APLICASI ELEKTROFORESIS DALAM FARMASI

(1)

APLICASI

ELEKTROFORESIS DALAM

FARMASI

• Sediaan Farmasi yang diproduksi dipabrik

obat tidak saja obat yang bersifat

mikromolekul, tetapi juga yang bersifat makromolekul.

• Senyawa makromolekul terutama yang

merupakan senyawa bioaktif, (senyawa bio kimia) juga perlu diketahui cara analisisnya.

• _{Analisis paling umum dipakai adalah}

(2)

Principles of Electrophoresis

 Faktor yang menyebabkan pemisahan

 Muatan molekul

 Bobot molekul

 Bentuk molekul

 Molekul dipengaruhi oleh medan listrik  V = (EQ)/f

 V = molecule velocity

 E = Eletric feld strength  Q = molecular charge

 F = friction coefcient of molecule

 Hasil pemisahan yang tinggi sangat

tergantung berbagai faktor seperti rumus tersebut

(3)

I.Applications

Elektroforesis Gel



Analysis of

carbohydrates



Analysis of

inorganic

anions/metal

ions



DNA profling



Protein

identifcation

 Advantages  Fast

 _{Small Sample}  Relatively

inexpensive

 _Automated  Disadvantages

 Cannot identify

neutral species (Kecuali yang osmosis)

(4)

Migrasi sampel

4

(5)

Electrophoresis Dan

Buffer

 Beberapa jenis larutan yang dianjurkan

untuk electro phoresis DNA adalah;TAE (Tris-acetate-EDTA) and TBE (Tris-borate-EDTA). Fragmen DNA akan migrasi

dengan kecepatan yang berbeda dalam kedua dapar tersebut dan sangat

tergantung kekuatan ion.

 Bufer tidak saja untuk mempertahankan

pH, tetapi memberikan ion yang membantu sifat konduktivitas

 Bila digunakan kadar dapar 10 x lebih

kuat dari larutan stok, suhu dapat naik pada proses elektroforesis gel dapat

(6)

Assessing DNA Quality

Experiment:

 100 ng K562 DNA

 Digest with DNAse

(7)

(8)

Agarose (%)

Range of separation of linear DNA

(in kilobases)

0.3 60 - 5

0.6 20 - 1

0.7 10 - 0.8

0.9 7 - 0.5

1.2 6 - 0.4

1.5 4 - 0.2

2.0 3 - 0.1

(9)

Acrylamide Gel Electrophoresis

Effect of Gel Percentage and Size

(10)

10

II. Protein staining

(11)

Stain

Detection limit

Comment

Ponceau S 1-2 _g Reversible

Amido Black 1-2 _g permanent; low background

Coomassie Blue 1.5 _g permanent; high background

India Ink 100 ng permanent

Silver stain 10 ng permanent

Colloidal gold3 ng permanent

(12)

12

(2) DNA staining:

Ethidium bromide

 Ethidium bromide bergabung dengan

DNA double helix and

(13)

d.Pewarnaan sampel

dengan Ethidium

(14)

14

Electrophoresis of Nucleotides

_{DNA mempunyai}

mutan negatif ( karena kerangka phosphate )

_{DNA akan tertarik}

pada muatan positif baik dari elektrode maupun dapar, sebaliknya akan

(15)

Ethidium Bromide

 Senyawa mempunyai gugus planar yang

dapat ber intercalates diantara base DNA.

 Sifat tersebut menyebabkan kenaikan sifat

fouresensinya dibanding senyawa dalam keadaan bebas (dalam larutan)

 Radiation U.V. pada 254 nm diabsorbed

oleh DNA dan ditransmisikan kepada zat warna yang terikat, dan dapat

(16)

Ethidium Bromide

 Ethidium bromide biasanya dibuat

dengan larutan 10 mg/ml. Disimpan dan terlindung (kedap cahaya).

 Zat warna kurang berinteraksi atau

incorporated kedalam gel dan dapar

yang digunakan. Tetapi gel dapat

berwarna setelah dikocok dengan

ethidium bromide (0.5 ug/ml selama 30 min). dan dielusi dengan larutan.

 Warna akan tampak bila disinari dengan

UV dan dapat dipotret dengan flm polaroid.

