Pencarian Bakteri Tanah Penghasil Enzim Protease Dari Gunung Gede Cianjur
Irma Melyani Puspitasari, Rini Hendriani dan Sri Agung Fitri Kusuma* Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran Bandung
Email *: safk_y@yahoo.com
(Penelitian ini dibiayai oleh Dana DIPA Universitas Padjadjaran Tahun Anggaran 2009)
ABSTRAK
Telah dilakukan penapisan bakteri tanah penghasil enzim protease dari gunung Gede Kabupaten Cianjur. Pengujian aktivitas enzim protease ini dilakukan menggunakan metode difusi agar dengan induksi langsung. Dari tujuh isolat bakteri, ditemukan tiga isolat bakteri yang diketahui memiliki aktivitas enzim protease yaitu isolat bakteri nomor 2, 6 dan 7. Terdapat pengaruh konsentrasi produk ekstrasel bakteri tersebut terhadap zona bening yang terbentuk pada media uji. Semakin besar konsentrasi yang digunakan, maka semakin besar pula zona bening yang terbentuk. Aktivitas protease terbesar dihasilkan oleh isolat bakteri nomor 2. Identifikasi isolat bakteri tersebut dilakukan menggunakan pengamatan morfologi, pewarnaan Gram dan uji biokimia. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa genus isolat bakteri tersebut adalah Erwinia (Isolat bakteri nomor 2), Alkaligenes (Isolat bakteri nomor 6), dan Acinetobacter (Isolat bakteri nomor 7).
Kata kunci : bakteri tanah, enzim protease
Screening of Soil Bacteria Producing Protease Enzyme from Mount of Gede at Cianjur regency
ABSTRACT
The screening of soil bacteria which produce protease enzyme from Mount of Gede at Cianjur regency had been done. The experiment of the activity of this protease enzyme was done by the direct induction of agar diffusion method. From the nine isolated bacteria, there were three isolated bacteria which were found have enzyme protease activity, there are isolated bacteria 2, isolated bacteria 6 and 7. There was influence from the concentration of this extracell bacteria’s product to the clear zone which was formed on the test media. The bigger the concentration was used, the bigger the clear zone formed too. The biggest activity of protease was produced by isolated bacteria 2. The identification of these isolated bacteria was done by morphologic observation, the staining of Gram, and biochemical test. The result of the identification showed that the genera of these isolated bacteria are Erwinia (isolated bacteria 2), Alcaligenes (isolated bacteria 6), and Acinetobacter (isolated bacteria 7).
1. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Indonesia dikenal sebagai negara yang mempunyai gunung api aktif terbanyak di dunia, yaitu lebih dari 30% dari gunung aktif dunia ada di Indonesia. Salah satu gunung berapi tersebut adalah gunung Gede yang terletak di Kabupaten Cianjur. Letusan terakhir Gunung Gede terjadi pada tahun 1957 meninggalkan danau kawah serta sebuah kerucut sinder di tengahnya. Setelah peristiwa itu terjadi, potensi wisata daerah tersebut menjadi meningkat. Disamping itu, tanah di sekitar gunung Gede dilaporkan menjadi semakin subur dan telah digunakan sebagai daerah wisata yang potensial.
Potensi tanah pasca letusan tersebut pun dapat digali kembali untuk mendapatkan bakteri penghasil enzim protease. Bakteri adalah sumber enzim yang paling banyak digunakan dibandingkan dengan tanaman dan hewan. Sebagai sumber enzim, bakteri memiliki keunggulan karena pertumbuhannya cepat, mudah ditumbuhkan, mudah diatur produksinya dan mudah direkayasa secara genetika. Diduga bakteri yang terdapat di tanah sekitar letusan gunung ini bersifat termostabil. Keunggulan bakteri ini dapat dimanfaatkan sebagai sumber penghasil enzim protease yang mampu menghasilkan enzim protease dengan sifat ekstrim yang diinginkan. Penemuan bakteri penghasil enzim protease dari tanah di sekitar gunung Gede Kabupaten Cianjur ini dapat menambah potensi keanekaragaman hayati Indonesia.
