ABSTRAK
PERBANDINGAN EFEK FRAKSI n-HEKSANA DAN FRAKSI ETIL ASETAT Phyllanthus niruri L HERBA TERHADAP
PERSENTASE EOSINOFIL PADA APUS DARAH MENCIT DENGAN DERMATITIS ALERGIKA
DAN UJI KUALITATIF SENYAWA AKTIF DENGAN METODE KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
Rizki, 2006
Pembimbing Utama : Diana Krisanti Jasaputra, dr., M.Kes Pembimbing Pendamping : Rosnaeni, dra., Apt.
Tanaman obat Phyllanthus niruri L telah diketahui mempunyai efek sebagai obat anti alergi. Dalam upaya mengoptimalkan penggunaan tanaman tersebut sebagai obat anti alergi dilakukan fraksinasi ekstrak simplisia. Tujuan penelitian ini adalah untuk menilai fraksi mana dari Phyllanthus niruri L herba yang berperan optimal sebagai anti alergi pada mencit dengan dermatitis alergika dan membuktikan adanya senyawa flavonoid dalam fraksi aktif Phyllanthus niruri L herba secara kualitatif.
Uji efek anti alergi menggunakan 35 ekor mencit jantan dewasa galur Swiss Webster yang dibagi menjadi 5 kelompok (n=7) yaitu kelompok I (fraksi n-heksan), kelompok II (fraksi etil asetat), kelompok III (kontrol pembanding), kelompok IV (kontrol negatif), dan kelompok V (kontrol positif). Masing-masing kelompok diinduksi ovalbumin pada hari ke 1,7, dan 21, kecuali kelompok kontrol negatif. Bahan uji dengan fraksi n-heksana dan etil asetat diberikan pada hari ke 21 secara oral. Data yang diukur persentase jumlah eosinofil pada apus darah tepi. Data dianalisis menggunakan ANAVA yang dilanjutkan dengan uji beda rata-rata 2-tail p-values for pairwise t-tests dengan α = 0,05 menggunakan program MegaStat v 7.11. Uji kualitatif dilakukan dengan menggunakan metode KLT dengan pelarut CHCl3 : Metanol (9:1), larutan pendeteksi bercak AlCl3 10% dan pelarut Heksan : Etil asetat (1:1), larutan pendeteksi bercak H2SO4 10%.
Hasil penelitian uji beda rata-rata dengan 2-tail p-values for pairwise t-tests menunjukkan persentase eosinofil dari kelompok I (4,86) dibandingkan dengan kelompok V (16,57) menunjukkan perbedaan yang sangat signifikan (p=0,0001). Sedangkan kelompok II (12,29) dibandingkan dengan kelompok V (16,57) menunjukkan perbedaan yang non signifikan (p=0,1271). Uji kualitatif fraksi Phyllanthus niruri L herba didapat bercak senyawa uji yang sama dengan senyawa banding kaempferol dan flavone yang merupakan senyawa golongan flavonoid.
ABSTRACT
COMPARISON BETWEEN THE EFFECT OF n-HEXANE AND ETHYL ACETATE FRACTION IN Phyllanthus niruri L Herb ON EOSINOPHIL PERCENTAGE IN BLOOD SMEAR OF ALLERGIC DERMATITIS MICE
AND THE QUALITATIVE TEST FOR THE ACTIVE COMPOUNDS USING THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
Rizki, 2006
First tutor : Diana Krisanti Jasaputra, dr., M.Kes. Second tutor : Rosnaeni, dra., Apt.
The anti allergic effect of Phyllanthus niruri L has been recognized. In order to optimize the usage of this herb, some fractions in this herb have been found. The objective of this research was to investigate which fraction in Phyllanthus niruri L had the optimal anti allegic effect on allergic dermatitis mice, also to prove whether the active fraction contained flavanoid compound. The research was conducted to 35 male Swiss Webster mice which were divided into 5 groups, each group consisting of 7 mice. The first group was given n-hexane fraction, the second group was given ethyl acetate fraction, the third group was given antihistamin drug as compared control, the fourth was negative control group, and the fifth was positive control group. All mice were injected with ovalbumin on day 1, 7, and 21, except the negative control group were injected with distillated water. The n-hexane and ethyl acetate were given orally on day 21.The data measured was the eosinophil percentage in the blood smear. The data was then analyzed statistically with Anova and 2-tails p-value for pairwise t-tests using MegaStat ver 7.11 program. A qualitative test for active compounds was conducted by thin layer chromatography technique.
