memiliki IC50 sebesar 760,55 ppm

(1)

PENDAHULUAN

Radikal bebas bersifat reaktif, dan jika tidak diinaktifkan akan dapat merusak makromolekul pembentuk sel, yaitu protein, karbohidrat, lemak, dan asam nukleat, sehingga dapat menyebabkan penyakit degeneratif (Youngson, 2005). Antioksidan adalah zat penghambat reaksi oksidasi akibat radikal bebas yang dapat menyebabkan kerusakan asam lemak tak jenuh sehingga menimbulkan penyakit. Senyawa antioksidan ini dapat diperoleh dari bahan alami. Antioksidan alami mampu melindungi tubuh terhadap kerusakan yang disebabkan spesies oksigen reaktif, mampu menghambat terjadinya penyakit degeneratif serta mampu

menghambat peroksida lipid pada makanan (Subeki,1998).

Rianes membuktikan adanya aktivitas anti

Hasil penelitian yang telah

dilakukan sebelumnya terhadap efek

antioksidan ekstrak etanolik daun

sirsak dengan mengukur serapan

DPPH pada

λ 516 nm didapatkan

nilai IC

50

sebesar 60,74 ppm yang

dibandingkan dengan jus buah sirsak

memiliki IC

50

sebesar 760,55 ppm

dan IC

50

dari vitamin C sebesar 4

ppm. Hasil tersebut menandakan

bahwa adanya aktivitas antioksidan

pada daun sirsak yang lebih baik

dibandingkan dengan jus buah sirsak

(Rianes, 2012).

senyawa hidroksinat, kumarin dan tokoferol yang berasal dari bahan alam. Sehingga memicu

Rianes pada tahun 2012 membuktikan adanya aktivitas antioksidan ekstrak etanolik daun sirsak lebih baik dengan nilai IC50 sebesar 60,74 ppm yang

dibandingkan dengan jus buah sirsak memiliki IC50 sebesar 760,55 ppm pada

serapan DPPH pada λ 516 nm.

Penelitian Rachmawati (2012) tentang efek ekstrak etanolik daun sirsak terhadap proliferasi dan apoptosis sel hela yang dimediasi oleh p53 dimana pada penelitian ini didapatkan IC50 sebesar 111,75

µg/mL yang dapat diasumsikan menghambat pertumbuhan sel Hela dan menginduksi apoptosis sel hela

ISOLASI ANTIOKSIDAN EKSTRAK METANOLIK DAUN SIRSAK (Annona muricata L.)

Selpida Handayani, Abd.Malik, Asril Lalangko

Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Muslim Indonesia, JL. Urip Sumiharjo KM.5, Makassar

Correspondens email: [email protected]

ABSTRAK

Isolasi senyawa aktif antioksidan ekstrak metanolik daun Sirsak (Annona muricata L.) telah dilakukan. Penelitian ini dimaksudkan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa aktif antioksidan daun Sirsak (Annona muricata L.). Sampel sebanyak 200 gr dimaserasi dengan metanol menghasilkan 24,667 gr ekstrak kental. Isolasi ekstrak metanolik dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom cair vakum dan didapatkan sebanyak 12 fraksi. Kemudian diisolasi lebih lanjut menggunakan kromatografi lapis tipis dengan satu perbandingan eluen n-heksan : etil asetat (6:4). Hasil isolat diidentifikasi dengan menggunakan spektrofotometri UV-Vis diperoleh panjang gelombang maksimum sebesar 418,120 nm, dan pereaksi kimia spesifik AlCl3 dan sitroborat menunjukkan bahwa isolat merupakan golongan flavonoid.

Kata kunci : Isolasi, Antioksidan,Daun Sirsak

ABSTRACT

Isolation and identification of active compounds in antioxidant methanolic extract of leaves of Soursop (Annona muricata L.) has been done. This research is intended to isolate and identify the active compounds are antioxidants Soursop leaf (Annona muricata L.). 200 gr sample has been macerated with methanol produces a viscous extract 24,667 gr. Isolation metanolic extracts performed using vacuum liquid chromatography column and found as many as 12 fraction. Then further isolated using thin layer chromatography with a comparison: eluen n-heksan ethyl acetate (6: 4). Results of the isolates to be identified with UV-Vis spectrophotometry obtained the maximum wavelength of 418,120 nm, and reagent specific AlCl3 and sitroborat showed that isolates a group of flavonoids.