1.2 Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk menapis bakteri tanah penghasil enzim protease yang bersifat termostabil dan menentukan identitas bakteri tersebut. 1.3 Tinjauan Pustaka
1.3.1 Tanah
Tanah dapat dipandang sebagai permukaan lahan di atas bumi yang menyediakan substrat bagi kehidupan tumbuh- tumbuhan dan hewan. Ciri- ciri lingkungan tanah bervariasi menurut letak dan iklimnya. Tanah juga memiliki kedalaman, sifat fisik, komposisi kimiawi dan asal yang berbeda. Tanah memiliki lima unsur utama yaitu air, mineral, gas, bahan organik, dan jasad hidup (Pelczar dan Chan, 1988).
Berdasarkan kandungan tanah tersebut, tanah dapat dijadikan sebagai salah satu sumber paling tepat untuk menapis mikroorganisme penghasil metabolit yang dapat dimanfaatkan oleh manusia. Seperti antibiotik, enzim protease, enzim amilase, antitumor dan substansi bioaktif lainnya (Suwandi., 1993).
1.3.2 Bakteri Tanah
Mikroba tanah merupakan berbagai jenis mikroorganisme yang hidup di tanah. Jumlah dan jenis mikroorganisme yang hidup ditanah tergantung dari ciri-ciri lingkungan tanah dan unsur– unsur yang terkandung di dalam tanah tersebut. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dalam setiap hektar tanah terdapat 2.200 kilogram jamur, 1.100 kilogram bakteri, 220 kilogram protozoa, 125 kilogram algae, dan 125 kilogram ragi (Dinata., 2002).
dalam tanah. Genus Bacillus ini pun dilaporkan merupakan salah satu bakteri proteolitik.
1.3.3 Bakteri Proteolitik
Bakteri proteolitik adalah bakteri yang memproduksi enzim protease ekstraselular, enzim protease ini diproduksi di dalam sel kemudian dilepaskan ke mediumnya. Semua bakteri mempunyai enzim protease di dalam sel, namun tidak semua enzim protease tersebut dilepaskan ke mediumnya (Abraham et al., 1993). Dekomposisi protein lebih sulit dibandingkan pemecahan karbohidrat. Produk akhir dari dekomposisi protein pun lebih bervariasi. Hal ini disebabkan struktur protein yang lebih kompleks. Mikroorganisme dengan sistem enzim yang kompleks, memecah protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana (Abraham et al., 1993).
Bakteri proteolitik dapat digolongkan menjadi beberapa kelompok yaitu : 1. Bakteri aerobik atau anaerobik fakultatif, tidak membentuk spora
2. Bakteri aerobik atau anaerobik fakultatif, membentuk spora 3. Bakteri anaerobik pembentuk spora
1.3.4 Enzim Protease
Protease adalah enzim yang memutuskan ikatan peptida pada protein. Berdasarkan tempat pemutusan ikatan peptida, enzim protease dibagi menjadi dua yaitu endopeptidase dan eksopeptidase. Endopeptidase ialah enzim yang mengkatalis pemecahan ikatan peptida pada bagian dalam rantai polipeptida, sedangkan enzim yang mengkatalis pemecahan ikatan peptida pada ujung-ujung rantai polipeptida disebut eksopeptidase (Murray et al., 2003).
Berdasarkan gugus aktif dan gugus fungsinya, enzim protease dibedakan menjadi empat golongan yaitu: protease serin, protease tiol, protease karboksil, dan protease logam (Creighton, 1993). Protease serin merupakan endopeptidase yang mempunyai residu serin pada sisi aktifnya (Fersht., 1985). Contoh protease serin ialah tripsin, kimotripsin dan elastase.
buah kiwi ditemukan enzim actinidin. Pada bakteri, enzim protease tiol ditemukan pada Clostridium histolyticum dengan nama enzimnya closripain dan pada mamalia ditemukan protease tiol kaptepsin B1 dan B2 (Creighton., 1993).