The result showed that there were significant differences (p=0,0001) between the eosinophil percentage of the first group/n-hexane fraction (4,86) and the fifth group/positive control (16,57), while the differences between the second group/ethyl acetate fraction (12,29) and the fifth group/positive control (16,57) were not significant (p=0,1271). The qualitative test for active compounds by thin layer chromatography showed that it contained kaempferol and flavone which were flavanoid compounds.
The conclusion of this research was n-hexane fraction in Phyllanthus niruri L had the optimal anti allegic effect and it contained flavanoid compound.
DAFTAR ISI
1.1 Latar Belakang Masalah... 11.2 Identifikasi Masalah ... 2
1.3 Maksud dan Tujuan... 2
1.4 Manfaat KTI... 3
1.5 Kerangka Pemikiran dan Hipotesis... 3
1.6 Metodologi Penelitian ... 4
1.7 Lokasi dan Waktu Penelitian ... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Reaksi Hipersensitivitas / Alergi... 5
2.1.1 Reaksi Hipersensitivitas Tipe I ... 5
2.1.2 Reaksi Hipersensitivitas Tipe II ... 6
2.1.3 Reaksi Hipersensitivitas Tipe III... 7
2.1.4 Reaksi Hipersensitivitas Tipe IV ... 10
2.2. Penyakit Alergi... 12
2.2.1 Patofisiologi ... 14
2.3 Phyllanthus niruri L. (Meniran)... 17
2.3.1 Bahan Aktif yang Terdapat dalam Meniran... 18
2.3.2 Efek Farmakologi... 18
2.3.3 Khasiat dan Penggunaan ... 19
2.4 Flavonoid... 19
2.4.1 Efek biologi... 20
2.4.2 Senyawa Flavonoid yang penting ... 20
2.5 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ... 23
2.5.1 Kondisi Baku... 24
2.5.1.1 Fase diam (Lapisan penyerap) ... 24
2.5.1.2. Fase Gerak (Pelarut Pengembang) ... 24
2.5.1.3 Bejana Pemisah, Penjenuhan,Aras Pengisian ... 25
2.5.1.4 Awal dan Jumlah Cuplikan ... 25
2.5.1.5 Pengembangan ... 26
2.5.1.7 Larutan Cuplikan... 28
2.5.2 Deteksi Senyawa yang Dipisah... 28
2.5.2.1 Lampu UV untuk Eksitasi Fluoresensi ... 28
2.5.2.2 Deteksi dengan Pereaksi Semprot... 29
2.5.3 Penilaian dan Dokumentasi Kromatogram ... 30
2.5.3.1 Angka Rf pada KLT... 30
2.5.3.2 Penilaian Visual ... 31
2.5.3.3 Dokumentasi ... 32
BAB III BAHAN DAN METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Bahan dan Alat... 33
3.2 Persiapan Bahan Penelitian ... 34
3.3 Persiapan Hewan Coba ... 34
3.4 Penentuan Besar Sampel ... 34
3.5 Rancangan Penelitian ... 35
3.6 Variabel Penelitian ... 36
3.7 Prosedur Kerja... 36
3.7.1 Uji Farmakologi fraksi herba Meniran... 36
3.7.2 Penyiapan sampel uji kualitatif dengan KLT... 36
3.7.2.1 Spotting sampel... 36
3.7.2.2 Pengembangan Pelat Kromatografi Lapis Tipis . 37 3.8 Analisis Data ... 37
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Penelitian ... 39
4.1.1 Uji Farmakologi fraksi herba Meniran... 39
4.1.2 Uji Kualitatif ... 41
4.2 Pembahasan... 42
4.2.1 Pembahasan Hasil Penelitian ... 42
4.2.2 Pengujian Hipotesis Penelitian... 43
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN... 44
DAFTAR PUSTAKA... 45
LAMPIRAN... 47
RIWAYAT HIDUP... 50
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 4.1 Hasil pengukuran rata-rata persentase eosinofil
pada berbagai kelompok perlakuan...39 Tabel 4.2 Hasil ANAVA persentase eosinofil