(2)

Senyawa antioksidan termasuk golongan senyawa fenolat seperti flavonoid, senyawa hidroksinat, kumarin dan tokoferol yang berasal dari bahan alam. Sehingga memicu masyarakat pada umumnya dan peneliti pada khususnya untuk mengeksplorasi bahan-bahan alam yang dianggap potensial sebagai alternatif agen antiradikal bebas (Trilaksani, 2003)

METODOLOGI Pengambilan Sampel

Sampel daun Sirsak (Annona

muricata L.) dikumpulkan pada pagi hari

pukul 09.00 dengan cara memetik daun dari cabang dan batang utamanya.

Pengolahan Sampel

Daun Sirsak yang telah diperoleh dicuci bersih dari kotoran yang melekat dengan menggunakan air setelah itu diangin-anginkan. Kemudian di masukkan dalam lemari pengering, setelah kering dihaluskan untuk dimaserasi.

Ekstraksi Sampel

Daun Sirsak (Annona muricata L.) ditimbang sebanyak 200 gr, kemudian dimasukkan ke dalam wadah maserasi dan ditambahkan metanol sebanyak 2500 mL, Maserasi dilakukan selama 3 hari dalam bejana tertutup dan terlindung dari cahaya sambil diaduk secara periodik. Ekstrak hasil maserasi (maserat) dipisahkan dengan ampas, ampas dimaserasi kembali dengan pelarut Metanol sebanyak 2000 mL. Filtrat kemudian ditampung untuk diuapkan.

1. Filtrat hasil maserasi dikumpulkan dan diuapkan dengan menggunakan hairdryer hingga mendapatkan ekstrak kering. 2. Identifikasi dengan Kromatogramafi

Lapis Tipis

Ekstrak Metanolik kering daun Sirsak (Annona muricata L.) dilarutkan dengan pelarut Metanol, kemudian ditotol pada lempeng KLT berukuran 1 x 7 cm dengan menggunakan pipa kapiler. Lempeng yang sudah ditotol dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen n-heksan : etil asetat dengan berbagai perbandingan

yakni 7:3, dan 6:4, Setelah itu di elusi dan diamati profil KLT pada beberapa penampak bercak yaitu pada sinar UV 254 nm dan 366 nm. Bercak yang diperoleh diamati dan dihitung nilai Rf-nya. Setelah itu lempeng di uji antioksidan dengan menyemprotkan DPPH.

Pemisahan dan Pemurnian Komponen Kimia

a. Isolasi dengan metode kromatografi kolom cair vakum

1) Penyiapan kolom

Kolom kromatografi berdiameter 6 cm dan panjang 30 cm dibersihkan dengan metanol kemudian sumbat bagian bawah kolom dengan kapas agar silika gel tidak mencemari tampungan fraksi. Sebanyak 30 gr adsorben silika gel 60 (0,2-0,5 mm) berbanding 10 gr dengan silika gel 60 GF254 dicampurkan,

kemudian dimasukkan kedalam kolom dan dimampatkan dengan menggunakan pompa vakum. 2) Isolasi sampel

Ekstrak Metanolik daun Sirsak

(Annona muricata L.) ditimbang

sebanyak 5 gr. Kemudian diletakkan diatas permukaan adsorben yang sebelumnya telah dimasukkan dalam kolom, diatas ekstrak tersebut diletakkan kertas saring. Dimasukan eluen n-heksan : etil asetat (10:0), kemudian dielusi dengan dijalankan pompa vakum, fraksi yang keluar ditampung dalam botol coklat. Elusi juga dengan menggunakan variasi eluen n-heksan : etil asetat (9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 4:6; 3:7; 2:8; 1:9; 10:0) dan diakhiri dengan metanol 100 mL.

3) Identifikasi dengan kromatografi lapis tipis

(3)

pelarut metanol, kemudian ditotol pada lempeng KLT silika gel 60 F 254 berukuran 1 x 7 cm

menggunakan pipa kapiler. Setelah itu lempeng di uji

antioksidan dengan menyemprotkan DPPH.

b. Isolasi dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif

Fraksi kemudian diisolasi lebih lanjut menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif dengan cara menotolkan fraksi pada lempeng dengan ukuran yang lebih besar yaitu 20 x 20 cm, Profil kromatogramnya dideteksi menggunakan sinar UV 254 nm dan sinar UV 366 nm. Setelah terbentuk pita, maka pita–pita tersebut diberi tanda dan dikeruk. Hasil kerukan tersebut ditambahkan sedikit pelarut kemudian disentrifuge, filtrat ditampung kemudian diuapkan hingga didapatkan isolat.