Protease karboksil mempunyai dua residu aspartat pada sisi aktifnya (Fersht., 1985). Enzim dari kelas ini dikenal juga sebagai protease asam karena umumnya enzim ini aktif pada pH asam (Creighton, 1993). Protease karboksil mempunyai berat molekul kira-kira 35 KDa dan semua spesifik untuk menghidrolisis ikatan peptida yang terletak antara residu hidrofobik. Pepsin yang termasuk ke dalam protease karboksil, mempunyai berat molekul 34 KDa dengan 327 residu asam amino dan dapat mengakomodasi 4, 5, atau 7 residu asam amino dari substrat (Fersht, 1985).
Protease logam adalah enzim protease yang menggunakan ikatan logam pada sisi aktifnya, biasanya adalah Zn2+ (Creighton, 1993). Enzim yang termasuk
ke dalam zink protease adalah termolisin dan karboksipeptidase. Termolisin merupakan endopeptidase yang mempunyai berat molekul 34 KDa dan mengandung 316 residu asam amino. Enzim ini berasal dari bakteri yang mengkatalisis ikatan peptida non terminal pada substrat polipeptida (Fersht., 1985). Karboksipeptidase merupakan eksopeptidase yang mengkatalisis C-terminal dari substrat polipeptida (Creighton, 1993).
2. Metode Penelitian 2.1 Pengumpulan Sampel
Sampel tanah diperoleh dari daerah pegunungan Gede. Tanah diambil pada kedalaman kurang lebih 20 cm dari permukaan tanah.
2.2 Isolasi Bakteri Tanah
Tanah disuspensikan kedalam media Nutrien Broth (NB) lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 18 jam. Suspensi mikroba tersebut kemudian diinokulasikan pada permukaan media Nutrient Agar (NA) dan diinkubasi selama 18 jam pada suhu ruang.
2.3 Pembuatan Master Plate Bakteri Uji
Masing- masing isolat bakteri uji yang tumbuh, diinokulasikan kembali pada NA baru dan diinkubasi pada suhu ruang selama 18 jam.
2.4.1. Penyiapan Media Uji
Susu skim 1% ( 0,2 gram susu skim serbuk dilarutkan dengan 1 ml air suling steril lalu dipasteurisasi pada suhu 60ºC) disuspensikan dalam 19 ml media NA bersuhu 45ºC , kemudian dibiarkan sampai membeku.
2.4.2 Pembuatan Kontrol Negatif
Media uji tanpa perlakuan apapun diinkubasi pada suhu ruang selama 18 jam.
2.4.3 Pengujian Aktivitas Enzim Protease Bakteri Uji
Satu ose isolat bakteri uji digoreskan pada media uji kemudian diikubasi pada suhu ruang selama 18 jam. Aktivitas enzim protease ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening disekitar isolat bakteri tersebut.
2.5 Pengaruh Konsentrasi Produk Ekstrasel dan Pengujian Aktivitas Isolat Bakteri Penghasil Enzim Protease Terbesar
2.5.1. Penyiapan Media Uji
Susu skim 1% disuspensikan pada media Agar murni (Bacto) bersuhu 45ºC kemudian dibiarkan sampai membeku. Kemudian media uji tersebut dilubangi menggunakan perforator.
2.5.2. Pembuatan Kontrol Negatif
Media Bacto yang telah mengandung susu skim 1% diinkubasi pada suhu ruang selama 18 jam.
2.5.3 Pengaruh Konsentrasi Produk Ekstrasel Terhadap Aktivitas Enzim Protease
1. Produksi Enzim Protease Menggunakan Metode Induksi
Sebanyak 1 ml susu skim 1% disuspensikan dalam 9 ml NB kemudian satu ose bakteri diinokulasikan kedalamnya dan diinkubasi pada suhu ruang selama 18 jam.