dari berbagai kelompok perlakuan ...40 Tabel 4.3 Hasil uji beda rata-rata persentase eosinofil
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 Tanaman Meniran (Phyllanthus niruri L)...18
Gambar 2.2 Struktur umum senyawa flavonoid ...19
Gambar 2.3 Struktur kimia quercetin...21
Gambar 2.4 Struktur kimia flavone...21
Gambar 2.5 Struktur kimia kaempferol ...22
Gambar 2.6 Struktur kimia epicathechin ...22
Gambar 2.7 Peralatan dalam KLT ...23
Gambar 2.8 Proses Pengembangan ...27
Gambar 2.9 Hasil KLT dilihat dibawah sinar UV ...30
Gambar 2.10 Contoh Perhitungan nilai Rf...31
Gambar 4.1 Hasil uji kualitatif senyawa aktif dengan metoda kromatografi lapis tipis ...41
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran A. Perhitungan Dosis Fraksi n-heksana dan Fraksi etil asetat ... 47
Lampiran B. Hasil perhitungan persentase eosinofil pada berbagai kelompok Perlakuan ... 48
47
LAMPIRAN A
Perhitungan Dosis Fraksi n-heksana dan Fraksi etil asetat
- Dosis Phyllanthus niruri L herba kering untuk manusia 70 kg = 15 g
- 1000 g Phyllanthus niruri L herba kering menjadi :
60 g ekstrak etanol Phyllanthus niruri L herba
- Dalam 15 g Phyllanthus niruri L herba kering terdapat ekstrak etanol :
1000 g : 60 g = 15 gr : X1 → X1 = 0,9 g
- 50 g ekstrak etanol Phyllanthus niruri L herba menjadi :
4,8 g fraksi n-heksana Phyllanthus niruri L herba
5,3 g fraksi etil asetat Phyllanthus niruri L herba
- Dari 0,9 g ekstrak etanol Phyllanthus niruri L herba terdapat :
50 g : 4,8 g = 0,9 : X2 → X2 = 0,09 g fraksi n-heksana
50 g : 5,3 g = 0,9 : X3 → X3 = 0,09 g fraksi etil asetat
- Konversi untuk mencit 20 g : 0,0026
- Jadi dosis Phyllanthus niruri L herba yang digunakan pada mencit :
0,09 g x 0,0026 = 0,234 mg fraksi n-heksana Phyllanthus niruri L herba
0,09 g x 0,0026 = 0,234 mg fraksi etil asetat Phyllanthus niruri L herba
48
LAMPIRAN B
Hasil perhitungan persentase eosinofil pada berbagai kelompok perlakuan
Kelompok Perlakuan Mencit
No. Fraksi n-heksan
Fraksi etil asetat
CTM Kontrol Negatif
Kontrol Positif
1 4 19 7 5 11
2 4 11 4 6 25
3 5 14 5 6 12
4 2 5 6 7 20
5 6 16 6 8 12
6 7 12 5 7 18
49
LAMPIRAN C
Hasil pengolahan data denggunakan program MegaStat for Excell ver.7.11 dengan metoda ANAVA yang dilanjutkan dengan uji beda rata-rata 2-tail p-values for pairwise t-tests
One factor ANOVA
Mean n
Std.
Dev
4.857 7 1.68 Group 1
12.286 7 4.61 Group 2
5.714 7 1.11 Group 3
6.571 7 0.98 Group 4
16.571 7 5.16 Group 5
9.200 35 5.50 Total
ANOVA table
Source SS df MS F p-value
Between groups 712.46 4 178.114 16.85 2.43E-07 Within groups 317.14 30 10.571
Total 1,029.60 34
Post hoc analysis (2-tail p-values for pairwise t-tests)
Group 1 Group 3 Group 4 Group 2 Group 5
4.857 5.714 6.571 12.286 16.571
Group 1 4.857
Group 3 5.714 .2817
Group 4 6.571 .0375 .1514
Group 2 12.286 .0017 .0032 .0075
Group 5 16.571 .0001 .0001 .0003 .1271
1
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Tanaman obat mempunyai banyak kegunaan atau khasiat untuk mengatasi
berbagai penyakit. Saat ini, tanaman obat telah banyak diteliti dan dikembangkan
dengan harapan dapat menjadi obat pilihan yang mempunyai khasiat lebih
optimal dibandingkan obat-obatan sintetis yang merupakan zat kimia.