 Kepekaan DNA terhadap zat warna ini bila

(17)

(18)

18

An ethidium-stained gel photographed

under UV light

(19)

Movement of DNA fragments

in agarose gels (Mobilitas fragmen

DNA dalam agorose sel)



Ada hubungan yang linier antara

kecepatan migration setiap fragmen

DNA dan logaritma dari ukuran molekul

(in basepairs).



Molekul yang besar bergerak lambat

(20)

Distance migrated

b

as

e

pa

irs

(21)

Types of Polyacrylamide gels



Denaturing gels

: Gel ini

mengalami polimeri sasi dengan

denaturant, terutama yang bersifat

dapat berpasangan dengan asam

nucleat seperti urea, atau formaid..



Denatured DNA

Yang telah

terdenaturasi akan migrasi melewati

gel poliakrilamid tak terjadi reaksi

(22)

Methods for Fluorescently

Labeling DNA

22

• Intercalating Dyes (post-PCR

=polimeric chain reaction)) • Dye-labeled nucleotide insertion during PCR

• Dye-labeled primer insertion during PCR

3’TGCATCTACGATGTAATCG5’ CGTAGCTG3’

Linkers, dyes, etc. can be added to the 5’ end of the primer without disturbing the reaction.

Individual bases can also be tagged ENZYME Intercalation process

(23)

Amine Reactive Dyes used in

LabelingDNA

FAM (Blue)

Emission 520

JOE (Green)

Emission 548

TAMRA (Yellow)

Emission 580

ROX (Red)

(24)

% Polyacrylamide gel Bromophenol blue Xylene cyanol (41)

5 35 130

6 26 106

8 19 76

10 12 55

12 8 28

Dye Migration in Diferent %

Polyacrylamide Gels

(25)

Sebelum terjadi pemisahan analit dikumpulkan dulu , kemudian dengan membe rikan arus

listrik terjadilah perbedaan potensial, sehingga terjadi pengelompokan iom positif dan negatif. Dengan demikian pemberian potensial dapat

diatur agar pemisahan dapat mencapai optimal.

1.TEKNIK INJEKSI:

1). Hidrostatik, dengan tekanan cairan

Besarnya tekanan tergantung volume cairan dirumuskan:

g htINJ  =BOBOT JENIS V= volume

VINJ =—————— h= SELISIH TINGGI LAR.

(26)

26



Contoh gambar

(27)

(28)

Isoelectric focusing

(IEF)

Perpindahan(pergerakan) cairan pada pipa kapiler akan terus berlangsung sepanjang larutan memiliki muatan atau diberi muatan, apabila kondisi sudah menjadi netral maka cairan akan berhenti bergerak pada pH tti. (PI)

(29)

2.

Aplikasi

(30)

Aplikasi

•DNA

Pemisahan oligonucleotida dan sekuen produk DNA melibatkan agar

polyacrylamide, gambar dibawah menunjukkan hasil separasi

(31)

Sample Injection in CE

Hydrodynamic injection

uses a pressure difference between the two ends of the capillary

V_c =

V_c, calculated volume of injection P, pressure difference

d, diameter of the column t, injection time

, viscosity

Electrokinetic injection

uses a voltage difference between the two ends of the capillary Q_i = V_app( k_b/k_a)t_r2_C

i

Q, moles of analyte

v_app, velocity t, injection time

(32)

 Capillary Isoelectric Focusing (CIEF) allows amphoteric molecules, such as proteins, to be separated by electrophoresis in a pH gradient generated between the cathode and anode.

 A solute will migrate to a point where its net

charge is zero. At the solute’s isoelectric point (pI), migration stops and the sample is focused into a tight zone.

 In CIEF, once a solute has focused at its pI, the

zone is mobilized past the detector by either pressure or chemical means. This technique is commonly employed in protein characterization as a mechanism to determine a protein's

isoelectric point.

(33)

 Capillary Isotachophoresis (CITP) adalah

bedasar perbedaan sampel mana yang leading (pendahulu) dan mana yang termiting (yang akir) dari suatu elektrolit..

 _{Analit yang intermediata akan terletak diantara}

pendahulu dan yang akir dari analit, dengan

bentuk tajam dan terfocus.(focused Zone) .

 Walaupun ini digunakan untuk model pemisahan

tetapi sebelumnnya merupakan pemusatan dari sampel lebih dulu.