2. Pembuatan Kontrol Negatif
Sebanyak 1 ml susu skim 1% disuspensikan dalam 9 ml NB kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 18 jam.
Suspensi bakteri disentrifugasi selama 30 menit pada kecepatan 8000 rpm. Supernatan dari hasil sentrifugasi diambil, kemudian dilakukan pengenceran konsentrasi 100 %, 80 %, 40 % dan 20 % menggunakan air suling steril.
2.5.4 Pengujian Aktivitas Enzim Protease Terbesar
Supernatan hasil pengenceran diambil sebanyak 50 µl menggunakan mikropipet lalu dimasukkan ke dalam lubang media uji dan diinkubasi pada suhu ruang selama 18 jam.
2.6 Identifikasi Koloni Bakteri Uji Penghasil Enzim Protease
Identifikasi koloni bakteri uji penghasil enzim protease dilakukan menggunakan analisis fenotip yang meliputi pengamatan morfologi, pewarnaan gram dan serangkaian uji biokimia.
2.6.1 Pengamatan Morfologi Isolat Bakteri
Pengamatan morfologi koloni meliputi bentuk dan warna koloni mikroba tersebut.
2.6.2 Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram dilakukan untuk membedakan gram positif dan gram negatif. Bakteri uji dioleskan di atas kaca obyek dan difiksasi diatas api. Olesan tersebut digenangi dengan karbol gential violet (CGV) selama satu menit, lalu digenangi kembali dengan Lugol selama dua menit. Olesan tersebut dicuci dengan pemucat alkohol 95% selama tiga puluh detik, lalu dibilas dengan air suling. Olesan tersebut digenangi dengan pewarna pembanding air fuksin selama tiga puluh detik sampai zat warna tersebut larut, kemudian dibilas dengan air suling. Olesan tersebut dikeringkan menggunakan kertas saring lalu ditetesi minyak emersi dan diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 kali. Bentuk sel mikroba diamati. Bakteri gram negatif akan berwarna merah dan bakteri gram positif akan berwarna ungu.
2.6.3 Uji Biokimia
Uji biokimia meliputi uji fermentasi karbohidrat, uji motil indol urea, uji sitrat, uji triple sugar iron agar (TSIA), Uji Metil Red ( MR ) dan Voges – Proskauer ( VP ).
3. Hasil dan Pembahasan
Isolasi ini dilakukan untuk mendapatkan koloni bakteri tunggal. Terdapat beberapa koloni tunggal berdasarkan warna dan bentuk koloni yang terbentuk. Hasil isolasi dapat dilihat pada Tabel 3.1.
Tabel 3.1. Morfologi Koloni Bakteri Hasil Isolasi
Isolat
bakteri Warna Koloni BentukKoloni
1 kuning bulat
2 putih terang
berlendir bulat
3 kuning bulat
4 putih terang bulat
5 putih terang bulat
6 Putih terang
berlendir
bulat
7 putih gelap
berlendir bulat
3.2 Hasil Penapisan Bakteri Penghasil Enzim Protease
Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui isolat bakteri penghasil enzim protease. Pengujian aktivitas enzim protease dilakukan dengan metode cawan gores. Hasil pengujian menunjukkan bahwa beberapa koloni menghasilkan enzim protease. Hasil pengujian dapat dilihat pada Tabel 3.2.
Tabel 3.2. Hasil Uji Aktivitas Enzim Protease Dari Bakteri Hasil Isolasi Isolat
bakteri Aktivitas enzimprotease
1
-2 +
3
-4
-5
-6 +
7 +
Keterangan : (-) = tidak mempunyai aktivitas enzim protease (+) = mempunyai aktivitas enzim protease
Morfologi koloni yang berbeda dari ketiga isolat bakteri penghasil enzim protease diduga menunjukkan spesies yang berbeda. Hal ini dapat memberikan keunikan karakteristik yang mungkin berbeda dari masing-masing enzim protease yang dihasilkan oleh ketiga koloni tersebut.