Salah satu tanaman obat yang sedang dikembangkan adalah Phyllanthus
niruri L. atau yang dikenal di Indonesia dengan nama Meniran. Meniran merupakan tanaman obat yang diketahui mempunyai banyak khasiat antara lain
sebagai anti hepatotoksik, anti hipertensif, anti bakteri, anti viral, anti inflamasi,
diuretik, analgesik, anti spasmodik, dan mempunyai aktivitas hipoglikemik
(Taylor, 2003). Untuk memudahkan dan mengoptimalkan penggunaan herba
meniran sebagai obat, dilakukan fraksinasi ekstrak simplisia antara lain fraksi
n-heksan dan etil asetat. Pada penelitian ini akan diuji efek antara fraksi n-n-heksan
dengan etil asetat hasil fraksinasi ekstrak simplisia. Beberapa literatur
menyebutkan bahwa salah satu senyawa yang mempunyai efek sebagai anti alergi
adalah senyawa golongan flavonoid (Ammar, Okbi, Muhammed, 1997;
Summanen, 1999). Oleh karena itu, penulis tertarik untuk membuktikan apakah
senyawa flavonoid yang diduga berperan sebagai anti alergi terkandung dalam
meniran. Identifikasi keberadaan senyawa flavonoid dalam meniran dapat
dilakukan dengan berbagai metode, antara lain metode Kromatografi Lapis Tipis
(KLT), kromatografi cair, High Performance Liquid Chromatography (HPLC),
kromatografi gas, dan sebagainya (Hostettman, 1999). Teknik yang paling banyak
digunakan untuk analisis obat di laboratorium adalah Kromatografi Lapis Tipis
(KLT), karena metode ini tidak memerlukan investasi perlengkapan yang besar,
pengerjaannya singkat, jumlah cuplikan yang diperlukan sedikit, mudah, hasil
2
segi biaya relatif lebih murah dibandingkan metode lain (Stahl, 1985; Day,
Underwood, 1992; Hostettman, 1999).
1.2 Identifikasi Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas maka disusun identifikasi masalah sebagai
berikut :
- Apakah fraksi n-heksana atau fraksi etil asetat Phyllanthus niruri L herba yang
aktif sebagai anti alergi dalam menurunkan persentase eosinofil apus darah
mencit dengan dermatitis alergika?
- Apakah terdapat senyawa flavonoid dalam fraksi aktif Phyllanthus niruri L
herba?
1.3 Maksud dan Tujuan
Maksud penelitian ini adalah untuk memperoleh obat yang dapat mengatasi
alergi dengan optimal.
Tujuan penelitian ini adalah
- untuk menilai fraksi n-heksana atau fraksi etil asetat Phyllanthus niruri L
herba yang aktif sebagai anti alergi dalam menurunkan persentase eosinofil
apus darah mencit dengan dermatitis alergika
- untuk menilai adanya senyawa flavonoid dalam fraksi aktif Phyllanhtus niruri
L herba secara deskriptif
1.4 Manfaat Karya Tulis Ilmiah 1.4.1. Manfaat Akademis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan manfaat dalam mengembangkan
ilmu pengetahuan di bidang farmakologi tanaman obat Indonesia, khususnya
meniran sebagai anti alergi.
3
1.4.2. Manfaat Praktis
Efek fraksi aktif Phyllanthus niruri L herba dikembangkan menjadi obat anti alergi yang dapat lebih praktis dikonsumsi oleh masyarakat sebagai alternatif
dalam mengobati alergi.