(34)

Analisis Metadon dan

isomernya

 Metadon (MTD), sebagai analgesi yang sintetik,

biasnaya digunakan untuk obat pengganti opiat yang tidak adiktif. Obat ini mempunyai atom karbon asimitris sehingga terdapat beberapa isomer seperti:

 _R)-MTD.,₍_S)-MTD,₍_{S)-MTD [2,3].}_{Dan hasil}

metabolisme menjadi 2- ethylidene-1,5-dimethyl-3,3-diphenylpyrrolidine (EDDP), and to 2-ethyl-5-methyl-3,3-diphenylpyrrolidine (EMDP).

 Untuk pemisahan yang optimum , dengan elektroforesis

kapiler (EK) digunakan fase diam highly sulphated gammacyclodextrin (HS--CD) (Rudaz et al, 2003).

 Sebagai baku internal (standard internal),

R)-(+)-1-phenylethylamine ((R)-PEA, yang dalam EK, senyawa ini kecepatan migrasinya tidak sama dengan sampel uji;

(35)

 _{Electropherogram of an oral fuid sample spiked with 10 ng/mL (}

R)-PEA,used as internal standard (IS), obtained under optimized

conditions: fused-silica capillary 375 m o.d., m i.d., 40.2 cm total

length (efective length 32.8 cm);

 _{50mM phosphate bufer, pH 4.5, 0.2% HS--CD (w/v); applied voltage,}

(36)

36

Electropherogram of an oral fluid sample spiked with 50 ng/mL of (R,S)-MTD, (R,S)-EDDP and (R)-PEA (IS)

(37)

(38)

Separation of natural isotopes of 0.56 mM Cl- by capillary

electrophoresis with indirect spectrophotometric detection at 254 nm.

(39)

Separation of alkaline, alkaline earths, and Lanthanides

Capillary: 36.5 cm _75 µm fused silica, 30 kV .

(40)

(Y. Fung, K. Lau, H. Tung, Talanta, 45, 1998, 619.)

(41)

Model Proteins separated at pH= 2.7

Peak No. Proteins mol. Wt. Isolelectric Point, PI 1 Cytochrome c 12,400 10.7

2 Lysozyme 14,000 10.1 3 Trypsin 24,000 10.1 4 Trypsinogen 23,700 8.7

(42)

(43)

(44)

R=CH₂OH R=NHCH₃

(H.B.Wan,J.Liu,Talanta,45,1998,663)

(45)

(46)

Conclusion

The capillary electrophoretic methods have been recognized:

1.Lower equipment costs, smaller sample size

requirements, much greater speed, high resolution, precision, accuracy and sensitivity.

Compared to conventional HPLC methods,

2.The capillary electrophoresis methods have better resolution, less consumption of buffer solution and the absent organic solvents in the analysis.

3. Many types or method can be apllied.

(47)

Kemampuan senyawa berpartisipasi kedalam misel

sangat tergantung sifat hidofobiknya

a.) Micell Electroforesis

Senyawa yang dapat dianalisis dengan cara ini antara lain:morfn, kanabinol, barbi turat. Benzodiazepin, antibiotika dan vitamin

Waktu retensi dirumuskan: _{k’ =P}_mw_V[(S)-CMC)

k’= waktu retensi, P_mw= koefsien partisi,

(48)

48



b

). OPEN TUBELAR CAPILARY

ELECTROPHORESIS



ATAU

CAPILARY ZONE

ELECTROPHORESIS (CZE)



Gerakan analitnya berupa pita, terbuka

karena bagian tengah kapiler hanya ada

cairan netral,

sedangkan didinding

bagian tepi terdapat fase medium

elektroforesis

, hasilnya kurang bagus

(49)

 d)._{CIF Sebelum terjadi pemisahan analit}

(50)

Pemisahan senyawa dengan

gugus amin yang berbeda

(51)

 _CONTOH_s+_<_BGE

 _s+_>_t

 Gambar tahapan peristiwa dalam kapiler

sebelum ada arus dan setelah diberi arus listrik.

 Kecepatan migrasi sangat tergantung akan muatan,

dan bobot molekul.

 D). Elektroforesis dengan gel (capillary gel

electrophoresis), peristiwa yang terjadi sama dengan citp.

`

(52)