Pengujian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi produk ekstrasel dan aktivitas enzim protease terbesar dari isolat bakteri. Produk supernatan diencerkan hingga konsentrasi 100 %, 80 %, 40 % dan 20 %. Pengujian dilakukan duplo untuk masing- masing isolat bakteri penghasil enzim protease. Pengujian aktivitas enzim protease terbesar dari bakteri uji dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan perforator. Hasil uji aktivitas tersebut dapat dilihat pada Tabel 3.3.
Tabel 3. 3. Diameter Hambat Aktivitas Enzim Protease
Isolat bakteri
Konsentrasi(%)
Diameter Hambat Rata- Rata (cm)
100 80 40 20
2 2,08 1,96 1,89 1,85
6 2,02 1,95 1,86 1,83
7 2,03 1,95 1,85 1,81
Berdasarkan hasil pengamatan tersebut disimpulkan bahwa semakin besar konsentrasi dari produk ekstrasel maka semakin besar zona bening yang terbentuk. Dari ketiga isolat bakteri tersebut, isolat bakteri nomor 2 memiliki aktivitas enzim protease terbesar.
3.4. Hasil Identifikasi Bakteri Uji
Identifikasi yang dilakukan meliputi pengamatan morfologi, pewarnaan Gram, dan uji Biokimia. Pengamatan morfologi koloni bakteri penghasil enzim protease dilakukan dengan pengamatan secara kasat mata. Hasil pengamatan morfologi koloni tersebut dapat dilihat pada Tabel 3.4.
Tabel 3.4. Hasil Pengamatan Morfologi Koloni
Pewarnaan Gram digunakan untuk mengetahui morfologi bentuk sel bakteri, mengidentifikasi, serta membedakan bakteri gram positif dan gram
Koloni Warna Bentuk
2 Putih
terang Berlendir
Bulat
6 Putih
terang Berlendir
Bulat
7 Putih
gelap Berlendir
negatif. Pewarnaan Gram dari isolat bakteri yang memiliki aktivitas enzim protease dapat dilihat pada Tabel 3.5.
Tabel 3.5. Hasil Pewarnaan Gram
Koloni Bentuk Warna Jenis
2 Basil Merah Gram
negatif
6 kokus merah Gram
negatif
7 kokus merah Gram
negatif
Identifikasi dengan uji biokimia dilakukan dengan cara uji gula-gula (glukosa, manitol, laktosa, maltosa, dan sukrosa), uji motil, uji Indol, Uji TSIA, Uji MR-VP, dan Uji Sitrat. Hasil pengamatan uji biokimia dapat dilhat pada Tabel 3.6.
Tabel 3.6. Hasil Pengamatan Uji Biokimia
Uji biokimia Koloni
2 6 7
Glukosa + + +
laktosa + + -
sukrosa - - +
maltosa - + -
manitol - +
-motilitas + + +
TSIA + + +
sitrat - + +
indol - -
-VP - -
-MR - -
-Berdasarkan hasil pengamatan identifikasi morfologi dan uji biokimia kemudian dibandingkan dengan pustaka, dapat disimpulkan bahwa isolat bakteri nomor 2 adalah bakteri dari genus Erwinia. Sedangkan untuk isolat bakteri nomor 6 adalah bakteri dari genus Alkaligenes dan isolat bakteri nomor 7 adalah bakteri dari genus Morococus. Hasil perbandingan dari pengamatan identifikasi morfologi dan uji biokimia dengan pustaka yang ada dapat dilihat pada tabel 3.7-3.9.