1.5. Kerangka Pemikiran dan Hipotesis 1.5.1 Kerangka Pemikiran
Individu yang peka bila terpapar alergen maka tubuh individu tersebut akan
segera bereaksi antara lain membentuk imunoglobulin E (IgE). IgE ini selanjutnya
akan menempel pada sel mast/basofil dan bila terjadi kontak ulangan dengan
alergen yang sama, alergen tersebut akan menempel pada dua IgE yang
berdampingan dan menimbulkan degranulasi sel mast yang akan menimbulkan
gejala penyakit alergi seperti kemerahan dan gatal-gatal pada kulit. Selain itu
eosinofil akan direkrut ke daerah lesi. Eosinofil pada daerah lesi akan
menghasilkan berbagai protein yang menambah kerusakan jaringan pada daerah
tersebut (Karnen Garna Baratawidjaja, 2002; Siti Boedina Kresno, 2003).
Meniran memiliki kandungan kimia antara lain flavonoid, filatin, hipofilatin,
kalium, damar dan tanin, dan yang paling berperan sebagai anti alergi adalah
senyawa golongan flavonoid (Summanen, 1999; Dewi Ernita Achyad, Ratu
Rasyidah, 2000).
Kandungan flavonoid yang terdapat dalam meniran diperkirakan menekan
peran mediator sehingga mengurangi persentase eosinofil pada apus darah mencit
yang diinduksi ovalbumin, oleh karenanya herba meniran berefek anti inflamasi
4
1.5.2 Hipotesis
Ada perbedaan efek fraksi n-heksana dan fraksi etil asetat Phyllanthus niruri L
herba. sebagai anti alergi dalam menurunkan persentase eosinofil pada apus darah
mencit dengan dermatitis alergika
1.6. Metodologi Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian prospektif eksperimental laboratoris
dengan menggunakan desain penelitian Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang
bersifat komparatif, dengan hewan coba mencit. Penelitian ini menilai efek
pemberian fraksi n-heksana dan fraksi etil asetat Phyllanhtus niruri L herba.
sebagai obat anti alergi.
Data yang akan diamati adalah persentase eosinofil pada apus darah sebagai
respon terhadap efek anti alergi Phyllanthus niruri L herba.
Analisis data menggunakan ANAVA satu arah, dilanjutkan uji beda rata-rata
dengan α= 0,05. Kemaknaan ditentukan berdasar nilai p<0,05 menggunakan program MegaStat for Excell ver 7.11.
Selain itu dilakukan uji kualitatif senyawa aktif fraksi aktif phyllanthus niruri
L herba. dengan metode pemisahan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis
(KLT).
1.7. Lokasi Dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di :
- Laboratorium Farmakologi Universitas Kristen Maranatha dan
- Laboratorium Farmasi Institut Teknologi Bandung
yang dilaksanakan pada bulan Februari – Juli 2006.
44
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
- Fraksi yang aktif berperan sebagai anti alergi dalam menurunkan persentase
eosinofil apus darah mencit dengan dermatitis alergi adalah fraksi n-heksana
Phyllantus niruri L herba
- Fraksi aktif Phyllantus niruri L herba yaitu fraksi n-heksana mengandung
senyawa flavonoid.
5.2 Saran
- Perlunya dilakukan penelitian lanjutan menentukan kadar senyawa flavonoid
secara kuantitatif terhadap fraksi aktif.
- Perlunya dilakukan penelitian lanjutan uji kualitatif menggunakan kromatografi
lapis tipis (KLT) terhadap fraksi yang tidak aktif untuk membuktikan ada
45
DAFTAR PUSTAKA
Ammar, N.M., Okbi, S.Y., Mhamed, D.A. 1997. Study of the Anti-Inflammatory Activity of Some Medical Edible Plants Growing in Egypt In: J.of Islamic
Academy of Sciences. http://www.medicaljournal-ias.org/104.htm 14 Maret 2006
Annonymous. 2006. Meniran. http://www.iptek.net.id/id/?ch=tips 11 April 2006
Anonymous. 2000. Apigenin in Wikipedia Free Encyclopedia.
