga digunakan untuk fraksionasi yang dapat digunakan untuk mengisolasi
masing-masing komponen dari campurannya, mempelajari fitogenetika, kekerabatan dan mempelajari penyakit yang diturunkan. Elektroforesis dalam bidang genetika, digunakan untuk mengetahui ukuran dan jumlah basa yang dikandung suatu sekuen DNA tertentu. (Rahayu & Nugroho, 2015)
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat molekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul yang digunakan dalam praktikum elektroforesis adalah molekul DNA yang bermuatan negatif. Molekul akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (katoda) DNA memiliki muatan negatif karena mengandung gugus O. Oleh karena itu, arah migrasi DNA adalah dari kutub negatif ke kutub positif.
2.3 Keunggulan Enzim Taq Polimerase
Enzim DNA Polimerase, yaitu enzim yang merupakan katalisis reaksi sintesis rantai DNA. Enzim ini diperoleh dari Eubacterium yang disebut Thermus aquaticus, spesies ini diisolasi dari taman Yellowstone pada tahun 1969. Enzim taq polimerase tahan terhadap pemanasan berulang-ulang dan dapat aktif pada suhu tinggi yang akan membantu melepaskan ikatan primer yang tidak tepat dan meluruskan wilayah yang mempunyai struktur sekunder, oleh karena itu penambahan enzim tidak perlu dilakukan pada setiap siklusnya. (Rahayu & Nugroho, 2015)
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN 3.1. Hasil
Berikut ini merupakan hasil dari praktikum PCR
Gambar Keterangan
Hasil PCR dari sampel isolasi DNA yang berwarna hijau.
Hasil dari elektroforesis praktikum PCR yang dilakukan dapat dilihat dari gambar disamping yang merupakan hasil pengukuran dari Gel.doc. Pada gambar disamping dapat dilihat pita DNA bertumpuk dan untuk band tidak terlihat pada gel penyangga DNA nya ada tetapi tidak dapat dibaca. Hal ini disebabkan oleh perbedaan nyata antara pita yang dipengaruhi oleh persentasi agarose, waktu elektrofosresis dan konsentrasi EtBr. Sehingga praktikum DNA ini belum berhasil.
3.2. Pembahasan
Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat berimgrasinya molekul. Media penyangga yang dipakai pada praktikum kali ini adalah gel agarose. Matriks agarose yang berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan ukuran dan menstabilkan pH buffer agar muatan protein tidak berubah. Mesin elektroforesis dinyalakan dengan tegangan 60 V selama 50 menit.
Pada saat proses elektroforesis berlangsung, protein akan bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif sampai pada jarak tertentu dan pada gel agarose tergantung pada berat molekulnya. Semakin rendah berat molekulnya maka semakin jauh juga protein bergerak dengan kata lain mobilitasnya tinggi. Begitu pula sebaliknya protei yang berat molekulnya lebih besar akan bergerak pada jarak yang lebih pendek dengan kata lain mobilitasnya rendah. Protein dengan mobilitas tinggi akan berhenti bergerak pada bagian bawah gel, sedangkan
protein yang mobilitasnya rendah. Dengan demikian pada jalur pergerakan protein akan didapatkan jajaran protein (disebut sebagai band atau pita protein) yang sudah terseparasi berdasarkan berat molekulnya.
Elektroforesis hasil PCR yang didapatkan pada saat praktikum yang di foto menggunakan Gel.doc, di dapatkan hasil yang band atau pitanya nya tidak terbaca dan pita – pita DNA menumpuk kemudain menyebar atau dengan kata lain, praktikum yang dilakukan tidak berhasil. Hal ini dikarenakan oleh perbedaan
nyata antara pita yang dipengaruhi oleh persentasi agarose, waktu elektrofosresis dan konsentrasi EtBr, dan pita – pita DNA masih tercampur dengan kotoran dan belum menjadi DNA murni.
Tahap annealing merupakan tahap yang penting dalam PCR, karena jika suhu annealing terlalu rendah bisa membentuk hasil yang tidak spesifik, begitu juga jika terlalau tinggi maka akan menyebabkan penguraian utas tunggal primer DNA. Suhu annealing optimum untuk beberapa pasangan primer template dan suhu optimumnya merupakan suatu fungsi dari melting temperature dari pasangan primer yang kurang stabil. Pada suhu 55C primer akan menempel pada cetakan
yang sudah terpisah menjadi rantai tunggal.
Primer akan membentuk jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuen yang komplementer dengan sekuen primer. Suhu yang digunakan dalam perikanan pada proses annealing itu sekitar 55C - 63C dan suhu yang digunakan
pada saat praktikum itu 55C -65C, pada suhu yang lebih tinggi spesifitas reaksi
akan meningkat, tetapi secara keseluruhan akan menurunkan efeiensinya. Keberhasilan amplifikasi fragmen DNA dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu DNA template, primer, buffer PCR, MgCl2, enzim polimerase, suhu waktu dan jumlah siklus, suhu annealing ditentukan oleh susunan primer. (Rahmaningsi,
2016).
Tegangan pada elektroforesi adalah 50 – 100 V dan tengangan yang digunakan pada saat praktikum untuk elektroforesi itu adalah 60 V dalam waktu 50 menit. Hal ini dikarenakan semakin rendah tengangan pada elektroforesis maka semakin lama waktu yang dibutuhkan, begitu juga sebaliknya semakin tinggi tegangan pada elektroforesis maka semakin cepat waktunya. PCR dan elektroforeis memang harus dilakukan secara berulang ulang agar mendapatkan hasil yang maksimal. (Rahmaningsih, 2016)
BAB IV PENUTUP 4.1 Kesimpulan
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik memperbanyak DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh sepasang primer. Teknik PCR dapat digunakan untuk mengamplifikasi DNA target dalam jumlah jutaaan kali hanya dalam beberapa jam. Setiap urutan basa nukleotida yang
diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya.
Pada prinsipnya DNA mengalami denaturasi yang berlangsung pada suhu 94 - 98C, selama tahap ini rantai ganda DNA akan terpisah menjadi rantai
tunggal. Selanjutnya tahap penempelan (annealing) merupakan proses penempelan primer pada bagian DNA template yang komplemen urutan basanya dan berlangsung pada suhu 50 - 65C. tahap annealing berlangsung selama 1 – 2
menit. Terakhir tahap extension ini terjadi proses pemanjangan untai baru DNA, dimulai dari posisi primer yang telah menempel di urutan basa nukleotida DNA target yang akan bergerak dari ujung 5’ menuju 3’ dari untai tunggal DNA.
DAFTAR PUSTAKA
Hastuti, S.D, 2016. Buku Penuntun Praktikum Bioteknologi Perikanan. Laboratorium Bioteknologi Universitas Muhammadiyah Malang.
Ikhwan, Ali. 2014. Analisis Biologi Molekuler. Penerbit Deepublish. Yogyakarta. Rahayu, D.A, Nugroho, E.D. 2016. Penuntun Praktikum Bioteknologi. Penerbit
Deepublish. Yogyakarta.
Rahmaningsih, S. 2016. Hama dan Penyakit Ikan. Penerbit Deepublish. Yogyakarta.