Ciri- Ciri Bakteri Uji Genus Erwinia
Warna
Koloni Putih terang Putih
Bentuk
Koloni Bulat Bulat
Suhu
tumbuh 25-27º C 25- 30º C
Pewarnaan Gram: Jenis bakteri Bentuk bakteri
Gram ( - ) Basil
Gram ( - ) Basil Uji Biokimia : Glukosa Laktosa Sukrosa Maltosa Manitol Motilitas TSIA Sitrat Indol VP MR + + - - - + + -+ / + + / + / + + + / + / + td td
Keteranga: td = tidak dijelaskan pada pustaka
Tabel 3.8. Hasil Perbandingan Dari Hasil Pengamatan Identifikasi Morfologi dan Uji Biokimia Isolat Bakteri Nomor 6 Dengan Pustaka
Ciri- Ciri Bakteri Uji genus
Alkaligenes Warna Koloni Putih Terang Putih Bentuk
Koloni Bulat Bulat
Suhu
Tumbuh 25-27º C 20-37º C
Pewarnaa n Gram: Jenis Bakteri Bentuk Bakteri
Gram ( - )
Sitrat Indol VP MR -td td td
Keteranga: td = tidak dijelaskan pada pustaka
Tabel 3.9. Hasil Perbandingan Dari Hasil Pengamatan Identifikasi Morfologi dan Uji Biokimia Isolat Bakteri Nomor 7 Dengan Pustaka
Ciri- Ciri Bakteri
Uji MorococuGenus s
Warna
Koloni Putih Gelap Putih Bentuk
Koloni
Bulat Bulat
Suhu
Tumbuh 25-27º C 23-42º C
Pewarnaan Gram: Jenis Bakteri Bentuk Bakteri Gram ( - ) Cocus
Gram ( - ) Cocus Uji Biokimia : Glukosa Laktosa Sukrosa Maltosa Manitol Motilitas TSIA Sitrat Indol VP MR + - + - -+ + + - +/-td td td td + + +/-td td td
Keteranga: td = tidak dijelaskan pada pustaka
4. Kesimpulan dan Saran 4.1 Kesimpulan
dihasilkan. Semakin besar konsentrasi produk ekstrasel maka semakin besar pula zona bening yang terbentuk. Aktivitas enzim protease terbesar dihasilkan pada isolat bakteri nomor 2.
4.2 Saran
Diperlukan Identifikasi isolat bakteri menggunakan PCR 16s rDNA untuk mendukung kebenaran hipotesa genus isolat bakteri. Diperlukan juga penelitian lebih lanjut untuk mengisolasi enzim protease yang terdapat dalam produk ekstrasel isolat bakteri penghasil enzim protease.
Ucapan terima kasih
Terima kasih kepada DIPA Universitas Padjadjaran yang telah mendanai terlaksananya penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Abraham A. G., G. Antoni L., and Añon A. C., 1993. Proteolytic Activity of Lactobacillus bulgaricus Grown in Milk, Journal of Diary Science. La Plata, Argentina
Creighton E. T., 1993. Protein Struktur and Molecular Properties. Ed2nd. New
York : W. H. Freeman and Company.
Dinata A., 2002. Peran Mikroba dalam Proses Mineralisasi Jasad Hidup, Suplemen Pikiran Rakyat Khusus Iptek. Jakarta.
Fersht A., 1985. Enzyme Structure and Mechanism. Ed2nd. New York: W. H.
Freeman and Company.
Hadioetomo R. S., Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek Teknik dan Prosedur Dasar laboratorium. Jakarta: PT Garmedia.
Holtj G., Kreig N. R., Sneath P.H.A., Stanley J.T., and Williams S.T., 1994. Bergeys Manual Determinative Bacteriology. Baltimore: Williamn and Wilkins. 75, 178
Lehninger L. A., 1995. Dasar- Dasar Biokimia. Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Murray R. K. et al., 2003. Biokimia Harper. Alih bahasa: Andry Hartono. Ed.25, Jakarta: EGC. Hal 96
Pelczar M. J. dan E. C. S. Chan, 1988, Dasar-Dasar Mikrobiologi, Jilid 2, Terjemahan Ratna Sri Hadioetomo, dkk., Jakarta: Penerbit Universitas Indonesia.
Saefudin A., 2006. Enzim. Cibinong:Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI.