http://en.wikipedia.org/wiki/flavone. 10 April 2006
Anonymous. 2000. Catechin In Wikipedia Free
Encyclopedia.http://en.wikipedia.org/wiki/catechin. 10 April 2006
Anonymous. 2000. Flavonoid In Wikipedia Free Encyclopedia
http://en.wikipedia.org/wiki/Flavonoid#Biological_effects. 10 April 2006
Anonymous. 2000. Kaempferol In Wikipedia Free Encyclopedia.
http://en.wikipwdia.org/wiki/kaemferol 10 April 2006
Anonymous. 2000. Quercetin In Wikipedia Free Encyclopedia.
http://en.wikipwdia.org/wiki/quercetin 10 April 2006
Anonymous. 2002. Flavonoid.
http://www.friedli.com/herbs/herbs/phytochem/flavonoids.html 26 Februari 2006
Anonymous. 2003. Thin Layer Chromatography.
http://chemscape.santafe.cc.fl.us/chemscape/catofp/chromato/tlc/tlc.htm 26 Februari 2006
Anonymous. 2003. Thin Layer Chromatography.
http://www.wellesley.edu/chemistry/chem211lab/orgo_Lab_Manual/Appendi x/Instruments/index.html 26 Februari 2006
Anonymous. 2004. Meniran (Phyllanthus niruri L.).
http://www.pdpersi.co.id/?show=arsipnews&tbl=alternatif 26 Februari 2006
Bahmaz, M., Kosalec, I., Vladimir, S., Pepeljnjak, S., 2000. Quantitative Analysis
of Flavonoids in Propolis Samples from North Croatia.
http://apipharma.hr/publikacije/k.analiza.pdf. 14 Maret 2006
Brooks, G.F., Butel, J.S., Ornston, L.N. 1996. Imunologi Dalam Mikribiologi
Kedokteran. Ed.20. Jakarta. EGC. Hal 116-140.
46
Day, R.A., Underwood, A.L. 1992. Kromatografi Cairan dalam Analisis Kimia
Kuantitatif. Ed. 5. Jakarta. Erlangga. Hal 529-572.
Dewi Ernita Achyad, Ratu Rasyidah. 2000. Meniran.
http://www.asiamaya.com/jamu/isi/meniran_phyllanthusurinaria.htm 14 Maret 2006
Hostettmann, K. 1999. Strategy for the Biological and Chemical Evaluation of Plant Extracts.
http://www.iupac.org/symposia/proceedings/phuket97/hostettmann.html
Karnen Garna Baratawidjaja.2002. Reaksi Hipersensitivitas dalam Imunologi. Ed.5. Jakarta. Balai Penerbit FKUI. Hal 135-161.
Krasteva, I., Nikolova, I., Danchev, N., Nikolov, S. 2004. Phytochemical Analysis
of Ethyl Acetate Extract from Astragalus Corniculatus Bieb and Brain Antihypoxic Activity. http://pubwww.srce.hr/acphee/15104.pdf 26 Februari 2006
Lind, D.A., Mason, R.D., Marchal, W.G. 2000. Analysis of Variance In : Basic
Statistics. 3rd ed. McGraw-Hill. Singapore. Hal 333-340; 515.
Mariano. 1996. Atlas Histologi Manusia. Ed.6. Jakarta. EGC. Hal 52.
Rijke, E. 2005. Trace-level Determination of Flavonoids and Their Conjugates.
https://dare.ubvu.vu.nl/bitstream/1871/9048/1/Dissertation_E_de_Rijke.pdf 14 Maret 2006
Siti Boedina Kresno. 2003. Reaksi Hipersensitivitas dalam Imunologi : Diagnosis
dan Prosedur Laboratorium. Ed. 4. Jakarta. Balai Penerbit FKUI. Hal 136-160.
Stahl, E., 1985. Kromatografi Lapis Tipis dalam Analisis Obat Secara
Kromatografi dan Mikroskopi. Bandung. Penerbit ITB. Hal 3-32.
Summanen J.O. 1999. Phyllanthus in A chemical & Ethnopharmacological Study
on Phyllanthus emblica L (Euphorbiaceae).
http://ethesis.helsinki.fi/julkaisut/mat/farma/vk/summanen/3sivu.html 14 Maret 2006
Taylor, L. 2003. Technical Data Report for Chanca Piedra (Stone Breaker).