c. Uji pemurnian a) KLT 2 Dimensi

Isolat aktif yang diperoleh, ditotol pada lempeng KLT dengan ukuran 5 x 5 cm, kemudian dielusi dengan menggunakan fase gerak n-heksan : etil asetat (6:4) untuk arah pertama dan n-heksan : etil asetat (4:6) untuk arah kedua.

b) Kromatografi Lapis Tipis Multi Eluen

Uji kemurnian isolat aktif juga dilakukan dengan menggunakan fase gerak Eeil asetat : aseton (1:1) dan etil asetat : kloroform (1:1). Kemudian diamati pada sinar tampak dan UV 254 dan 366 nm. Identifikasi Sampel

A. Identifikasi secara kimia

Isolat yang diperoleh diidentifikasi secara kimia yaitu dengan disemprotkan penampak bercak golongan komponen kimia. Penampak bercak yang digunakan adalah pereaksi FeCl3 dan Sitroborat dan

AlCl3.

B. Identifikasi spektroskopi UV-Vis

Isolat yang diperoleh diidentifikasi dengan spektroskopi UV-Visible. Senyawa dilarutkan dalam metanol p.a kemudian cuplikan ditempatkan antara monokromator dan detektor. Spektrum yang dihasilkan direkam pada alat pencatat.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Simplisia daun sirsak sebanyak 200 gr diekstraksi maserasi dengan pelarut metanol 4500 mL, menghasilkan ekstrak kering metanol sebanyak 24,667 gr. Hasil profil ekstrak metanolik secara kromatografi lapis tipis dengan menggunakan cairan pengelusi n-heksan : etil asetat (6:4), menunjukkan1 bercak pada sinar UV 254 nm, 4 bercak pada sinar UV 366 nm, hasilnya disemprot dengan menggunakan DPPH untuk melihat senyawa yang mempunyai aktivitas antioksidan. Senyawa yang aktif antioksidan adalah noda dengan nilai Rf 0,6 yang menunjukkan perubahan warna dari ungu menjadi kuning (Sarker et al., 2006).

A B C D Gambar 1. Profil KLT ekstrak Metanolik

daun Sirsak Keterangan :

Fase diam : Silika gel 60 F254

(4)

Tabel 1. Nilai Rf dan Warna Bercak Pada Profil Kromatogram Keterangan : k = Kuning h = Hijau ht = Hitam mm = Merah muda

klu = Kuning latar belakang ungu

Ekstrak metanol daun sirsak sebanyak 5 gr diisolasi secara kromatografi kolom cair vakum menggunakan campuran adsorben silika gel 60 (0,2-0,5 mm) sebanyak 35 gr dan silika gel 60 GF254

sebanyak 5 gr dengan menggunakan cairan pengelusi n-heksan : etil asetat (10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, 0:10) dan methanol 100 ml menghasilkan 12 fraksi yaitu fraksi I – XII.

Gambar 2.Profil KLT setelah penyemprotan DPPH

Keterangan:

Fase gerak : n-heksan : etil asetat (6:4)

Tabel 2. Nilai Rf dari masing-masing fraksi Fraksi No Rf /warna Sinar Tampak UV 254 UV 366 DPPH I II 1 0,945 /k 0,945 /k 0,945 /mm III 1 0,945 /k 0,945 /k 0,945 /mm 2 0,872 /h 0,872 /h 3 0,836 /h 0,836 /h 4 0,781 /h 0,781 /h IV-XII 1 0,945 /k 0,945 /k 0,945 /mm 2 0,872 /h 0,872 /h 0,872 /ht 3 0,836 /h 0,836 /h 0,836 /ht 4 0,781 /h 0,781 /h 0,781 /ht 5 0,709 /h 0,709 /h 0,709 /ht 6 0,581 /k 0,581 /k 0,581 /mm 0,581 /klu Keterangan : k = kuning mm = merah muda h = hijau

klu = kuning latar belakang ungu ht = hitam

Dari hasil fraksi diatas, yang menunjukkan aktivitas antioksidan paling intens terdapat pada fraksi VII yang ditunjukkan dengan perubahan warna dari ungu menjadi kuning (Sarker et al., 2006).

Selanjutnya fraksi VII hasil dari kromatografi kolom cair vakum ini diisolasi lagi secara kromatografi lapis tipis preparatif menggunakan eluen n-heksan : etil asetat (6:4) menghasilkan 7 pita yaitu pita I – VII. Profil kromatografi hasil KLT-Preparatif disemprot dengan menggunakan DPPH dan menunjukkan aktivitas antioksidan pada pita I, sehingga pita I yang kemudian dilanjutkan untuk uji kemurnian.

(5)

Gambar 3. Profil KLTP Fraksi VII Keterangan :

Fase diam : Silika gel 60F254

Fase gerak : n-heksan : etil asetat (6:4) Isolat yang diperoleh dilarutkan kemudian ditotolkan pada lempeng silika gel 60 F254 (Merck Germany) dengan ukuran 5 x

5 cm. Lalu dielusi dengan eluen n-heksan : etil asetat (6:4) untuk arah pertama, dan n-heksan : etil asetat (4:6) untuk proses elusi yang kedua, proses elusi dilakukan dua kali dengan cara memutar lempeng berlawanan dengan arah jarum jam sehingga hasil elusi yang pertama menjadi titik awal pengelusian yang kedua, dari proses elusi tersebut diperoleh satu bercak tunggal, maka dapat diduga bahwa isolat tersebut adalah komponen kimia yang tunggal.

Gambar 4. Gambar KLT 2 Dimensi isolat Keterangan :

Ukuran Lempeng : 5 x 5 cm

Fase gerak 1 : n-heksan : etil asetat (6:4) (a) Fase gerak 2 : n-heksan : htil asetat (4:6) (b)

Uji kemurnian isolat juga dilakukan dengan menggunakan beberapa variasi eluen yaitu etil asetat : aseton (1:1), etil asetat dan kloroform (1:1). Hasil elusi tersebut menampakkan noda tunggal yang dapat dilihat dengan menggunakan UV 254 dan UV 366 nm.

Gambar 5. Foto Hasil Kromatogram Isolat Menggunakan Variasi Eluen

Keterangan

Fase Diam : Silika gel 60 F254

Ukuran Lempeng : 1 x 7 cm

A : Penampak Bercak Sinar UV254

B : Penampak Bercak Sinar UV366

Fase Gerak 1 : etil asetat : aseton (1:1) (a) Fase Gerak 2 : etil asetat : koroform (1:1) (b) Tabel 3. Nilai Rf dan warna bercak hasil

kromatografi isolat pita I pada penampak bercak sinar UV 254 dan 366 nm menggunakan variasi eluen (Multi Eluen).

Pegujian selanjutnya adalah identifikasi secara reaksi kimia yaitu dengan menggunakan FeCl3 yang menandakan

adanya fenolik terdapat warna biru sampai hitam serta sitroborat dan AlCl3 untuk

(6)

Gambar 6. Hasil Kromatografi Penampak Bercak Isolat Keterangan : A = Pereaksi FeCl3 (+) B = Pereaksi sitroborat (+) C = Pereaksi AlCl3 (+)

Data spektroskopi Ultra violet-Visibel isolat pita II menunjukkan serapan maksimum pada panjang gelombang 418,12 nm. Dapat dilihat pada gambar.

Gambar 7. Hasil Spektrofotometer UV-Vis Isolat

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa :

1. Senyawa aktif antioksidan dapat diisolasi dari daun sirsak (Annona muricata L.) dengan menggunakan pelarut metanol. 2. Berdasarkan hasil profil KLT senyawa

aktif antioksidan tersebut berada pada nilai Rf 0,6 serta hasil spektrofotometri UV-Vis panjang gelombang isolat aktif antioksidan tersebut adalah 418,12 nm dengan absorbansi sebesar 0,400 dan didukung dengan penggunaan pereaksi yang menandakan bahwa isolat yang diperoleh dari daun sirsak diperkirakan merupakan turunan dari senyawa flavonoid.

DAFTAR PUSTAKA

Rahmawati, Ermin, Setyawati Karyono, Hidayat suyuti. 2012. Efek Ekstrak

Etanolik Daun Sirsak pada Proliferasi dan Apoptosis Sel Hela yang Dimediasi oleh P53. Universitas

Brawijaya. Malang.

Rianes,R. 2012. Karakterisasi Simplisia dan

Skrining Fitokimia Serta Uji Aktivitas Antioksidan Jus Buah Sirsak dan Ekstrak Etanol Daun sirsak (Annona muricata L.). Skripsi Universitas

Sumatra Utara.

Sarker., Zahid Latif., Alexander Gray., 2006,

Natural Product Isolation 2nd_.Humana

Press Inc, Totowa, NJ.

Subeki, 1998. “ Antioksidan Alami Terhadap

Tumbuhan .” Kanisius : Yogyakarta.